Glioblastoma'nın için bir Immünkompetan Hayvan Modeli Biyoparlaklık Görüntüleme

Bu protokolün genel amacı, GL261 murin tümör hücrelerinin lusiferaz modifikasyonunun faydasını doğrulamak için in vivo biyolüminesans görüntüleme kullanarak tümör hücresi ve intrakraniyal tümör büyümesini izlemek için uygun teknikleri göstermektir. Bu yöntem, tümör immünolojisi ve immünoterapötik yaklaşım çalışmasındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Stres modifikasyonunun GL261 hücre proliferasyonunu etkileyip etkilemediği ve in vivo olarak büyüyüp büyümediği gibi.

Bu tekniğin temel avantajı, GL261 tümör hücrelerinin lusiferaz modifikasyonunun, büyümelerinin ve yerinde tedaviye yanıtlarının noninvaziv olarak izlenmesini kolaylaştırmasıdır. GL261 lusiferaz hücre kültürü bir T75 şişesinde %70 birleşmeye ulaştığında, hücreleri tripsinizasyon ile hasat edin. Hücreleri sayın ve ardından bunları kademeli yoğunluklarda 24 oyuklu bir plakaya aktarın.

Bir hücre kültürü inkübatöründe üç saat geçirdikten sonra, biyolüminesans görüntüleme yazılımını açın ve görüntüleme sistemini başlatın. Fotoğraf makinesi eksi 90 santigrat dereceye soğuduğunda, görüntüleme yazılımını 10 saniyelik pozlama süresi ve Orta Gruplama ile Lüminesan olarak ayarlayın. Daha sonra hücreleri, oda sıcaklığında bir dakika boyunca oyuk başına 25 mikrolitre lusiferin içinde inkübe edin ve plakayı görüntüleme istasyonuna yerleştirin.

Görüntülemeyi başlatmak için Al'ı seçin. Bir görüntü başarıyla elde edildiğinde, bir görüntü penceresi ve araç paleti görünecektir. İlgi Bölgeleri Araçları'na tıklayın ve yarık simgesinden 6'ya 4'ü seçin.

Sinyal alanını 6'ya 4 yarıkla kapatın ve Ölçümler sekmesindeki kalem simgesini seçin. Santimetre kare başına steradyan başına saniyede foton birimi olarak ilgi alanı ölçümleri tablosuna sahip bir pencere görünecektir. Bir in vitro proliferasyon testi yapmak için, hücre kültürlerini% 70 birleşmeye ulaştıklarında gösterildiği gibi hasat edin.

Ve tümör hücrelerini, oyuk başına 80 mikrolitre RPMI ortamı başına 1.5 kez 10 ila 3. hücrelerde 96 oyuklu bir plakanın her biri 20 oyuğa yerleştirmek için çok kanallı bir pipet kullanın. Hücre kültürlerinin buharlaşmasını sınırlamak için, çevredeki boş kuyuları 100 mikrolitre taze RPMI ortamı ile doldurun. Daha sonra, hücresel proliferasyonu değerlendirmek için, her bir hücre oyuğuna 20 mikrolitre MTS reaktifi ekleyin.

Ve plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Üç saat sonra, 490 nanometrede absorbansı ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanın. Absorbans değerlerini normalleştirmek için, her günkü değerleri birinci günde elde edilen karşılık gelen okumalara bölün.

İmplantasyon gününde,% 70 birleşik tümör hücresi kültüründen kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS'de mikrolitre başına 10 ila 5. hücreleri bir kez askıya alın. Daha sonra, ayak parmağınızı sıkıştırarak uygun sedasyon seviyesini onayladıktan sonra, her deney hayvanının başının üst kısmını tıraş edin. Pamuklu bir uç uygulaması kullanarak, her kafatasını %2 klorheksidin ile temizleyin.

Ardından her farenin gözlerine kayganlaştırıcı sürün. Şimdi, ilk hayvanın parietal oksipital kemiği üzerinde yaklaşık 1 santimetre uzunluğunda sagital bir kesi yapmak için steril bir neşter kullanın. Ve kafatasının yüzeyini tekrar% 3 hidrojen peroksit ile temizleyin ve görünen bregmaya dikkat edin.

Daha sonra, steril 25 gauge bir iğne kullanarak, kafatasında bregmanın sağında ve koronal sütürün hemen arkasında 3 milimetrelik bir delik açın. Uygun enjeksiyon derinliğini sağlamak için, 20 mikrolitrelik bir pipet ucunun sivri ucundan 3 milimetre kesmek için makas kullanın ve iğnenin 3 milimetresi ucun ucundan dışarı çıkana kadar 26 guage Hamilton şırıngasını uca kaydırın. İğneyi kafatasındaki deliğe sokun ve bir dakikalık bir süre boyunca tümör hücrelerinin 3 çarpı 10'a 3 mikrolitre yavaşça 5'e

İğneyi bir dakika daha yerinde bırakın ve ardından yavaşça geri çekin. Açıkta kalan kemiği% 3 hidrojen peroksit ve% 2 klorheksidin çözeltisi ile değiştirin. Ardından, kafatasını taze bir pamuk uçlu aplikatör ile kuruttuktan sonra, 3 milimetrelik bir steril kemik mumu parçası kesin ve balmumu bir pamuk uçlu aplikatörün çıplak ucuna takın.

Enjeksiyon bölgesini kemik mumu ile örtün. Ardından, kafa derisinin her iki tarafını balmumunun üzerine çekmek için forseps kullanın. Yarayı kapattıktan ve uygun postoperatif analjezi uygulandıktan sonra, her deney hayvanı için prosedürü tekrarlayın.

İntrakraniyal tümörün büyümesini görüntülemek için, önce görüntüleme istasyonunu az önce gösterildiği gibi başlatın. Ardından, kuyruk tutamıyla uygun sedasyon seviyesini onayladıktan sonra, görüntüleme sistemi parametrelerini gösterildiği gibi ayarlayın. Pozlama süresi için Otomatik'in seçilmesi dışında.

Görüntüleme sistemi hazır olduğunda, fareleri görüntüleme istasyonuna yerleştirin ve lusiferaz ifadesinin görüntülerini elde etmek için Al'ı seçin. Görüntü başarılı bir şekilde alındığında, araç paletinden İlgi Bölgesi Aracı'nı ve daire simgesinden Otomatik'i seçin. İlgilenilen bölgeleri tanımlamak için sinyal alanlarını daire içine alın ve ardından bölgelerin santimetre kare başına steradyan başına saniyede foton birimleri olarak ölçümlerini elde edin.

Son olarak, fareleri görüntüleme odasından çıkarın ve tümör taşıyan hayvanları tamamen iyileşene kadar izleyin. Luciferase içeren lentivirüs ile enfekte olmuş GL261 hücrelerinin in vitro biyolüminesans görüntülemesi, pozitif kontrol U87MG lusiferaz eksprese eden insan glioblastoma hücre hattı tarafından eksprese edilen lusiferaz seviyelerine benzer sağlam bir lusiferaz ekspresyonu sergiler. Beklendiği gibi, enfekte olmamış GL261 hücreleri arka plan lusiferaz ifadesi göstermez.

İntrakraniyal implantasyondan önce, GL261 lusiferaz ve GL261 hücre hatlarının in vitro büyüme hızlarında bir fark gözlenmemiştir. İntrakraniyal tümör enjekte edilen hayvanların seri biyolüminesans görüntülemesinin gösterdiği gibi, GL261 lusiferaz eksprese eden tümör hücreleri, gözlemlenen deneysel tümör taşıyan gruplar arasında hayatta kalma oranlarında önemli bir fark olmaksızın in vivo olarak hızlı ve tutarlı bir büyüme oranı sergiler. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse saatte 25 fareye kadar görüntü almak için kullanılabilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, biyolüminesans görüntülemenin, GL261 tümör büyümesini in vivo olarak izleyerek yararlı olma yeteneğini geliştirir ve immünokompetan fare modellerinde immünoterapötik yanıtların araştırılmasını ilerletir.