Bir FOTOTROMBOTİK Tekniği sınırlı Kapsül Enfarktüs Modelleme

Bu tekniğin genel amacı, fototrombotik yöntem kullanarak kalıcı motor bozukluğun olduğu, sınırlanmış bir kapsüler enfarkt modeli oluşturmaktır. Kapsüler enfarktı oluşturmadan önce, motor korteksin ön kol bölgesine GFP eksprese eden bir adeno-ilişkili virüs verilerek internal kapsüldeki ön kol alanının belirlenmesi gerekir. İşleme, anestezi uygulanmış bir sıçanı stereotaksik çerçeveye yerleştirerek başlayın.

Ardından sıçanın kafasını tıraş edin ve saç derisini %70 alkol ve povidon iyot çözeltisi kullanarak sterilize edin. Operasyon sırasında oluşacak ağrıyı azaltmak için planlanan insizyon bölgesindeki saç derisinin altına %2 lidokain hidroklorür enjekte edin. Gözlerin kurumasını önlemek için oftalmik pomad uygulayın.

Ardından hayvanın üzerine steril bir örtü serin. Kafa derisinde iki santimetrelik bir orta hat insizyonu yaptıktan sonra, stereotaksik koordinatlara göre motor korteksin ön kol bölgesini belirlemek için stereotaksik kolu konumlandırın. Bu konumda bir giriş deliği açın.

İğneyi açılan deliğe getirin ve iğneyi dura boyunca bir milimetre aşağıya, motor korteksin içine doğru indirin. Bir mikrolitre virüsü yavaşça enjekte etmek için yüksek hassasiyetli bir mikropump kullanın. İğne kanalından geri akışı önlemek için iğneyi 10 dakika daha yerinde bırakın.

10 dakika geçtikten sonra iğneyi yavaşça geri çekin. Operasyon bölgesini salin irrigasyonu ile temizledikten sonra, yarayı 3-0 naylon sütür ile kapatın. Ardından sıçanı stereotaksik çerçeveden serbest bırakın ve izleme amacıyla bir iyileşme odasına transfer edin.

Ameliyat sonrası ağrı kontrolü için analjezik uygulayın. İki ila üç hafta sonra, sıçanı onaylanmış yöntemlere göre sakrifiye edin ve kriyokorunmuş beyni dilimleyin. GFP boyamasının ardından, internal kapsüldeki AAV-GFP transduksiyonlu aksonları floresan mikroskop ile gözlemleyin.

Transdükse edilmiş aksonların stereotaksik koordinatlarını doğru bir şekilde belirlemek için, floresan görüntüde görülen transdükse aksonların konumlarını sıçan beyin atlası ile karşılaştırın. Optik nöral ara yüzü hazırlamak için, öncelikle içinde stilet bulunan 27 gauge'lik bir spinal iğnenin yaklaşık dört santimetresini kesmek için bir kesme matkabı kullanın. Ardından, bir optik fiberin koruyucu kılıfının 10 santimetresini soyun.

Optik fiberin kılıfsız kısmını metal bir tüpün içine yerleştirin. Ardından tüpü fiberin etrafından sıkıştırın. Daha sonra, metal tüpün alt 1/2'sini bir pres yardımıyla iki kez sıkıştırın.

Metal tüp, optik fiber ile spinal iğnenin göbeği arasındaki boşluğu doldurur. Optik fiber üzerine ısı ile kürlenen epoksi uygulayın. Göbekteki boşluğa ek epoksi uygulayın.

Ardından optik fiberi spinal iğnenin içine yerleştirin. Stabil bir fiksasyon için epoksiyi 100 °C'de 20 dakika boyunca kürleyin. Kürleme işlemi tamamlandıktan sonra, spinal iğneden dışarı çıkan optik fiberi kesin ve ardından spinal iğnenin ucundaki optik fiberi parlatmak için elmas laplama levhaları kullanın.

Son olarak, ara bağlantı kablosunun FCPC konnektör kısmını yeşil lazer sisteminin kuplörüne bağlayın. Ardından, ışığın doğru şekilde yayıldığından emin olmak için dijital bir optik güç ve enerji ölçer kullanarak optik fiberin ucundaki ışık yoğunluğunu ölçün. Cerrahi işlem boyunca vücut sıcaklığını 37.5 °C seviyesinde tutmak için hayvanın gövdesinin altına bir ısıtıcı ped yerleştirin.

Önce sıçanı, daha önce olduğu gibi anesteziyle uyutun ve cerrahi işlem için hazırlayın. İki santimetrelik bir orta hat insizyonu yaptıktan sonra, Bregma ve Lambda aynı seviyeye gelene kadar burun klembinin yüksekliğini ayarlayın. Doğru hizalama, internal kapsülün doğru şekilde hedeflenmesi için kritik önem taşır.

Fototromboz bölgesini belirlemek için stereotaksik kolu konumlandırın. Ardından bu noktada iki milimetrelik bir delik açın. Sonrasında, ONI'nin optik fiber ucunu parlatıp temizleyin ve bükmeden stereotaksik çerçeveye sabitleyin.

Temiz ve sağlam olduğundan emin olmak için ONI'nin ucunu kontrol edin. Optik arayüzü sıçan beynindeki hedef bölgeye yerleştirmeden önce, optik fiberin ucundan lazer yoğunluğunu ölçün. Lazer yoğunluğunu optik fiber ucunda 3.5 milliwatt değerine ayarlayın.

Şimdi, protokolün ilk bölümünde belirlenen dorsoventral koordinatı kullanarak ONI'yi internal kapsülün hedef bölgesine indirin. Ardından, kuyruk veninden kilogram başına iki miligram Rose Bengal enjekte edin ve ardından bir dakikaya ayarlanmış bir geri sayım zamanlayıcısını başlatın. Bir dakika dolduğunda, enfarkt oluşturmak için 532 nano-metre yeşil lazeri 90 saniye boyunca çalıştırın.

Işınlamadan sonra, ONI'yi beyinden nazikçe çıkarın. Operasyon bölgesini temizledikten sonra, yarayı 3-0 naylon sütür ile kapatın. Ardından sıçanı stereotaksik çerçeveden çıkarın ve bir iyileşme odasına transfer edin.

Bu görüntü, fototrombrotik lezyon oluşturulmasından iki hafta sonra, iki milliwatt ile beş milliwatt arasındaki farklı lazer ışığı yoğunluklarına göre enfarkt lezyonlarının boyutunu göstermektedir. Oklar enfarkt lezyonunu belirtmektedir. Bu deneysel düzende optik ışık yoğunluğunun üç milliwatt ile dört milliwatt arasında olduğu kabul edilmektedir.

Sonraki iki görüntü, fototrombozdan üç hafta sonraki kapsüler enfarktın mikroskobik görünümünü göstermektedir. Sıçan beyninin bu koronal kesitinde, ok uçları talamustaki ve internal kapsüle kadar uzanan optik fiber içeren iğne yolunu göstermektedir. Bu ardışık boyanmış kesitler, internal kapsüldeki enfarkt lezyonunun boyutunu göstermektedir.

Oklar enfarkt lezyonunu göstermektedir.