Bir FOTOTROMBOTİK Tekniği sınırlı Kapsül Enfarktüs Modelleme
2 Haziran 2016
Bu el yazması kapsül enfarktüs bir modelleme tekniği anlatılmaktadır. Burada ön ameliyat hedef haritalama sonra ışık düşük yoğunluğu ile modifiye Fototrombotik tekniği kullanılmıştır. Bu tekniği kullanarak, biz kalıcı motorlu bozukluğu olan bir sınırlı kapsül infarkt modeli yarattı.
Bu tekniğin genel amacı, fototrombotik teknik kullanarak kalıcı bir motor bozukluğu olan sınırlı bir kapsüler enfarktüs modeli oluşturmaktır. Kapsül enfarktüsü oluşturmadan önce, motor korteksin ön ayak alanına GFP eksprese eden adeno ilişkili bir virüs ekleyerek iç kapsüldeki ön ayak alanını tanımlamak gerekir. Anestezi uygulanmış bir fareyi stereotaksik bir çerçeveye yerleştirerek başlayın.
Daha sonra farenin başını tıraş edin ve% 70 alkol ve povidon ve iyot çözeltisi kullanarak kafa derisini sterilize edin. Ameliyat içi ağrıyı azaltmak için, amaçlanan kafa derisi kesisi alanında kafa derisinin altına% 2 lidokain hidro klorür enjekte edin. Gözlerin kurumasını önlemek için oftalmik merhem sürün.
Ve hayvanın üzerine steril bir örtü yerleştirin. Kafa derisinde iki santimetrelik bir orta hat kesisi yaptıktan sonra, stereotaksik koordinatlara göre motor korteksin ön ayak alanını belirlemek için stereotaksik kolu konumlandırın. Bu konumda bir giriş deliği açın.
İğneyi delinmiş deliğe doğru hareket ettirin ve iğneyi duradan bir milimetre geçirin ve motor kortekse indirin. Bir mikro litre virüsü yavaşça enjekte etmek için yüksek hassasiyetli bir mikro pompa kullanın. İğne yolundan geri akışı önlemek için iğneyi 10 dakika daha yerinde bırakın.
10 dakika geçtikten sonra iğneyi yavaşça geri çekin. Ameliyat bölgesini tuzlu su ile temizledikten sonra yarayı 3-0 naylon sütür ile sabitleyin. Daha sonra fareyi stereotaksik çerçeveden serbest bırakın ve izleme için bir kurtarma odasına aktarın.
Ameliyat sonrası ağrı kontrolü için analjezik uygulayın. İki ila üç hafta sonra, fareyi onaylanmış yöntemlere göre kurban edin ve kriyo korumalı beyni bölümlere ayırın. GFP için boyamadan sonra, bir floresan mikroskobu ile iç kapsüldeki AAV-GFP transdüksiyonlu aksonları gözlemleyin.
Transdüksiyonlu aksonların stereotaksik koordinatlarını doğru bir şekilde belirlemek için floresan görüntüde görüldüğü gibi transdüksiyonlu aksonların konumlarını sıçan beyin atlası ile karşılaştırın. Optik nöral arayüzü hazırlamak için, önce içinde stile bulunan 27 gauge omurga iğnesinin yaklaşık dört santimetresini kesmek için bir kesme matkabı kullanın. Ardından, bir optik fiberin kılıfının 10 santimetresini soyun.
Optik fiberin kılıfsız parçasını metal bir tüpe yerleştirin. Ve tüpü fiberin etrafına sıkıştırın. Ardından, metal borunun alt 1 / 2'sini iki kez sıkıştırmak için bir pres kullanın.
Metal tüp, optik fiber ile omurilik iğnesinin göbeği arasındaki boşluğu doldurur. Optik fiber üzerine ısıyla sertleştirilebilir epoksi uygulayın. Göbekteki boş alana ek epoksi uygulayın.
Ve optik fiberi omurilik iğnesine yerleştirin. Stabil sabitleme için epoksiyi 100 santigrat derecede 20 dakika kürleyin. Sertleştikten sonra, omurga iğnesinden dışarı çıkan optik fiberi ayırın ve ardından omurilik iğnesinin ucundaki optik fiberi parlatmak için elmas alıştırma levhaları kullanın.
Son olarak, yama kablosunun FCPC konektör kısmını yeşil lazer sisteminin kuplörüne bağlayın. Ardından, doğru ışık emisyonunu sağlamak için optik fiberin ucundan gelen ışık yoğunluğunu ölçmek için bir dijital optik güç ve enerji ölçer kullanın. Ameliyat düşünülürse, vücut ısısını 37.5 santigrat derecede tutmak için hayvanın vücudunun altına bir ısı yastığı yerleştirin.
Fareyi daha önce olduğu gibi anestezi altına alarak ve ameliyata hazırlayarak başlayın. İki santimetrelik bir orta hat kesisi yaptıktan sonra, Bregma ve Lambda aynı seviyede hizalanana kadar burun klempinin yüksekliğini ayarlayın. Doğru hizalama, iç kapsülü doğru bir şekilde hedeflemek için kritik öneme sahiptir.
Fototromboz bölgesini bulmak için stereotaksik kolu konumlandırın. Ardından bu noktada iki milimetrelik bir delik açın. Ardından, ONI'nin fiber optik ucunu cilalayın ve temizleyin, ardından bükmeden stereotaksik çerçeveye sabitleyin.
Temiz ve sağlam olduğundan emin olmak için ONI'nin ucunu kontrol edin. Optik arayüzün sıçan beyninin hedef bölgesine yerleştirilmesinden önce optik fiberin ucundan gelen lazer yoğunluğunu ölçün. Optik fiberin ucunda lazer yoğunluğunu 3,5 miliwatt'a ayarlayın.
Şimdi, protokolün ilk bölümünde belirlenen dorsoventral koordinatı kullanarak ONI'yi iç kapsülün hedef alanına indirin. Ardından, kuyruk damarından kilogram Rose Bengal başına iki miligram enjekte edin ve ardından bir dakikaya ayarlanmış bir geri sayım sayacı başlatın. Dakika geçtiğinde, enfarktüsü oluşturmak için 532 nano metre yeşil lazeri 90 saniye boyunca açın.
Bir radyasyondan sonra, ONI'yi beyinden yavaşça çıkarın. Ameliyat bölgesini temizledikten sonra yarayı 3-0 naylon dikiş ile sabitleyin. Daha sonra fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın ve bir kurtarma odasına aktarın.
Bu görüntü, fototrombotik lezyondan iki hafta sonra iki miliwatt'tan beş miliwatt'a kadar değişen lazer ışığı yoğunluklarında enfarktüs lezyonlarının derecesini göstermektedir. Oklar enfarktüs lezyonunu gösterir. Bu deney ortamında optik ışık yoğunluğunun üç miliwatt ile dört miliwatt arasında olduğu düşünülmektedir.
Sonraki iki görüntü, fototrombozdan üç hafta sonra kapsül enfarktüsünün mikroskobik görünümünü göstermektedir. Sıçan beyninin bu koronal bölümünde, ok başları, talamusta ve iç kapsüle kadar optik fiberi içeren iğnenin yolunu gösterir. Bu seri iç içe boyanmış kesitler, iç kapsüldeki enfarktüs lezyonunun derecesini gösterir.
Oklar enfarktüs lezyonunu gösterir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu el yazması, değiştirilmiş bir fototrombotik teknik kullanarak kapsüler infarktın modellenmesi tekniğini açıklar. Bu yaklaşım, kalıcı motor bozukluğu ile sonuçlanan çevrelenmiş kapsüler infarkt modelinin oluşturulmasına izin verir.
Çalışmanın Önemli Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Nörobiyoloji
- Motor Bozukluk
Arka Plan
- Kapsüler infarktlar motor eksikliklerle ilişkilidir.
- Fototrombotik teknikler, lokalize beyin yaralanmalarını indüklemek için kullanılır.
- Motor bozukluk mekanizmalarını anlamak, terapötik stratejiler geliştirmek için kritik öneme sahiptir.
- Hedef haritalama, doğru model oluşturma için şarttır.
Çalışmanın Amacı
- Kapsüler infarktın güvenilir bir modelini geliştirmek.
- Kapsüler infarktların motor fonksiyon üzerindeki etkilerini araştırmak.
- Hassas hedefleme için değiştirilmiş bir fototrombotik teknik kullanmak.
Kullanılan Yöntemler
- GFP eksprese eden adeno-ilişkili virüs kullanılarak iç kapsülde ön uzuv alanının tanımlanması.
- Anestezi ve stereotaktik çerçeve yerleşimi ile ratın hazırlanması.
- Kafa derisi sterilizasyonu ve insizyon hazırlığı.
- Intraoperatif ağrıyı en aza indirmek için lidokain enjeksiyonu.
Ana Sonuçlar
- Çevrelenmiş kapsüler infarkt modelinin başarılı bir şekilde yaratılması.
- İnfarkt sonrası kalıcı motor bozukluğunun gösterilmesi.
- Değiştirilmiş fototrombotik tekniğin doğrulanması.
- Gelecek çalışmalar için tekrarlanabilir bir yöntemin kurulması.
Sonuçlar
- Değiştirilmiş fototrombotik teknik, kapsüler infarktları modellemeye etkilidir.
- Bu model, motor bozuklukları ve potansiyel müdahaleleri incelemek için kullanılabilir.
- Motor eksikliklerin altında yatan mekanizmaları araştırmak için daha fazla araştırma gereklidir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This photothrombotic technique enables precise modeling of white matter stroke by selectively targeting the internal capsule while sparing adjacent gray matter. The resulting circumscribed capsular infarct produces persistent motor deficits, providing a disease-relevant system for mechanistic de-risking of neurotherapeutic candidates. The model supports target validation and preclinical assessment of interventions aimed at white matter pathology, addressing a critical gap in stroke research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to white matter stroke pathophysiology.
- Operational Value: Provides a disease-relevant system for functional target validation in motor circuitry.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking infarct location to persistent motor impairment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable lesion volumes via optical intensity titration for dose-response assessment.
- Operational Value: Delivers highly replicable infarct models with consistent motor deficit readouts.
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening in neuroprotection or neurorepair.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Models white matter stroke at behavioral, circuit, and cellular levels for preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions based on lesion specificity and functional outcome correlation.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of infarct extent with motor deficit severity for predictive biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through preclinical efficacy testing, enabling iterative refinement of neurotherapeutic strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of white matter vulnerability and circuit-specific motor pathway disruption.
- Screening: Enables assay standardization through precise lesion control and quantitative motor deficit scoring.
- Analytics: Provides volumetric infarct measurements and behavioral readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity via persistent motor deficit phenotyping.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of neuroprotective and rehabilitative compounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target engagement through selective white matter infarct modeling.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via laser intensity calibration and stereotaxic targeting.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk by enabling early mechanistic de-risking of white matter pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on ability to mitigate persistent motor deficits in a validated model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral vector delivery, stereotaxic surgery, and optical neural interface fabrication.
- Depends on precision instrumentation including stereotaxic frames, microinjectors, and calibrated laser systems.
- Necessitates cross-team standardization for viral titer consistency, optical fiber preparation, and postoperative monitoring.
- Adaptation considerations include species-specific stereotaxic coordinates and optical properties of gray versus white matter.
- Practical limitations include surgical complexity and the need for postoperative validation via histology and behavior.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Identification of the Forelimb Area in the Internal Capsule Using AAV-GFP
3:09
Construction of the Optical Neural Interface
4:41
Photothrombotic Infarct of the Internal Capsule
6:44
Results: Microscopic Appearance of Capsular Infarct after Photothrombosis
7:38
Conclusion
