Yüksek Verimli Danio rerio Enerji Harcaması Deneyi

Bu yüksek verimli resazurin bazlı florometrik testin genel amacı, genetik veya farmakolojik manipülasyonların metabolik hızın bir ölçüsü olan NADH2 üretimi üzerindeki etkisini izlemektir. Bu yöntem, belirli bir ilacın veya genin metabolik hız üzerindeki etkisi gibi obezite alanındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Ek olarak, bu test, tüm bir hayvan sisteminde potansiyel ilaç-ilaç veya ilaç-gen etkileşimlerini taramak için uygulanabilir.

Bu tahlilin oksijen tüketimi tahlillerine göre ana avantajı, kullanıcının metabolik hızdaki küçük farklılıkları tespit etmesine olanak tanıyan yüksek verim ve zaman içinde sinyal birikimidir. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olan Caroline Foy olacak. Metin protokolüne göre 60X E3 besiyeri stok çözeltisi hazırladıktan sonra, 16,5 mililitre stok ve bir litre çift damıtılmış suyu seyrelterek 1X E3 besiyerini hazırlayın.

Sonra 100 mikrolitre% 1 metilen mavisi ekleyin. Yumurta ve balık transferi için alev cilalı tek kullanımlık pipet yapmak için, 0,25 mililitrelik derecelendirmede dereceli tek kullanımlık bir transfer pipetini kesmek için makas kullanın. Ardından, pürüzlü kenarları çıkarmak için, kesilen ucu alevle parlatmak için bir Bunsen brülörü kullanın.

Zebra balığı geçişlerini kurduktan ve yumurtaları topladıktan sonra, yumurtaların tabağın dibine çökmesine izin verin ve suyu dökün. Kalan suyu çıkarmak için ince uçlu tek kullanımlık bir transfer pipeti kullanın. Ardından E3 ortamını geri ekleyin.

Embriyonik balığı döllenmeden dört gün sonrasına veya DPF'ye kadar 28,5 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Günde iki kez, döllenmemiş yumurtaları veya ölü embriyoları çıkarmak için alevle parlatılmış, derecelendirilmiş tek kullanımlık bir transfer pipeti kullanın. Sonra her gün bir kez E3 ortamını dökün.

Kalan ortamı çıkarmak için ince uçlu bir transfer pipeti kullanın ve 28,5 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış taze E3 ile değiştirin. Enerji harcaması tahlilini gerçekleştirmek için, bu tabloyu takip ederek tahlil çözeltisini hazırlayın. Çözeltiyi filtrelemek, sterilize etmek için 0.22 mikrometrelik bir filtre kullanın ve test için bir su banyosunda 28.5 santigrat dereceye kadar ısıtın.

Bir petri kabında, tüm canlı zebra balığı embriyolarını debriyajdan birleştirin. 75 mililitre E3 ortamını filtreyle sterilize ettikten sonra, E3 ortamının mümkün olduğunca çoğunu petri kabından çıkarmak için ince uçlu tek kullanımlık bir transfer pipeti kullanın. 20 mililitre steril E3 ekleyin. Ardından steril E3'ü iki kez daha çıkarın ve değiştirin.

Daha sonra, alevle parlatılmış dereceli plastik tek kullanımlık transfer pipeti kullanarak, tek tek embriyonik balıkları 96 oyuklu bir plakanın kuyularına aktarın. Bir seferde plakanın bir sütunu ile çalışarak, E3 ortamını ilk sütunun sekiz kuyusundan çıkarın ve embriyolara transfer pipeti ile dokunmamaya dikkat edin. Daha sonra her oyuğa 300 mikrolitre tahlil çözeltisi ekleyin.

Plakanın 12 sütununun tümü ile tekrarlayın. Bir ilaç tedavisini dahil etmek için, istenen bileşiğin 100X'lik bir çözeltisini hazırladıktan sonra, tedavi kuyucuklarının her birine üç mikrolitre ekleyin. Daha sonra balıkların kontrol kuyularına üç mikrolitre araç kontrolü ekleyin.

Bileşiğe verilen floresan tepkinin balık içindeki aktivitenin bir sonucu olduğundan emin olmak için, ilaç ve araç tedavilerini her biri 96 oyuklu bir plakada üç boş kuyuya ayarlayın. Şimdi, sırasıyla 530 nanometre ve 590 nanometre uyarma ve emisyon dalga uzunluklarına sahip bir floresan plaka okuyucu kullanarak, balık tabağının kuyularını okuyun. Plakayı 28,5 santigrat derecede nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin.

Teste ve test edilen bileşiğin stabilitesine bağlı olarak, floresanı önceden belirlenmiş bir zaman noktasında tekrar okuyun. Floresandaki nispi değişimi değerlendirmek için, kontrol kuyuları için floresanstaki ortalama değişimi hesaplayın. Daha sonra, her bir oluğun floresansındaki değişimi, kontrol kuyularının floresansındaki ortalama değişime bölün.

İşte 96 oyuklu bir plakanın iki sütununun kullanılmasına bir örnek. Sütun A kuyuları, araçla tedavi edilen kontrol zebra balıklarını içerirken, sütun B kuyuları insülin ile tedavi edilen zebra balıklarını içerir. Tablo A'da, sıfır zamanında ölçülen floresan gösterilmiştir.

Tablo B, 24 saat sonra ölçülen floresanı içerir. Tablo C'de, floresanstaki değişimi değerlendirmek için sıfır zamanındaki floresan, 24 saatteki floresanstan çıkarılmıştır. Ardından, kontrol kuyularındaki floresanstaki ortalama değişimi hesaplayın.

Tablo D, her bir kuyucuğun floresansındaki değişimin, kontrol kuyularındaki ortalama değişime bölünmesiyle elde edilir. Burada, 10 mikromolar'da insülin tedavisinin, zebra balığı tarafından 24 saat içinde üretilen sinyalde 0,0001'den daha düşük bir P değeri ile 2,77 kat artışa neden olduğunu görebilirsiniz. Burada görüldüğü gibi, tahlil çözeltisi embriyoların yokluğunda renk veya mutlak floresan seviyelerini değiştirmez.

Bununla birlikte, tahlil, kuyu içindeki metabolik hızdaki küçük değişikliklere karşı oldukça hassastır. Bu rakam, 24 saat kuluçkaya yatırıldıktan sonra embriyonik tilapia tarafından üretilen sinyalleri temsil eder. Pembe kuyular, yüksek metabolik hıza sahip balıkların göstergesidir.

Mor kuyular, orta derecede metabolik hıza sahip balıklar içerir ve mavi kuyular, düşük bir metabolik hızı temsil eder. Bu aynı zamanda bu testin çok yönlülüğünü ve teleost türleri arasında uygulanmasını da göstermektedir. NADH2'nin neden olduğu alamar mavisi azalması geri dönüşümlü olmadığından, sinyal zamanla birikir ve bu da küçük değişikliklerin yükseltilmesine izin verir.

Burada gösterilen, bir, iki ve dört saatte bir ila beş balığın neden olduğu floresanstaki nispi değişimdir. Balık sayısındaki her artışla birlikte, floresanstaki nispi değişim zamanla önemli ölçüde artar ve balık sayısı ne kadar fazlaysa, zamanla floresan değişimindeki büyüklük de o kadar büyük olur. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik günde 5.000'e kadar embriyonik balık üzerinde gerçekleştirilebilir.

Bu prosedürü denerken, embriyonik balığa zarar vermemek için dikkatli olmayı unutmamak önemlidir. Bu testi yaptıktan sonra, nötr lipitlerin Nil kırmızısı ölçümü veya florassay etiketli paramesyum alımı yoluyla fajik sürücünün ölçümü gibi diğer prosedürler de gerçekleştirilebilir. Bu, metabolik hız ve lipid metabolizması veya metabolik hız ve fajik sürücü arasındaki ilişkiyi karşılaştırmamızı sağlar.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, enerji metabolizması ve metabolik hastalıklar alanındaki araştırmacıların, zebra balıklarında enerji harcamalarını verimde sınırlama olmaksızın incelemelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, zebra balığında NADH2 üretimini ölçmek için florometrik reaktif resazurinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.