2.6: Tam Montajlı Yerinde Hibridizasyon

Tam montajlı in situ hibridizasyon, bilim adamlarının embriyonik gelişimin moleküler temelini anlamalarını sağlayan güçlü bir tekniktir. "Whole-mount", sadece bir doku diliminin değil, tüm embriyonun kullanılacağını gösterir. "In situ", "pozisyonda" anlamına gelen Latince bir ifadedir. Ve son olarak, "hibridizasyon", sentetik olarak üretilen bir RNA molekülünün bir organizmanın hücresi içindeki bir mRNA transkriptine tamamlayıcı bağlanmasını ifade eder.

Bu video, gelişimsel bozuklukların daha iyi anlaşılmasını sağlayabilecek prosedürü, beklenen sonuçları ve bu tekniğin seçilmiş uygulamalarını gösterecektir.

Organizma morfogenezinin altında yatan genler, embriyonik gelişim süreci boyunca zamansal ve mekansal olarak kısıtlı kalıplarda ifade edilir.

Riboprob adı verilen sentetik olarak üretilen RNA probları, tamamlayıcı bağlanma yoluyla mRNA'ları tespit etmek için kullanılır. Riboproblar, dinitrofenol, biotin veya digoksijenin gibi "haptenler" içeren özel nükleotidlerle etiketlenir. Haptenler, daha büyük moleküllere bağlandığında bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarabilen moleküllerdir ve bu nedenle antikor bağlanması için hedeflerdir. Bu tespit antikorları, bir floresan veya renkli boyanın biriktirilebileceği kimyasal reaksiyonları katalize eden yaban turpu peroksidaz veya alkalin fosfataz gibi enzimlere konjuge edilir.

Geleneksel in situ hibridizasyon teknikleri, iç yapıların tespitini kolaylaştırmak için bir embriyonun doku bölümlerinin hazırlanmasını gerektirir. Sonuç olarak, organizma boyunca gen ekspresyonunun tam bir değerlendirmesinin, bilgisayar yazılımı yardımıyla 5-6 μm'lik doku dilimlerinden yeniden yapılandırılması gerekecektir. Bununla birlikte, tam montaj tekniklerinin gelişmesiyle, tüm embriyo içinde daha büyük mesafelerde gen ekspresyon analizi elde edilebilmektedir.

Tam montajlı in situ hibridizasyonunun arkasındaki ilkelere baktıktan sonra, deneysel protokolü adım adım inceleyelim.

Bu prosedürdeki ilk adım, araştırılacak model organizmadaki hedef dizinin tanımlanmasını içerir. Hedef DNA dizisi daha sonra RNA polimeraz başlatma dizileri içeren primerler kullanılarak PCR ile amplifiye edilir. Amplifiye edilmiş DNA şablonu şimdi hapten etiketli nükleotidlerle in vitro olarak kopyalanır. Bu hapten etiketli riboprob artık hibridizasyon adımı için hazırdır.

Embriyolar, proteinleri stabilize eden ve RNazlara karşı koruyan çapraz bağlanan bir reaktif olan formaldehit ile fiksasyon yoluyla hibridizasyon için hazırlanır. Fiksasyondan sonra formaldehit, embriyonun Tween gibi az miktarda deterjan içeren fosfat tamponlu tuzlu su ile birkaç kez yıkanmasıyla uzaklaştırılır. Hücresel lipitleri uzaklaştırmak ve probun dokulara nüfuz etmesini kolaylaştırmak için, embriyolar kademeli bir dizi metanol yıkamasında kurutulur, örneğin:% 25,% 50,% 75,% 100 metanol. Embriyolar %100 metanol içinde -20°C'de bir aya kadar (veya daha fazla) korunabilir.

Embriyoları hibridizasyona hazırlamak için, yıkama başına giderek daha az metanol ile kademeli bir dizi metanol yıkama ile yeniden sulandırılmaları gerekir. Embriyolar daha sonra riboprobunun dokulara difüzyonunu kolaylaştırmak için bir proteaz ile sindirilir. Etiketli riboprob embriyoya eklenir ve hibridizasyon gerçekleştirilir.

Spesifik olmayan hibridizasyonları uzaklaştırmak için hibridizasyon sonrası yıkamalar yapılır. RNazlar A ve T1, tek sarmallı RNA'yı sindirerek tam olarak hibritleşmemiş probları çıkarmak için eklenir. Hibritleştirilmiş problar, hapten etiketli riboprobları bağlayan bir antikor-enzim konjugatı ile tespit edilir. Daha önce bahsedildiği gibi, alkalin fosfataz gibi enzimler, hapten spesifik antikorlara konjuge edilir ve bir renk değişikliği ortaya çıkarmak için enzim substratları eklenerek tespit edilir. Reaksiyon ürünü, bu örnekte görüldüğü gibi, eksprese edilen mRNA'nın yerini işaretleyen koyu mor bir çökelti oluşturur.

Artık tam montajlı in situ hibridizasyonun nasıl yapıldığını bildiğinize göre, tekniğin bazı uygulamalarına bakalım.

Tam montajlı in situ hibridizasyon, bilim adamlarının sıtma, dang humması ve Batı Nil hastalığı gibi ölümcül sivrisinek kaynaklı hastalıklarla mücadele etmesine yardımcı olmak için kullanılmıştır. Sivrisinek üremesi ve gelişiminde rol oynayan genleri karakterize ederek, hastalık taşıyan sivrisinekleri daha iyi hedeflemek için yeni biyolojik veya kimyasal böcek öldürücüler tasarlanabilir.

Bu tekniğin bir başka uygulaması, teratojenlere maruz kalma ile ilişkili gen ekspresyon paterni değişikliklerinin veya fetal gelişime müdahale eden ajanların karakterizasyonunu içerir.

Burada, alkole maruz kaldıktan sonra ekspresyon paternleri değişen genleri tanımlamak için fetal alkol sendromunun bir zebra balığı modelinde tam montajlı in situ hibridizasyonu kullanıldı. Bu, rahim içi alkole maruz kalmanın sonuçlarını hafifletmek için tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olabilir.

Tam montajlı in situ hibridizasyonu, konjenital hastalıklarla ilişkili fenotipik değişiklikleri doğrulamak için de kullanılabilir. Bardet-Biedl sendromu ile ilişkili mutasyonlar, sentetik olarak üretilen mutant mRNA'lar aracılığıyla zebra balığı embriyolarına sokuldu. Belirli bir süre sonra, embriyolar kusurların ciddiyetine göre gruplara ayrıldı. Mutasyona uğramış genin aşağı akışındaki genlerin ekspresyonunu görselleştirmek, fenotipik değişiklikleri doğrulamak için kullanıldı. Bu nedenle, fenotipik skorlama ile birlikte tam montajlı in situ hibridizasyonu, gelişimsel kusurların altında yatan spesifik mutasyonların rollerinin daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırabilir.

Az önce JoVE'nin tam montajlı in situ hibridizasyonuyla ilgili videosunu izlediniz. Bu teknik, bir organizma içindeki gen ekspresyonunun kesin zamansal ve mekansal karakterizasyonunu sağlayan güçlü bir araçtır. Tam montajlı in situ hibridizasyonu, şu anda çok sayıda model organizmada geliştirme sırasında bir gen ekspresyon modelleri atlası oluşturmak için kullanılmaktadır. Bu çalışmalar, kanser de dahil olmak üzere insan hastalıklarını tedavi etmek için yeni terapötiklerin geliştirilmesini kolaylaştırabilir. İzlediğiniz için teşekkürler!