2.5: Gelişim Çalışmaları için Eksplant Kültürü

Eksplant kültürü, tüm doku ve organların bir fetüs veya embriyodan çıkarıldığı veya "eksplante edildiği" ve vücuttan kültürlendiği veya "ex vivo" olduğu bir tekniktir. Bu yöntemler, organogenez adı verilen bir süreç olan organ ve doku büyümesinin doğrudan gözlemlenmesini sağlayarak gelişim sürecini anlamamıza yardımcı olmak için benzersiz bir pencere sağlar.

Bu video, eksplant kültürünün temel ilkelerini inceleyecek, prosedürün temel adımlarını ana hatlarıyla belirleyecek, tipik manipülasyonları tartışacak ve bu tekniğin gelişimsel çalışmalarda özel uygulamalarını sağlayacaktır.

Eksplantların nasıl kültürleneceğini açıklamadan önce, bu tekniğin arkasındaki bazı ilkeleri gözden geçirelim.

Eksplant kültürü, çok çeşitli organizmalardan çeşitli embriyonik dokulara uygulanabilir. Bu teknik, organ gelişiminin incelenmesi için idealdir, çünkü morfogenez olarak bilinen yapısal değişiklikler, zamanın bir fonksiyonu olarak doğrudan gözlemlenebilir. Ek olarak, dokular gelişim üzerindeki etkilerini belirlemek için deneysel moleküllerle tedavi edilebilir. Ayrıca, eksplant kültürü, gen ekspresyonunu ve floresan mikroskobunu değiştirmek için moleküler araçlarla birleştirildiğinde, hücre ve doku farklılaşması sorularını ele almak için güçlü bir araç haline gelir.

Daha sonra, memeli dokularının eksplant kültürü için bir protokolü gözden geçirelim.

Prosedürü başlatmak için, embriyolar ötenazi yapılmış bir hamile kemirgenden çıkarılır. Çevreleyen zarların çıkarılmasından sonra embriyo izole edilir. İlgilenilen dokular veya organlar daha sonra ekstrakte edilen embriyodan izole edilir ve büyüme için plakalara aktarılır. Antibiyotik içeren besiyerleri eklenir ve plakalar 37 ° C'lik bir inkübatörde büyütülür.

Eksplant kültürleri oluşturulduktan sonra, çeşitli manipülasyon türleri gerçekleştirilebilir.

Örneğin, ekilen doku, ilgilenilen bir genin belirli bir gelişimsel süreç üzerindeki rolünü test etmek için genetik olarak manipüle edilebilir. Bu, enjekte edilen DNA'yı yakındaki hücrelere sürmek için bir elektrik alanının kullanıldığı elektroporasyon gibi teknikler kullanılarak dokuya genetik materyal sokularak başarılabilir.

Eksplantlar, büyüme faktörleri gibi sinyal moleküllerinin organogenezde oynadığı rolleri test etmek için de sıklıkla kullanılır. İn vitro olarak kültürlenen doku, bu tür çalışmalar için özellikle yararlıdır, çünkü bileşikle muamele etmek, onu kültür ortamına eklemek kadar basittir. Bununla birlikte, deneysel bileşiklere batırılmış küçük boncuklar, kimyasal tedaviye daha kontrollü bir yaklaşım için dokuya da implante edilebilir.

Yaklaşımdan bağımsız olarak, eksplant tekniğinin önemli bir avantajı, deneysel manipülasyonların etkilerinin ışık veya floresan mikroskobu kullanılarak gerçek zamanlı olarak kolayca görselleştirilebilmesidir.

Şimdi, ex vivo kültürün bazı özel uygulamalarına bakalım.

İlk olarak, eksplantlar, doku gelişiminin doğrudan görselleştirilebildiği bir model sistemi temsil eder. Örneğin, bu araştırmacılar gelişmekte olan pankreası embriyonik farelerden çıkardılar ve daha iyi görüntüleme için cam tabanlı tabaklar üzerinde kültürlediler.

Dokunun gelişimi ışık mikroskobu ile gözlemlenebilir, ancak floresan belirteçleri ifade eden transgenik dokuların kullanılması, tübül tomurcuklanması gibi gelişimsel süreçlerin daha ayrıntılı bir görünümünü sağlar. Ekilen doku, araştırmacıların burada mavi ve yeşil renkte gösterilen insülin üreten hücreler gibi belirli hücre tiplerinin gelişimini izlemelerine olanak tanıyan immün boyamaya da tabi tutulabilir.

Eksplant kültürlerinin bir başka uygulaması, büyüme faktörleri gibi spesifik moleküllerin organogenezdeki rolünü deşifre etmeye yardımcı olmaktır.

Burada, E12.5 fare embriyolarından diseke edilen fetal akciğer eksplantları, 48 saate kadar bir büyüme faktörünün varlığında veya yokluğunda büyütüldü. Sonuçlar, bu büyüme faktörünün fetal akciğerde hava yolu oluşumunu engellediğini göstermektedir.

Son olarak, embriyogenezin ilk aşamalarında gen ekspresyonunu kontrol eden mekanizmaları belirlemek için erken embriyolardan elde edilen eksplantlar kullanılabilir.

Bu araştırmacılar, kurbağa embriyolarının 16 hücreli aşamasından iki farklı hücre tipi çıkardılar: dorsal yapılar oluşturmaya yönelik olanlar ve ventral yapılara katkıda bulunacak olanlar. Eksplantların, dorsal dokuya özgü bir genin ekspresyon modelini karakterize etmek için boyamadan yaklaşık bir gün önce gelişmesine izin verildi.

Bu genin ekspresyonu sadece dorsal bölgeden gelen eksplantlarda gözlendiğinden, gen ekspresyon programlarının, gelişimin ilerleyen aşamalarında meydana gelen hücre-hücre etkileşimleri tarafından yönlendirilmek yerine, bu embriyonik hücrelerde kodlandığı sonucuna varılmıştır.

Şimdi eksplant kültür sistemlerini inceledik ve gelişimsel çalışmalarda nasıl kullanılabileceğini gözlemledik. Bu teknik, hayvan gelişiminin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamamızı kolaylaştıran güçlü bir araçtır. İzlediğiniz için teşekkürler!