Name: Yüksek Verimli Danio rerio Enerji Harcaması Deneyi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Öğrenin, Danio rerio larvalarında NADH2 üretimini ölçerek metabolik hızı değerlendirmek için yüksek verimli resazurin bazlı florometrik analiz yöntemini. Bu teknik, obezite araştırmalarında ilaç ve gen etkilerini taramak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Dr. Roger Cone ve Chao Zhang'a daha önce yayınlanmış olan bu testin uygulanmasını doğrulamaya yaptıkları katkılardan dolayı teşekkür eder. Bu çalışma NIH 1F32DK082167-01 (BJR) tarafından desteklenmiştir.

Not: Bu protokol Araştırma Sorumlu Davranış Arizona Ofisi Üniversitesi kuralları takip ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır 1. Zebra balığı Islahı ve Embriyo Bakım <ol><li> E3 embriyo orta 8 hazırlayın. 60x stok solüsyon To Make, 1.95 L ddiH 2 O. içinde 34.8 g NaCl, 1.6 gr KCI, 5.8 g CaCl2 ● 2H 2 O ve 9.78 g MgCl2 ● 6H 2 O çözülür DdiH 2 O. kullanarak 2 L ses seviyesini ayarlama NaOH ve HCI kullanılarak 7.2 pH ayarlayın </li><li> 1 L ddiH20 16,5 ml 60x stok sulandırmak, 1x E3 embriyo orta hazırlamak. 100 ul% 1 metilen mavisi ekleyin. </li><li> Yetiştirme <ol><li> Ev Erkek ve Dişi anaç (7 - yaş 18 ay) ayrı ayrı doğurganlığı artırmak için. </li><li> Yumurtalar istenen gün önce önce 2 saat - 1 ışıklarını kapatın. C - Set up çiftleşme (2 kadın 1 erkek ve 1)Rossing kafesleri, daha önce 9 nitelendirdi. Onlar yetişkin balıklar tutuldukları tank ucun delikli tabanı üzerinden geçerken yumurta predationu kaçmak için kapısı kafesleri izin verir. </li><li> İsteğe bağlı. Zamanlı ıslahı için, (morfolino enjeksiyonunu içeren çalışmalar için gerekli olacak gibi), şeffaf bir plastik bölücü erkek ve kadın balık ayırmak, yumurta ve gübreleme zamanlı döşenmesi sonucu sabah bu çıkartın. Morfolino çalışmalar için, tedavi başına gereken embriyonik balık sayısını değerlendirmek için güç hesaplamaları gerçekleştirmek. Etki ya da varyasyon büyüklükte bir tahmin olmaksızın, bir ön deneme, bir n = 8 ile çalıştırılabilir. </li></ol></li><li> (- 150 embriyolar / 10 cm petri 100) bir petri kabına geçiş kafesten yumurta dökün. Yumurta çanak dibe ve su kapalı dökmek için izin verin. Ince uçlu atılabilir transfer pipet kullanarak kalan suyu çıkarın. Adım 1.1 yapılan E3 embriyo orta geri ekleyin. </li><li> Af olunGelecekteki yumurta ve balık transferi için topal cilalı tek kullanımlık pipet. Makas kullanarak, 0.25 ml mezuniyet dereceli atılabilir bir transfer pipet kesti. Pürüzlü kenarları, alev lehçe Bunsen beki üzerinde kesik ucu kaldırın. </li><li> Zebra balığı E3 embriyo orta petri 28.5 ○ C&#39;de post-fertilizasyon 10 cm (dpf) 4 gün embriyonik balık koruyun Twice her gün, bir alev herhangi gübresiz yumurta veya ölü embriyolar (opak beyaz görünümü) kaldırmak için atılan transfer pipet mezun cilalı kullanın. Her gün bir kez, E3 embriyo orta yerine. Ince uçlu atılabilir transfer pipet kullanarak, kalan sıvıyı çıkarmak, E3 embriyo orta kapalı dökün ve önceden ısıtılmış (28.5 ○ C) E3 embriyo orta geri ekleyin. </li></ol> 2. Deney çözeltisi hazırlayın <ol><li> 0.22 uM filtre kullanılarak Tablo 1. Steril filtre deney solüsyonuna göre olan bir deney çözeltisi hazırlayın. Bir 28.5 ○ C steril tahlil çözümü, inisiyasyonu tahlil sıcak öncesindesu banyosu. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Toplam% </td><td> Cilt (ul / 10 ml) </td></tr><tr><td> 60x E3 Embriyo Orta </td><td> 1,667 </td><td> 166,7 </td></tr><tr><td> Çift deiyonize (DDI) H 2 0 </td><td> 96,233 </td><td> 9623,3 </td></tr><tr><td> Alamar Mavisi </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 mM NaOH </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0.1 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Analiz Ortamı 3. Testi gerçekleştirmek <ol><li> Zebra balığı embriyolar steril süzülmüş E3 embriyo orta ile 3 kez durulayın. Bir behere debriyaj tüm canlı zebrafish embriyolar birleştirin. Steril filtre 75 ml E3 embriyo orta. Ince bir ucu tek kullanımlık transfer pipet kullanarak yenidenmümkün olduğunca Zebra balığı embriyolarının gelen E3 embriyo orta kadar hareket ettirin. 20 ml steril süzülmüş E3 embriyo orta geri ekleyin. Çıkarın ve E3 embriyo orta 3 kez değiştirin. </li><li> 96-iyi siyah 93 kuyuların her birine Levha 1 balık net alt plaka taraflı. Alev plastik tek kullanımlık transfer pipet mezun cilalı içinde ayrı ayrı (1.5 adım) bir embriyo yakalama ve yavaşça kuyunun içine püskürtülmesiyle plakaya embriyonik balık aktarın. 3 boş kuyulara durulanır balık içeren beher alınan E3 embriyo orta aktarın. Bu boş kuyular balıklar içerdikleri kuyuların tam olarak aynı suya maruz kalmış olmasını sağlar. Balık ve boş kuyular içerirler Her iki kuyu, bu aşamada bitiminde (200 ul), en az ½ dolu olmalıdır. </li><li> Boş kuyular da dahil olmak üzere 96 kuyu, içinde tahlil çözeltisi ile E3 embriyo orta değiştirin. Bu kademe, bir 96 oyuklu bir plaka içerisinde 12 her sütun için bir seferde 1 sütun yapılmalıdır. Ince ucunu kullanarak atılabilir transfer pipet, plakanın (8 kuyu) bir sütunda her kuyudan E3 embriyo orta kaldırmak. Zebra balığı embriyo dokunmayın özen gösterin. Su çıkarıldı kuyuya her deney çözeltisi 300 ul ekle. Plaka 12 sütunlar için tahlil çözümü ile E3 embriyo orta ve değiştirme kaldırılmasını tekrarlayın. </li><li> İsteğe bağlı: Bir bileşik cevaben metabolizma hızı değişikliği sınamak için, 100 kez (100X) istenen tedavi konsantrasyonu bir çözüm yapmak. Dikkat çekici bir şekilde, 100x çözeltisi,% 0.1 daha fazla nihai DMSO konsantrasyonunu sınırlandırmak için% 10 DMSO aşmamasını sağlamak. Tedavi bölümlerinin her birine 100x çözeltisi 3 ul ekleyin. NOT: Tedavi kuyu sayısını değerlendirmek için güç hesaplamaları gerçekleştirin. Bununla birlikte, yanıt veya varyasyonun büyüklükte bir tahmini olmadan, bir ön deneme tedavi 8 bileşiği ve balık içeren 8, araçla tedavi edilen kontrol oyuklarında çalıştırılabilir. <ol><li> (Kontrol hiçbir dru araç kontrolünün 3 ul ekleying tedavisi) balıklar içerdikleri kuyular. Bileşiğe fluoresan yanıt balıkta eylemlerinin bir sonucu olduğundan emin olmak için, 96 oyuklu bir plaka içerisinde 3 Boş oyuklara ilaç ve araç tedavileri uygulanır. </li></ol></li><li> 590 nM&#39;de 530 nM uyarma dalga boyunda ve emisyon dalga boyu ile floresan plaka okuyucusu üzerinde balık dolu plaka okuyun. </li><li> Nemlendirilmiş inkübatör içine yerleştirin plakası 28.5 ○ C (tahlil çözeltinin photobleaching önlemek için tahlil boyunca karanlıkta plaka korumak) olarak ayarlanır. Deney 1 saat ila 24 saat arasında değişir zaman süreleri için çalıştırılabilir. Deneyin süresi çalışmanın amacı bağlıdır. Bir kısa süreli en uygun olabilecek bir kısa etkili olmayan kararlı bir bileşik yanıtı test için. Yine, stabil bir bileşik testleri veya genetik etkileri testleri için, deney süresi maksimize kümülatif sinyali ile ilgili avantajlar yararlanmak için tercih edilir. </li><li> Önceden belirlenmiş bir zaman noktasında (zamanlama belirlemenize yardımcı olması için 3.6 adıma bakınız)adım 3.5 ile aynı ayarlarla tekrar balık dolu plaka floresan okuyun. </li></ol> 4. Tedavi ile Floresans İlişkili Bağıl Değişim değerlendirin <ol><li> De çalışma sonucunda floresan zaman 0 floresan çıkarılarak her floresan değişimi hesaplanır. Balık (boşluklar) olmadan Wells balıklar içerdikleri kuyulardan uzak değerlerinin altında, 0&#39;a yakın değerlere sahip olmalıdır. Sonuca Floresans = Floresan değişim - Floresan 0 zamanında </li><li> Kontrol Kaynaklar akabinde kontrol kuyularının floresan ortalama değişiklik ile her çukurun fluoresans değişikliği bölmek için floresans nispi değişikliği tespit etmek için, floresans ortalama değişimi hesaplamak. Unutmayın ki, kontroller, araç kontrolleri veya genetik kontrolleri ya olabilir. <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/53297/53297eq1.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> PNAS. 110, 13904-13909 (2013).</li>
<li>Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+knock-in+transgenic+zebrafish+carrying+reporter%2Fdriver+genes+by+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Sci. Rep. 4, 6545(2014).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+energy+metabolism.+Proton+permeability+of+the+inner+membrane+of+liver+mitochondria+is+greater+in+a+mammal+than+in+a+reptile%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile.</a> Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).</li>
<li>Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+assay+for+high-throughput+energy+expenditure+monitoring+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish.</a> Zebrafish. 10, 343-352 (2013).</li>
<li>Livingston, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+volumetric+respirometer+for+long-term+studies+of+small+aquatic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.Mar.+Biol.+Assoc.+U.K%22%5BJournal%5D)">A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals.</a> J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).</li>
<li>Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-animal+microplate+assay+for+metabolic+rate+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish.</a> J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).</li>
<li>E3 medium (for zebrafish embryos) Cold Spring Harb. Protoc. , <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/citmgr?gca=protocols%3B2011%2F10%2Fpdb.rec66449">http://cshprotocols.cshlp.org/citmgr?gca=protocols%3B2011%2F10%2Fpdb.rec66449</a> (2011).</li>
<li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR J. 53, 161-168 (2012).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%2C+A+practical+approach%22">Zebrafish, A practical approach</a>. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Fry, F. E. J., Hart, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cruising+speed+of+goldfish+in+relation+to+water+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fish.+Res.+Board+Can%22%5BJournal%5D)">Cruising speed of goldfish in relation to water temperature.</a> J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).</li>
<li>Oka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+obesity+in+zebrafish+shares+common+pathophysiological+pathways+with+mammalian+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+physiol%22%5BJournal%5D)">Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity.</a> BMC physiol. 10 (21), (2010).</li>
<li>Song, Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+a+genetic+model+of+obesity+in+a+teleost%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Creation of a genetic model of obesity in a teleost.</a> FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).</li>
<li>Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+insulin+resistance+in+zebrafish+induces+alterations+in+beta-cell+number+and+glucose+tolerance+in+an+age+and+diet+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+physiol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner.</a> Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).</li>
<li>Flynn, E. J. 3rd, Trent , C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+nutritional+control+of+adipogenesis+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+lipid+res%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio).</a> J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).</li>
<li>Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+fluorescence-based+assay+system+for+appetite-regulating+gene+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening.</a> PloS one. 7, e52549(2012).</li>
<li>Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+obesogenic+test%3A+a+tool+for+screening+molecules+that+target+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+lipid+res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity.</a> J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak rakip mali çıkarları yoktur.

Bakteri veya mantar ile kontaminasyon büyük ölçüde bu testin uygulanmasını sınırlayacaktır. E3 embriyo orta metilen mavisi fungal bulaşma olasılığını sınırlandırır. Embriyo boyunca bu bakım iki kez her gün ölü embriyolar kaldırmak için alınması çok önemlidir yetiştirme. Buna ek olarak, iyice deney başlatma gün steril E3 embriyo ortamı ile embriyolar durulanması gereklidir. Bu 2 adım embriyoların bakteriyel kontaminasyon potansiyelini sınırlar. Aşama 3.2 &#39;de tarif edilen Boş oyukların dahil herhangi bir bakteriyel ko...

Fare şu anda obezite araştırmaları için baskın modeldir. Kısa nesil aralığı ve fare kullanılabilir genetik araçları bugüne kadar eşsiz olmuştur. Ancak, Zebra balığı da kısa bir nesil aralığı vardır (3-4 ay) ve genetik manipülasyon 1,2 kolaylığı hatta fare geçti. Kadar genetik ve ilaç ekranlar 3 kullanım için yavruları ve potansiyeli sayıda fare üzerinde gerçekleşmiştir zebra balığı memeli genlerinin yaklaşık% 90 tutar. Obezitede çalışmalar için zebrabalıkları modelinin potansiyelini, tahliller enerji harcaması da dahil olmak üzere vücut ağırlığı regülasyonu, etkileyen faktörleri araştırmak amacıyla geliştirilmesi gerekmektedir. Metabolitler β-oksidasyon ve trikarboksilik asit döngüsü oksijenle işlenir zamanda tüketilir ve NADH 2 üretilir. Bu nedenle, NADH 2 metabolik yolların (metabolit oksidasyonu) ile metabolitlerin akış doğrudan bir göstergesidir. Poikil olarakhomotermlere 4 5&#39;ten kat daha düşük - otherms, H +, ATP sentezi gelen NADH 2 oksitlenmeyi koparan 4&#39;tür iç mitokondrial membran aracılığıyla kaçak. Bu duruma göre, zebra balığı NADH 2 çok sıkı bir şekilde, oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretimi ile bağlantılıdır. Bu yazıda, enerji harcaması 5 için bir proxy olarak larva Zebra balığı NADH 2 üretimini ölçen bir tahlil açıklar. Oksijen tüketimi enerji tüketimini ölçmek için altın standarttır. Ancak, en iyi zebrafish yüksek verimlilik potansiyelinin yararlanmak, enerji harcama tahliller yüksek verimlilik için uygun olmalıdır. Sirkülasyon sistemi, kapalı bir bölme bağlıdır Oksijen tüketimi sistemleri 6 mevcuttur bölmelerin sayısına göre hacmi sınırlıdır. Açık hava O 2 tüketimi / CO2 üretim deneyleri de zebrabalıkları 5,7 uygulanmıştır. Bu açık hava 96 oyuklu levha temeld sistemleri, yüksek verim için uygun. Ne yazık ki, çevre ile gaz değişimi Bu tahlillerin duyarlılığını sınırlar. Biz son zamanlarda redoks göstergesi AlamarBIue 5 ile NADH 2 izler bir testin uygulanmasını yayınladı. Bu deney hacmi ve zebrabalıkları oksijen tüketimi analizler için ortak hassasiyetindeki sınırlamaların üstesinden gelmektedir. Zebra balığı tüm vücut enerji homeostazı çalışmaları için giderek önemli bir model haline geliyor. Bölümünde, Zebra balığı nedeniyle ileri genetik ekranlar ve ilaç ekranlarında kullanmak için uygun. Ayrıca, demonte ve knock-in, hızlı bir şekilde uygulanabilir dahil genetik manipülasyon hedef aldı. Daha önce bu deney bileşikleri ve metabolik oranı 5 değiştiren genleri tanımlamak için banyo ilaç uygulaması ve genetik devirme veya nakavt ile kombine edilebilir olduğunu göstermiştir. Ayrıca, bu deney zebrabalıkları doğasında yüksek kapasiteli avantajları yararlanmak için tasarlanmıştır. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>AlamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-230-103</td><td>Thermo Scientific tarafından üretilmiştir</td></tr><tr><td>İnce Uçlu Tek Kullanımlık Transfer Pipeti</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-26</td><td>Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fisherbrand tarafından üretilmiştir Dereceli Tek Kullanımlık Transfer Pipeti</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-771-9AM</td><td>Thermo Scientific tarafından üretilmiştir</td></tr><tr><td>Siyah taraflı şeffaf tabanlı 96 kuyulu plakalar</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-320-785</td><td>E & tarafından üretilmiştir K Bilimsel Ürünler A.Ş.</td></tr></tbody></table>

yüksek verimli<em&gt; danio rerio</em&gt; enerji harcaması deneyi

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebra balığı Zebra balığı, enerji homeostazı ve obezite çalışma için yaygın olarak uygulanan bir model yapmak potansiyeline sahip doğal avantajları ile önemli bir model organizma vardır. Embriyolardaki deneyler, 96 veya 384 oyuklu plaka formatmda gerçekleştirilir edilmesi için zebrabalıkları küçük boyutu sağlar Morfolino ve CRISPR tabanlı teknolojiler banyo uygulaması tarafından genetik manipülasyon kolaylığı ve ilaç tedavisi iyileştiren yaşayabilir olduğunu. Ayrıca, Zebra balığı roman gen keşfi için izin ileri genetik ekranlar için idealdir. Obezite için bir model olarak zebrafish göreceli yenilik göz önüne alındığında, tam bu faydaları istismar araçları geliştirmek için gereklidir. Burada, aynı zamanda embriyonik zebrafish binlerce enerji harcanmasını ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz, bireysel balık izole etmek için, 96 gözlü levhalar kullanan bir bütün hayvan mikroplaka platformu geliştirdik ve ticari olarak temin edilebilen hücre kültürü canlılığı yeniden hesaplanan toplam NADH 2 üretimini değerlendirmekAjan AlamarBIue. Poikilotherms NADH 2 üretim ve enerji tüketimi arasındaki ilişki sıkıca bağlanır. Bu enerji harcaması tahlil hızla doğrudan enerji tüketimini değiştirmek veya uygulamalı ilaç (örn insülin duyarlılığını) yanıtı değiştirebilir farmakolojik veya genetik manipülasyonlar taramak için potansiyel oluşturur.

Deney çözeltisi embriyonik balık (Şekil 1) yokluğunda floresansında bir artış meydana gelmez. Ancak, tahlil kuyunun içinde metabolizma hızı küçük değişikliklere karşı çok duyarlıdır. Bir kuyunun içinde bir tek balık 1 saat (p &lt;0.0001) içinde boş kuyulardan önemli ölçüde farklı bir sinyal oluşturur. 2 kuluçkadan 24 saat sonra embriyonik balıklar tarafından üretilen sinyallerin görsel temsilini sağlar Şekil. Bu resmin amacı için açık yüzlü kuyular kullanıldı. Bununla b...

Zebra balığı, enerji homeostazı çalışmaları için önemli bir model organizmadır. NADH2'ye duyarlı bir redoks indikatörü olan alamar Blue'yu kullanarak, zebra balığı larvalarının metabolik hızını 96 oyuklu plaka formatında ölçen ve ilaç veya gen keşfine uygulanabilen bir test geliştirdik.

Yüksek Verimli<em&gt; Danio rerio</em&gt; Enerji Harcaması Deneyi

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

Bu yüksek kapasiteli rezazurin tabanlı florometrik analizinin genel amacı, metabolik hızın bir ölçüsü olan NADH2 üretimi üzerinde genetik veya farmakolojik manipülasyonların etkisini izlemektir. Bu yöntem, obezite alanında belirli bir ilacın veya genin metabolik hız üzerindeki etkisi gibi temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Ayrıca, bu analiz, tüm hayvan sisteminde potansiyel ilaç-ilaç veya ilaç-gen etkileşimlerini taramak için uygulanabilir.Bu deneyin oksijen tüketim deneylerine kıyasla temel avantajı, yüksek kapasiteye sahip olması ve sinyalin zamanla birikmesi sayesinde kullanıcının metabolik hızdaki küçük farkları tespit edebilmesine olanak tanımasıdır. Bu prosedürü, laboratuvarımdaki lisansüstü öğrencisi Caroline Foy uygulamalı olarak gösterecektir. Metin protokolüne uygun olarak 60X stok E3 besiyeri çözeltisi hazırlandıktan sonra, 16,5 mililitre stok çözeltiyi bir litre çift distile su ile seyrelterek 1X E3 besiyerini hazırlayın.Ardından 100 µL %1 metilen mavisi ekleyin. Yumurta ve balık transferi için alevle cilalanmış tek kullanımlık pipet hazırlamak için, dereceli tek kullanımlık bir transfer pipetini makas kullanarak 0,25 mL derecesinden kesin. Daha sonra, pürüzlü kenarları gidermek için kesilen ucu Bunsen bekiyle alevle cilalayın.Zebrafish çaprazlamaları kurulup yumurtalar toplandıktan sonra, yumurtaların kabın dibine çökmesine izin verin ve suyu dökün. Kalan suyu uzaklaştırmak için ince uçlu tek kullanımlık bir transfer pipeti kullanın. Ardından E3 besiyerini tekrar ekleyin.Embriyonik balıkları, döllemeden sonraki dördüncü güne (DPF) kadar 28.5 °C'de inkübe edin. Günde iki kez, döllenmemiş yumurtaları veya ölü embriyoları uzaklaştırmak için alevle parlatılmış dereceli tek kullanımlık transfer pipeti kullanın. Ardından günde bir kez E3 besiyerini dökün.Kalan ortamı uzaklaştırmak için ince uçlu bir transfer pipeti kullanın ve bunu 28.5 °C'ye ön ısıtılmış taze E3 ile değiştirin. Enerji harcaması analizini gerçekleştirmek için, bu tabloyu takip ederek analiz çözeltisini hazırlayın. Çözeltiyi sterilize etmek için 0.22 µm'lik bir filtre kullanın ve analiz için bir su banyosunda 28.5 °C'ye ısıtın.Bir petri kabında, yumurta grubundaki tüm canlı zebrafish embriyolarını birleştirin. 75 mililitre E3 ortamını filtre sterilizasyonundan geçirdikten sonra, ince uçlu tek kullanımlık bir transfer pipeti kullanarak petri kabındaki E3 ortamının mümkün olduğunca fazlasını uzaklaştırın. Geriye 20 mililitre steril E3 ekleyin. Ardından, steril E3'ü iki kez daha uzaklaştırıp yenileyin.Ardından, alevle cilalanmış dereceli plastik tek kullanımlık transfer pipeti kullanarak, embriyonik balıkları tek tek 96 kuyucuklu bir plakadaki kuyucuklara aktarın. Plakanın her seferinde tek bir sütunu üzerinde çalışarak, transfer pipetiyle embriyolara dokunmamaya dikkat ederek ilk sütundaki sekiz kuyucuktaki E3 ortamını uzaklaştırın. Daha sonra her kuyucuğa 300 microliters analiz çözeltisi ekleyin.Plakanın tüm 12 sütunu için işlemi tekrarlayın. Bir ilaç tedavisi dahil etmek için, istenen bileşiğin 100X çözeltisini hazırladıktan sonra, tedavi kuyucuklarının her birine üç µL ekleyin. Ardından, balıkların kontrol kuyucuklarına üç µL taşıyıcı kontrol ekleyin.Bileşiğe karşı verilen floresans yanıtının balıktaki aktivitenin bir sonucu olduğundan emin olmak için, 96 kuyucuklu bir plaka üzerinde ilaç ve taşıyıcı (vehicle) işlemleri için üçer adet boş kuyucuk hazırlayın. Şimdi, sırasıyla 530 nanometre eksitasyon ve 590 nanometre emisyon dalga boylarına sahip bir floresans plaka okuyucu kullanarak, balık plakasındaki kuyucukları okuyun. Plakayı 28.5 degrees Celsius sıcaklıktaki nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin.Analize ve test edilen bileşiğin stabilitesine bağlı olarak, önceden belirlenmiş bir zaman noktasında floresan okumasını tekrarlayın. Floresanstaki göreceli değişimi değerlendirmek için, kontrol kuyucukları için ortalama floresan değişimini hesaplayın. Ardından, her bir kuyucuğun floresan değişimini, kontrol kuyucuklarının ortalama floresan değişimine bölün.Burada, 96 kuyucuklu bir plakanın iki sütununun kullanımına dair bir örnek verilmiştir. A sütunu kuyucukları araçla işlem görmüş kontrol zebrafish'leri içerirken, B sütunu kuyucukları insülinle işlem görmüş zebrafish'leri içermektedir. Tablo A'da, sıfırıncı zamanda ölçülen floresan gösterilmektedir.Tablo B, 24 saat sonra ölçülen floresansı içermektedir. Tablo C'de, floresanstaki değişimi değerlendirmek için sıfırıncı zamandaki floresans, 24. saatteki floresanstan çıkarılmıştır. Ardından, kontrol kuyucuklarındaki ortalama floresans değişimini hesaplayın.Tablo D, her bir kuyucuktaki floresans değişiminin, kontrol kuyucuklarındaki ortalama değişime bölünmesiyle elde edilen değerleri göstermektedir. Burada, 10 micromolar insülin uygulamasının, 24 saat boyunca zebrafish tarafından üretilen sinyalde, 0.0001'den küçük bir P değeri ile 2,77 kat artışa neden olduğu görülebilir. Burada görüldüğü üzere, embriyoların yokluğunda assay çözeltisinin rengi veya mutlak floresans seviyeleri değişmemektedir.Ancak, analiz kuyucuk içindeki metabolik hızdaki küçük değişikliklere karşı oldukça hassastır. Bu şekil, 24 saatlik inkübasyon sonrası embriyonik tilapia tarafından üretilen sinyalleri temsil etmektedir. Pembe kuyucuklar, yüksek metabolik hıza sahip balıklara işaret eder.Mor kuyucuklar orta düzeyde metabolik hıza sahip balıkları, mavi kuyucuklar ise düşük metabolik hızı temsil etmektedir. Bu durum aynı zamanda, bu assay'in çok yönlülüğünü ve teleost türleri genelindeki uygulanabilirliğini göstermektedir. NADH2 ile tetiklenen alamar blue indirgenmesi geri dönüşümsüz olduğu için sinyal zamanla birikir ve bu da küçük değişikliklerin amplifiye edilmesine olanak tanır.Burada, bir ila beş balığın bir, iki ve dört saatteki etkisine bağlı olarak floresanstaki göreceli değişim gösterilmektedir. Balık sayısındaki her artışla birlikte, floresanstaki göreceli değişim zamanla önemli ölçüde artmakta ve balık sayısı arttıkça, zamanla meydana gelen floresans değişiminin büyüklüğü de artmaktadır. Bu teknik uzmanlaşıldığında, günde 5.000 embriyonik balığa kadar uygulanabilir.Bu prosedürü uygularken, embriyonik balıklara zarar vermemeye özen göstermek önemlidir. Bu analiz gerçekleştirildikten sonra, nötr lipidlerin Nile red ile ölçümü veya florassay ile etiketlenmiş paramecium alımı yoluyla faji dürtüsünün ölçümü gibi diğer prosedürler uygulanabilir. Bu durum, metabolik hız ile lipid metabolizması veya metabolik hız ile faji dürtüsü arasındaki ilişkiyi karşılaştırmamıza olanak tanır.Geliştirilmesinin ardından bu teknik, enerji metabolizması ve metabolik hastalıklar alanındaki araştırmacıların, zebra balıklarında enerji harcamasını kapasite kısıtlaması olmaksızın incelemelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, zebra balıklarında NADH2 üretimini ölçmek için florometrik reaktif resazurin'in nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

high-throughput-danio-rerio-energy-expenditure-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Metabolik çalışmalar için-kullanılan altında olmuştur güçlü bir omurgalı modeli temsil zebrafish. Burada ölçmek için hızlı bir şekilde...

Zebra balığı Embriyolar Metabolik Profil Analizi

Model organizma Caenorhabditis elegans'ta mitokondriyal inhibitörlerin etkilerinin in vivo tespiti ve potansiyel arttırıcı bileşiklerin tanımlanması için bir protokol tanımlanmıştır. Bu protokol, mitokondriyal fonksiyonu modüle eden bileşikler için ilaç kütüphanelerini taramak için kullanılabilir.

Bir taranabilir<em&gt; İn Vivo</em&gt; Transjenik biyolojik olarak ışık veren kullanarak Mitokondriyal Modülatörleri için tahlil<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Yüksek yağlı diyet beslenme obezite Drosophila, anlayış temel moleküler mekanizmalar içinde lipotoxicity karıştığı için bir model olarak ikna etmek için iletişim kuralı bu. Ayrıca yüksek işlem hacmi triacylglyceride tahlil Drosophila ve potansiyel olarak diğer (böcek) modelleri çeşitli diyet, çevresel, genetik veya fizyolojik koşullar altında yağ birikimi ölçmek için sağlar.

Yüksek yağlı diyet beslenme ve yüksek işlem hacmi Triacylglyceride tahlil Drosophila Melanogaster

Biz oksijen tüketimi ve Drosophila melanogaster larva ve yetişkin Beynindeki hücre dışı asitleştirme ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bir metabolik analyzer adapte ve en iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralı ile kullanılmaktadır. Mikro-doku bağlar bu protokolü kritik bileşenidir ve tasarlanmış ve bunların kullanımı bu analizi için özel olarak yaratılmıştır.

Drosophila melanogaster Larval ve yetişkin beyin metabolik Analizi

Bu teknik oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme oranları explanted fare Retina dokularında bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak gerçek zamanlı kayıt açıklar.

Explanted Retina doku hücre dışı akı analizi ile enerji metabolizmasında ölçümü

Mitokondrial solunum organizmalar hayatta kalmak için önemlidir; Bu nedenle, oksijen tüketim oranını mitokondrial sağlık mükemmel bir göstergesidir. Bu iletişim kuralı, Bazal ölçmek için piyasada bulunan bir respirometer nasıl kullanılacağını açıklar ve maksimal oksijen tüketimi oranlarında yaşa, sağlam ve serbestçe hareketli Caenorhabditis elegans.

Oksijen tüketimi oranlarında sağlam Caenorhabditis elegans ölçümü

Burada, nematod C. elegans hücresel proteotoksik stres yanıtları floresan transkripsiyonel muhabirlerin aktivasyonunu ölçerek ve fizyolojik strese duyarlılık belirterek karakterize.

C. Eleganlarda Fizyolojik Stres Tepkilerinin Ölçüleri

Bu çalışma, C. elegans complex I hastalığı gaz-1(fc21)solucanlarında, yani ZebraLab (orta verimli bir test) ve WormScan'da (yüksek verimli bir test) iki yarı otomatik lokomotor aktivite analizi yaklaşımı için protokoller sunar ve nematod davranışını ve entegre nöromüsküler işlevi ölçmek için çok çeşitli araştırma yöntemleri arasında karşılaştırmalı analiz sağlar.

Caenorhabditis elegans Mitokondriyal Hastalık Modellerinde Hayvan Aktivitesini Ölçmek için Deneysel Yöntemlerin Karşılaştırmalı Analizi

Mikro plaka besleyici tahlili, Drosophila'dakisıvı gıda tüketimini ölçmek için ekonomik, yüksek verim yöntemi sunar. 3D baskılı bir cihaz, sineklerin barındırıldığı 96 kuyulu bir mikro plakayı, sineklerin bir izleyici boyası ile bir besleme çözeltisi tükettiği 1536 kuyulu bir mikro plakaya bağlar. Çözelti hacmi düşüşü spektrofotometrik olarak ölçülür.

Drosophila'da Tüketimin Nicelleştirilmesi için Yüksek Verimli Mikro Plaka Besleyici Tahlili

Bağırsak mikropları, konakçılarının sağlığını spesifik veya korunmuş mekanizmalar yoluyla olumlu veya olumsuz yönde etkileyebilir. Caenorhabditis elegans , bu tür mikropları taramak için uygun bir platformdur. Mevcut protokol, solucan sağlığı için bir vekil olarak kullanılan nematod stres direnci üzerindeki etki için 48 bakteri izolatının yüksek verimli taramasını açıklamaktadır.

Caenorhabditis elegans Health Üzerinde Etkisi Olan Mikrobiyal İzolatların Yüksek Verimli Taraması

Bu protokol, sıvı kültürdeki bakterilerin klirensinin ölçülmesine dayalı olarak Caenorhabditis elegans besleme hızını ölçmek için bir testi tanımlar.

Bakteriyel Klerensi Ölçerek Caenorhabditis elegans'ta Gıda Alımının Ölçülmesi

Öğrenin, Danio rerio larvalarında NADH2 üretimini ölçerek metabolik hızı değerlendirmek için yüksek verimli resazurin bazlı florometrik analiz yöntemini. Bu teknik, obezite araştırmalarında ilaç ve gen etkilerini taramak için kullanılır.

Yüksek Verimli

Daha fazla video keşfet