Manyetik Alan (GMF) ve Bitki Gelişimi: GMF İptalleri Etkileri üzerine Araştırılması

Bu prosedürün genel amacı, bir güç kaynağı ile kontrol edilen Helmholtz bobinlerini kullanarak yer manyetik alanının (YMA) ters çevrilmesini sağlamaktır. Sonuç olarak, YMA tersine çevrilmesinin bitkilerin morfolojisini ve gen ifadesini etkilediği gösterilmektedir. Bu yöntem, dünya manyetik alanının tersine dönmesinin bitki evrimi ve adaptasyonunda bir rol oynayıp oynamadığı gibi bitki evrimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, birçok tekrarla ve tamamı hassas bir şekilde kontrol edilen koşullar altında yetiştirilebilen basit bir model organizmada, zayıf manyetik alanların potansiyel biyolojik etkilerini test etmek için kullanılabilmesidir. Bu prosedürü, laboratuvarımdan Alberto Bocco ve onun rehberliğindeki bir öğrenci ile laboratuvarımda doktora öğrencisi olan Kiara aa ve grubumda doçent olan CIA Bertea gösterecekler.

Başlamak için, üç çift Helmholtz Bobini çiftine bağlı olan üç DC güç kaynağını ve probu üç eksenli bobinlerin içine yerleştirilmiş olan üç eksenli manyetometreyi açın. Bilgisayarı açın ve üç eksenli manyetometreden veri toplanmasını sağlayan manyetometre yazılımını başlatın. Güç kaynakları, kontrol amacıyla A-G-P-I-B bağlantısı üzerinden bir bilgisayara da bağlıdır.

Güç kaynaklarının voltajlarını, metin protokolünde açıklandığı şekilde, ters yönlü bir manyetik alan vektörü ile istenen manyetik alanı oluşturacak şekilde ayarlayın. Kalsiyum hipoklorit çözeltisi ile 25 ila 28 °C'de, sürekli çalkalama altında 10 ila 12 dakika boyunca işlemle sterilize edilmiş 1,5 mL'lik bir tüp yüzeyine Arabidopsis Aliana ekotipi Columbia, zero tohumlarını yerleştirin. Ardından tohumları iki kez %80 etanol ile durulayın ve ardından %100 etanol ile yıkayın.

Ve son olarak, steril distile su ile durulama yapın. Katılaşmadan önce, metin protokolünde açıklandığı şekilde bir litre Murrah Shiga ve SCOG modifiye besiyeri hazırlayın. Her kare Petri plağına 80 mililitre besiyeri dökün, böylece bir plakta 30 steril tohum olacaktır.

Ardından plakaları balmumu benzeri bir filmle mühürleyin. Çimlenmeyi güçlendirmek ve senkronize etmek için plakaları iki gün boyunca dört derece Celsius'ta, karanlıkta ve yatay konumda vernalize edin. Vernalizasyonun ardından, lambaların kırmızı bileşenini azaltmak için spot ışığını mavi bir jelatin filmle kaplayarak sodyum buharlı lambaları hazırlayın.

Petri plaklarını normal veya tersine çevrilmiş GMF'ye maruz bırakmak için hazırlayın. Tohumları, iklim kontrollü bir ortamda 22 °C'de dikey konumda maruz bırakın. Paralel deneyleri hem triaksiyel bobinlerin dışında hem de triaksiyel bobinlerin içinde gerçekleştirin.

Sekiz saat karanlık ve 16 saat ışıkten oluşan bir fotoperiyot programı altında. Maruziyetten sonra, kök uzunluğunu ve yaprak alanlarını hesaplamak için Petri kaplarının fotoğraflarını çekin. İlk olarak, Petri plağının kenarını ölçün.

Ardından, Petri kabının görüntüsünü ImageJ yazılımında açın ve kabın kenarını tam olarak kesecek bir çizgi çizmek için düz çizgi seçeneğini kullanın. Analyze menüsünden set scale seçeneğini belirleyin ve bilinen mesafe kutusuna gerçek mesafeyi girin. Daha sonra uzunluk birimini girin.

Ve son olarak, ayarları kök uzunluğuyla ilgili tüm ölçümler için geçerli kılmak amacıyla genel seçeneğe tıklayın. Serbest çizim aracını kullanarak kökün şeklini dikkatlice takip edin. Analiz menüsündeki ölçüm seçeneğini kullanarak uzunluğu ölçün.

Resimdeki tüm kökleri ölçmeye devam edin ve dosyayı daha sonraki istatistiksel analizler için kaydedin. Görüntü menüsünden yaprak alanı için önce "adjust" seçeneğini, ardından "color threshold" seçeneğini kullanın, tekil yaprağı seçin ve analiz menüsünden "analyze particles" seçeneğini belirleyerek istatistiksel analizler için tekil ölçümleri kaydedin. 30 sürgün ve 30 kökü ayrı ayrı toplayıp hemen sıvı azot içinde dondurun.

Ardından, metin protokolünde açıklandığı şekilde toplam RNA'yı izole etmeden önce bir havan ve eliyle sıvı azot içinde öğütün; tüm deneyleri, iç yükleme standardı olarak ROX içeren cyber green one ile bir gerçek zamanlı sistemde gerçekleştirin ve reaksiyonu 25 microliter karışımla yürütün. Metin protokolünde listelenen primerleri kullanarak, genomik DNA kontaminasyonunu izlemek için ters transkripsiyon yapılmamış kontrollerin yanı sıra kalıp içermeyen kontroller ekleyin. Her denatürasyon ve uzama aşamasını takiben floresansı okuyun.

İki büyüteç, dizlenme ve disosiyasyon eğrileri dahil olmak üzere toplanan verileri temsil eder. Analiz ve kurulum ekranına gidin ve deneyin disosiyasyon segmenti sırasında toplanan veri setinin seçili olduğundan emin olun. Tüm çalışmaların analizi için, termal profile disosiyasyon segmentini dahil ederek 55 ile 95 derece Celsius arasında bir erime eğrisi analizi gerçekleştirin.

Disosiyasyon profilini görüntülemek için sonuçlar sekmesinden erişilen disosiyasyon eğrisi ekranını kullanın. Tüm amplifikasyon grafiklerini gerçek zamanlı PCR cihazı yazılımı ile analiz edin.

CT değerlerini elde etmek için, bağıl RNA seviyelerini en uygun housekeeping genlerinin seviyeleriyle kalibre edin ve normalize edin. Sonuçlar sekmesi üzerinden amplifikasyon grafikleri ekranına erişin. Analiz, seçim ve kurulum ekranını kullanarak verilerin analiz edileceği ramp veya platoyu seçin.

Ardından, komut panelindeki floresans menüsünden baz çizgisi düzeltilmiş normalize edilmiş floresansı seçin. Örneklenen kuyucukların CT değerlerini görüntülemek için sonuçlar sekmesi üzerinden plaka örnek değer ekranına erişin.

Real-time PCR sonuçlarını normalize etmek için dört farklı referans gen kullanın. Analiz yazılımını kullanarak en üst sırada yer alan geni seçin ve normalizasyon için en stabil geni kullanın. Giriş verilerini, ilk sütunun gen isimlerini ve ilk satırın örnek isimlerini içerdiği bir Excel sayfasında kısaca düzenleyin.

Ardından menü çubuğundan analiz yazılımını seçin. Giriş verilerini seçmek için iletişim kutusunu kullanın. Daha sonra alan örnek isimleri, gen isimleri ve yalnızca basit çıktı seçeneklerini işaretleyin.

Analizi gerçekleştirmek için "go" düğmesine tıklayın; en yüksek sıralamaya sahip geni, en stabil eksprese edilen aday gen olarak seçin. 10 günlük maruziyetin ardından, kontrol bitkileri, 10 günlük maruziyet sonrası tersine çevrilmiş GMF koşullarına maruz kalan bitkilere kıyasla anlamlı derecede daha büyük kök uzunluğu ve daha geniş yaprakçıklar göstermektedir. GMF'nin tersine çevrilmesinin etkisi; crucifer in three copper transport protein one ve redox responsive transcription factor one dahil olmak üzere, test edilen tüm genlerin gen ekspresyonunda meydana gelen drastik bir değişiklikti; çubuklar standart hatayı, yıldızlar ise tersine çevrilmiş ve normal GMF koşullarına maruz kalan bitkiler arasındaki anlamlı farklılıkları belirtmektedir.

GMF tersine çevrilmesinin etkisi, sürgün gen ekspresyonunda anlamlı bir değişikliğe yol açmamıştır. Ancak, yetiştirilen bitkilerin kök gen ekspresyonunda ciddi bir aşağı düzenleme (downregulation) gözlemlenmiştir. Ters GMF koşulları altında bu genler arasında thal, bir peroksidaz, bir peroksidaz, bir demir süperoksit dismutaz, bir N-A-D-P-H, respiratuar patlama oksidaz proteini ve katalaz üç yer almaktadır.

Bu teknik bir kez kavrandığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde gereken deneye bağlı olarak dakikalar içinde veya günlerce sürecek şekilde gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, jeomanyetik alanı nasıl tersine çevireceğiniz veya değiştireceğiniz ve maruz kalan bitkiler üzerinde nasıl morfolojik ve genetik çalışmalar yapacağınız konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, kask bobinleriyle çevrili bölgeden tüm manyetik alan kaynaklarının uzaklaştırılması önemlidir.

Kask bobinlerinin ve bunların jeneratörlerinin ısı veya titreşim üretmemesi önemlidir. Araştırmacı, final verileri kaydedilene kadar manyetik alan maruziyet durumu hakkında körlenmiş olmalıdır. Bu teknik, manyetik resepsiyon alanındaki araştırmacıların; manyetik alanların bitki evrimi, hayvan davranışı ve navigasyonu ile insan hücre hatları üzerindeki etkilerini incelemesine olanak sağlamıştır.

Gelecekte, manyetik alan değişikliğinin uzay koşullarında bitki büyümesi üzerindeki etkisini değerlendirmek amacıyla mikro yerçekiminde benzer çalışmalar yapmayı umuyoruz. Zayıf manyetik alanlar üreten sistemlerle çalışmanın tehlikeli olduğu düşünülmemektedir. Bununla birlikte, normal önlemleri almalı ve Helmholtz bobin çiftleri için güç kaynakları gibi ekipmanlarla çalışmadan önce yetkin bir elektrikçinin tavsiyesine başvurmalısınız.