Görüntüleme İmmünoloji Synapse Dynamics için bir Endotel Hücre Modeli Düzlemsel

Bu tekniğin genel amacı, temel antijenik sinyalleme süreçlerini araştırmak için endotel hücrelerini yeni bir düzlemsel antijen sunan hücre modeli türü olarak kullanmaktır. Bu yöntem, hücre altı ve moleküler yeniden şekillenme dinamiklerinin immünolojik sinaps içinde mekansal ve zamansal olarak nasıl koordine edildiği gibi adaptif bağışıklık alanındaki temel soruları ele almamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, endotel formlarının neredeyse düzlemsel bir PC yüzeyinin olmasıdır.

Bu, fizyolojik olarak karmaşık ve şekillendirilebilir bir hücre yüzeyi bağlamında optimum uzay-zamansal çözünürlükle görüntülemeye izin verir. Bu yöntem CD dört pozitif TH, bir efektör hafıza hücresi aktivasyonuna odaklansa da, çeşitli T hücresi tipleri, antijen ve sinyalleme süreçlerinin incelenmesi için de uygulanabilir. Bugün, Chris ve ben size, birincil insan akciğeri veya dermal mikrovasküler endotel hücrelerini membran YFP ve çözünür DS kırmızısı ile NU nükleer sevgisi yoluyla kodlayarak başlatarak ve transfekte edilmiş hücreleri canlı hücre görüntüleme kültürü plakalarına plakalayarak ikinci Begin'i gerçekleştirmenizi göstereceğiz.

Ertesi gün, hücre kültürü ortamını, endotel hücreleri üzerinde M MHC iki ekspresyonunu indüklemek için interferon gama ile takviye edilmiş taze ortam ile değiştirin, ardından hücrelerin mililitre TNF alfa başına 20 nanogram ile uyarılması 24 saat sonra üçüncü günde 30 ila 60 dakika. Deneye başlamadan önce, endotelyumu mililitre başına bir mikrogram, bakteriyel süperantijenler stafilokokal enterotoksin B ve toksik şok sendromu toksinlerinin her biri 37 santigrat derecede bir tane ile inkübe edin. İnkübasyon sırasında, ilgilenilen lenfosit kültüründen canlı hücrelerin sayısını sayın ve hücrelerin iki kez 10'u altıda birine 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Daha sonra, hücreleri döndürün ve peleti, hücre kümesi kalmayacak şekilde iki mililitre taze hazırlanmış tampon A içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra T hücresi örneğine iki mikromolar RA iki ekleyin, tüpü kapatın ve hemen homojen hale getirin. Boyayı hücre süspansiyonu boyunca dağıtın.

37 santigrat derecede 30 dakikalık bir inkübasyondan sonra, etiketli lenfositleri aşağı doğru döndürün ve hücreleri canlı görüntüye 20 ila 40 mikrolitre taze tampon A'da nazikçe ama iyice yeniden süspanse edin, hücreler mikroskop sistemini açar ve uygun görüntü yakalama yazılımını açar. Otomatik çok kanallı zaman atlamalı görüntüleme için uygun parametrelerin yanı sıra çekim aralığını 10 ila 30 saniye ve toplam süre yaklaşık 20 ila 60 dakika arasında ayarlayın. Ardından, hedefe taze yağ ekleyin.

Isıtma aşaması adaptörüne 0.5 mililitre tampon A içeren bir mikroskop kabı monte edin ve daha önce 37 santigrat dereceye ayarlanmış adaptörü hemen açın. İki ila üç dakikalık dengelemeden sonra, dinlenme RA iki yüklü lenfositi monte edilmiş mikroskop kabı haznesine eklemek için 20 mikrolitrelik bir pipet kullanın ve parlak alan görüntülemesini açın. Göz merceklerine giden ışık yolunu seçin ve objektifi mikroskop çanağının alt kısmıyla temas ettirmek için rota odak düğmesini kullanın.

Ardından, çanağın dibine yerleştirilmiş T hücrelerini bulmak için göz merceğini ve ince odak düğmesini kullanın ve uygun hücreler yerleştirildiğinde en az 10 hücre içeren bir alanı seçmek için XY stage kontrollerini kullanın. Parlak alandan floresan ışık kaynağına ve IP görüntülemeden CCD kameraya geçin. Çekim parametrelerini optimize edin ve ardından dinlenme Fira 2 3 40 ve FIRA 2 3 80 görüntülerini alın.

Başarılı sonuçlar elde etmenin en önemli adımlarından biri, floresan elde etme parametrelerinin dikkatli bir şekilde optimize edilmesi, yeterli sinyalin toplanmasını ve ikinci fira durumunda, taban çizgisi 3 43 80 oranının bire yakın olmasını sağlamaktır. FIRA iki maruz kalma süresi ayarlandığında, T hücrelerinin kabını tek kullanımlık bir transfer pipeti kullanarak endotel hücrelerinin bir mikroskop kabıyla değiştirin, ortamı hızla çıkarın ve hücreleri bir mililitre ön ısıtma tamponu A ile bir kez durulayın, ardından yıkamayı 0.5 mililitre taze tampon A ile değiştirin. Ardından, membran YFP ve DS RED için edinme parametrelerini fira two için gösterildiği gibi ayarlayın.

Her kanaldaki ortalama floresan sinyal yoğunluğunun, dedektörün dinamik aralığının %25 ila %75'i arasında olmasına dikkat edin. Canlı hücre görüntüleme deneyini gerçekleştirmeden önce, otomatik yazılımla bir temel oluşturmak için tek başına endotel hücrelerinin birkaç aralıklı görüntüsünü yakalayın. Ardından, küçük bir hacmin ucunu objektifin merkezine yakın bir ortama sokun.

Mikroskop çanağı görüntüleme alanının merkezine beş mikrolitre konsantre fira, iki yüklü lenfosit yavaşça dağıtın. Lenfositler yerleştikçe, T hücresi endotel hücre arayüzlerinin odak düzleminde tutulduğundan emin olmak için odakta ince ayarlamalar yapın. 40 ve 63 x hedeflerle, alan başına 10 ila 20 hücre en uygunudur.

İstenen gözlem aralığından sonra, görüntülemeye devam edin ve maksimum kalsiyum akısı sferasını indüklemek için CIN'i hemen doğrudan mikroskop kabına iki mikromolar nihai konsantrasyona pipetleyin. İki sinyal. Hücrelere tedaviler uygularken, immün sinaps yeniden şekillenmesinin optimal çözünürlüğünü sağlamak için endotelin apikal membran YFP etiketli yüzeyine keskin bir şekilde odaklanmaya özen gösterin.

Endotelyal süperantijen üzerinde süperantijen yokluğunda, spesifik CD, dört pozitif TH, bir lenfosit hızla yayılır, polarize olur ve endotel hücreleri üzerinde lateral olarak göç eder. Bu işlem sırasında, lenfositler, süperantijen varlığındaki ayak izlerine benzer membran YFP floresan halkaları olarak belirgin olan endotel yüzeyine kısa ömürlü çıkıntılar veya ILP'ler uzatır, ILP'ler tarafından yönlendirilen yakın hücreden hücreye temaslar, immünolojik sinaps içinde stabilize ILP'lerin birikmesine yol açan bir kalsiyum akışının başlatılması ile ilişkilidir. Bu tür ILP dizileri, sürekli kalsiyum sinyalizasyonuna bağlanır.

T hücresi endotel hücre etkileşimleri sırasında oluşan membran floresan halkaları, bu halkaların yer değiştirmiş ve dışlanmış sitoplazma bölgeleri ile mekansal ve kinetik olarak ilişkili olduğunun gösterilmesiyle doğrulandığı gibi, endotel hücrelerinde ayrı istila noktalarına neden olan T hücresi çıkıntılarına karşılık gelir. Süperantijen yapışması ve antijenik sinyalleme ile ilişkili sinyal molekülleri varlığında endotel ve T hücrelerinin birlikte inkübasyonundan birkaç dakika sonra, immünolojik sinapsın patates izleri ve ILP'leri içinde coen zenginleştirilir. Gerçekten de, T hücresi endotelyal immünolojik sinaps, antijen tanıma moleküler mekanizmasının zenginleştirildiği antijen sunan hücre yüzeyine uzanan T hücresi ILP'leri tarafından noktalanan gizli bir üç boyutlu mimari sergiler.

Bu yaklaşımla, mevcut bir PC modelindeki temel engellerin üstesinden gelinebilir, aksi takdirde tespit edilemeyen 3D hücre altı mimarisinin gözlemlenmesine ve fizyolojik T-hücresi bir PC arayüzlerinin hızlı bir şekilde yeniden modellenmesine izin verilebilir. Bu, antijenik sinyalizasyon süreçlerinin yeni düzeyde anlaşılması için potansiyel sunar.