Name: MikroRNA transcriptome bir transkripsiyon faktörü bağımlı regülasyonu açıklayan (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Keşfedin transkripsiyon faktörlerinin mikroRNA transkriptomunu nasıl düzenlediğini biyoinformatik analiz, veri madenciliği ve shRNA ile sessizleştirme yöntemlerini kullanarak. Bu hesaplamalı yaklaşım, gen regülasyonu ve nörobilim araştırmalarında yeni içgörüler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma KLL Küresel Araştırma Vakfı tarafından sağlanan hibe ile desteklenmiştir. Texas MD Anderson Cancer Center Üniversitesi Kanser Merkezi Destek Hibe (P30CA16672) aracılığıyla Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kısmen desteklenmektedir.

1. Veri Madenciliği Yaklaşımı ile MicroRNA Genler Promoter transkripsiyon faktörü Cilt Siteleri Belirlemek <ol><li> DNA elemanı (ENCODE) projesi Ansiklopedisi parçası olarak üretilen kromatin immünopresipitasyon (ChIP) dizi veri ayıklamak için California Üniversitesi Santa Cruz (UCSC) genom tarayıcı kullanın. <ol><li> UCSC genom tarayıcıda tablo tarayıcınızı açın. </li><li> tablo ayıklamak için aşağıdaki özelliklere kullanın: CLADE: (Memeliler), genom: (Insan), Montaj: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), grubu: (düzenleme), parça (TxnFactorChIP), masa: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), bölge : (Genom), çıkış biçimi (seçilen tablodan tüm genler). </li><li> .txt dosyası olarak ve bir elektronik tabloya 1.1.2 çıktı kaydedin. </li><li> Çevrede transkripsiyon faktörü (örneğin, STAT2) için sıralama ve filtre. </li></ol></li><li> Baeer ark mevcut H3K4me3 epigenetik imza dayalı microRNA rehberleri listesini kullanın. 9 </sus&gt;. bir .txt dosyasına bu listeyi kopyalayın. </li><li> , Insan genomu üzerindeki koordinatlarına göre maç (örneğin, STAT3 varsayılan microRNA rehberleri bağlayıcı) 1.1 ve 1.2 veri harita ve dosyayı 1 kodlama tamamlayıcı belirtildiği gibi keskin C yazılı kodu kullanarak ortanca bağlanma eğilimini belirlemek için. </li></ol> 2. Kullanım ShRNA İlgi bir transkripsiyon faktörünün ifadesi aşağı düzenler <ol><li> Plaka, yaklaşık% 50 izdiham (DMEM,% 10 FBS), 10 cm plaka 293 insan embriyonik böbrek hücre çizgisi, 1.5 x 10 6 hücre. </li><li> shRNA içeren yeşil floresan proteini (GFP) lentivirüs 5 ug 293 insan embriyonik böbrek hücre çizgisi transfect hücreler, ilgilenilen transkripsiyon faktörü ile ilgilidir ve paketleme vektörlerinin 5 ug üreticinin protokolüne uygun olarak yapışık hücreler için transfeksiyon reaktifi kullanılarak. </li><li> Bir kontrol olarak, 293 insan embriyonik böbrek hücre çizgisi hücreleri transfekteshRNA ve imalatçının protokolüne göre ambalaj vektörleri karıştırılmış. </li><li> (37 ° C, CO2 inkübatör de) 16 saat hücrelerde transfeksiyon karışımı tutun sonra% 10 FBS ile taze,% 10 DMEM ortamı 10 ml bir ortam. </li><li> 48 saat sonrası transfeksiyon bekleyin hücre kültürü (300 xg 5 dak) santrifüj ve bulaşıcı süpernatant toplamak. herhangi bir kayan hücrelerin çıkarılması için 0.45 um&#39;lik bir şırınga filtresinden (25 mm yüzey aktif madde içermeyen selüloz asetat membran) süpernatanın filtre. </li><li> süpernatant Konsantre ve 100 kDa eşiğinde olan bir ultrasentrifugal filtre cihazı kullanılarak lentivirüs toplamak. 30 950 xg&#39;de Spin - hacim kadar 60 dakika daha az 250 ul konsantre olmuştur. -80 ° C&#39;de konsantre edildi virüs saklayın. </li><li> lentivirüs hücreleri transfekte. -80 ° C derin dondurucuda dondurulmuş lentivirüs çıkarın ve oda sıcaklığına kadar Çözülme. taze bir 1.5 ml mikrofüj tüpe, viral süpernatanın 100 ul aktarın. <ol><li> Bring kadar düşük serum ortamı ile 1 ml tüp içinde hacim. 10 ng / ml nihai konsantrasyon 1 mi virüs süspansiyonu heksadimetrin bromit ekleme yavaşça karıştırın ve karışım 5 dakika boyunca bekletin. </li></ol></li><li> Santrifüj 5 x 10 6, her transdüksiyon için hücreler yavaşça virüs içeren ortam, 0.5 ml hücre pelletini. sonra% 10 FBS nihai bir konsantrasyona kadar% 20 FBS ile 0.5 ml ortamda ekleyin - 24 saat hücreler 4 inkübatöre kalsın. </li><li> 48 ila 72 saat beklemek ve propidyum iyodür (PI) ve üreticinin talimatlarına uygun olarak, yeşil floresan proteini (GFP) ve hücreleri leke. Işıktan hücreleri korur ve GFP + / PI oranlarını ölçmek için bir FACS sıralayıcı kullanın - hücrelerdir. PI lekeleri sadece ölü hücrenin bu yana, bu oran canlı hücrelerin transfeksiyon verimliliği bir tahmindir. </li><li> Daha önce 10 açıklandığı gibi FACS sıralayıcı ile GFP (GFP +) pozitif hücre popülasyonunu sıralayın. </li><li> Kullanım WesteRn immün lekeleme, daha önce önce belirlenmiş shRNA ile (örneğin, CLL hücreleri) ilgi hücreleri enfekte sonra ilgi konusu bir transkripsiyon faktörünün seviyelerini belirlemek için 10 tarif. </li></ol> 3. Transkripsiyon Faktör-shRNA ile transfekte edilen hücrelerde mikroRNA transcriptome ifade seviyelerini belirlemekte <ol><li> RNA, imalatçının protokolüne göre, ticari bir kit kullanılarak izole edilir. </li><li> RNA Etiket ve mikroRNA mikroarray 11 o melezleşme. </li><li> Transkripsiyon faktörü-shRNA veya boş vektör kontrolleri 5 ile transfekte hücrelerde farklı şekilde eksprese mıkroRNA belirler. </li><li> PCR 5 gerçek zamanlı kullanarak en farklı şekilde eksprese microRNA için mikroarray sonuçları doğrulayın. </li></ol> 4. Transkripsiyon Faktörü Bağımlı transkriptom nitelendiren içinde Biyoinformatik ve shRNA Yaklaşımı arasındaki örtüşme belirleyin <ol><li> dettransfekte hücreler kendi rehberleri siteleri bağlanma transkripsiyon faktörü liman ve transkripsiyon faktörü-shRNA olarak azaldı microRNA genlerinin beklenen ve gözlenen oranları ermine aşağıdakileri yapın: <ol><li> 1.3 oluşturulan listeden kendi organizatörü / toplam microRNA ilgi transkripsiyon faktörü barındıran genlerin oranı elde. Bu liste (örneğin, STAT3 bağlama siteleri / toplam microRNA genleri ile microRNA genleri = 0.25 test) beklenen oranıdır. </li><li> 3.3 oluşturulan listeden transkripsiyon faktörü-ShRNA transfekte hücrelerde downregüle VE 1.3 oluşturulan listeden faiz bağlayıcı sitelerin transkripsiyon faktörü vardır edildi genlerin sayısını belirler. Downregüle genlerin Bu sayı / toplam sayısı gözlenen oranı (örneğin, downregüle microRNA STAT3 bağlayıcı siteleri / toplam sayısı = 0.6 ile microRNA genleri). </li></ol></li&gt; <li> Yukarıda oluşturulan gözlenen ve beklenen oranları karşılaştırarak transkripsiyon faktörü-shRNA transfekte edilmiş hücreler olarak azaldı genlerin listesi, promotör transkripsiyon faktörü bağlama bölgeleri ile zenginleştirilmiş olup olmadığını belirlemek için istatistikleri χ2 kullanın. </li></ol>

<ol><li>Bentwich, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hundreds+of+conserved+and+nonconserved+human+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs.</a> Nat Genet. 37, 766-770 (2005).</li>
<li>Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+microRNAs+in+cardiovascular+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease.</a> Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
<li>Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+sites+are+highly+enriched+within+microRNA+precursor+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Direct%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences.</a> Biol Direct. 6, 61(2011).</li>
<li>Rozovski, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transducer+and+activator+of+transcription+%28STAT%29-3+regulates+microRNA+gene+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells.</a> Mol Cancer. 12, 50(2013).</li>
<li>Turner, M. J., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+microRNA+expression+in+C.+elegans%3A+promoting+better+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding.</a> RNA Biol. 6, 49-53 (2009).</li>
<li>Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+preferentially+target+the+genes+with+high+transcriptional+regulation+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).</li>
<li>Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34%2C+SIRT1+and+p53%3A+the+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop.</a> Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).</li>
<li>Baer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+promoter+DNA+hypermethylation+and+hypomethylation+is+associated+with+aberrant+microRNA+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia.</a> Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).</li>
<li>Hazan-Halevy, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+is+constitutively+phosphorylated+on+serine+727+residues%2C+binds+DNA%2C+and+activates+transcription+in+CLL+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells.</a> Blood. 115, 2852-2863 (2010).</li>
<li>Melo, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TARBP2+mutation+in+human+cancer+impairs+microRNA+processing+and+DICER1+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function.</a> Nat Genet. 41, 365-370 (2009).</li>
<li>Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+STAT+family+proteins%3A+lessons+from+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice.</a> Stem Cells. 17, 138-146 (1999).</li>
<li>Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+from+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+contain+signal+transducer+and+activator+of+transcription+%28STAT%29+1+and+STAT3+constitutively+phosphorylated+on+serine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues.</a> J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).</li>
<li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+reveals+distinct+signatures+in+B+cell+chronic+lymphocytic+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).</li>
<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+the+encyclopedia+of+DNA+elements+%28ENCODE%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE).</a> PLoS biology. 9, e1001046(2011).</li>
<li>Miranda, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pattern-based+method+for+the+identification+of+MicroRNA+binding+sites+and+their+corresponding+heteroduplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes.</a> Cell. 126, 1203-1217 (2006).</li>
<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489, 57-74 (2012).</li>
<li>Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+and+imprinted+epigenetic+modifications+of+the+human+NDN+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene.</a> Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).</li>
<li>Corcoran, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+mammalian+microRNA+promoters+emerge+from+polymerase+II+chromatin+immunoprecipitation+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data.</a> PLoS One. 4, e5279(2009).</li>
<li>Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+transcription+start+site+prediction+with+multi-objective+feature+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Stat+Appl+Genet+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection.</a> Stat Appl Genet Mol Biol. 11, Article 6 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

Protein kodlayan genlerin RNA polimeraz II bağımlı transkripsiyonu altında yatan mekanizma yoğun çalışmalar olmuştur. Bu elemanlar sadece% 1&#39;ini oluştururlar iken - İnsan genomunun% 2, ENCODE projeden kanıtlar, insan genomunun% 80&#39;in üzerinde transkripsiyonu 17 uğrayabileceği ne kodlamayan DNA elemanlarının transkripsiyonunu düzenleyen düşündürmektedir büyük ölçüde bilinmemektedir 6 . Pol II, aynı zamanda mikroRNAlar 6 dahil olmayan bazı protein kodla...

MikroRNA&#39;lar tipik posttranskripsiyonel düzeyde mRNA ifadesinin negatif regülatörleri işlev endojen küçük olmayan kodlama düzenleyici RNA vardır. Yaklaşık 1.000 kodlayıcı olmayan uzun mikroRNAlar insan genomunda 1,2 bulunur 20 nükleotid 25. MikroRNA&#39;lar genellikle 3 &#39;çevrilmemiş bölge, hedef mRNA (UTR) yer almaktadır microRNA ve tamamlayıcı tohum uyumlu sekans, tohum sırası arasında standart baz eşleştirme yoluyla gen ekspresyonunu düzenlerler. Toplu olarak, mikroRNAlar proteini kodlayan genlerin 3 fazla% 30 düzenleyen ama çok az mikroRNA DNA transkripsiyonu şey bilinmektedir. MikroRNA transkripsiyon regülasyonu, mRNA, 4,5 benzer olduğu ileri sürülmüştür. Özellikle, bir protein kodlayan genlerin transkripsiyonunu teşvik aktivitesine benzer transkripsiyon faktörleri mikroRNA 6 transkripsiyonunu aktif hale getirmek için düşünülmektedir. Transkripsiyon faktörü microRNA etkileşim gen ifadesinin 7 bir modülatör faktörü olarak rapor edilmiştir ve may da geri besleme ve beslemeyi ileri döngüler oluşturur. Örneğin, Yamakuchi ve ark., P53 sırayla p53 represör SIRT çevirisini ve böylece p53 aktivitesinin 8 artan inhibe microRNA34a ekspresyonunu indüklediği bir geri besleme döngüsü bildirilmiştir. microRNA transkripsiyon faktörü bağımlı ifade spesifik örnekler rapor edilmiştir Oysa, ilgi transkripsiyon faktörü microRNA-transcriptome ifadesini düzenleyen hakkında bilgi sağlayan bir kabul gören bir yöntem yoktur. Burada önerilen protokolün amacı microRNA-transcriptome transkripsiyon faktörü bağımlı düzenleme derinlemesine bir açıklamasını sağlamaktır. kamuya açık verileri, biyoinformatik araçları birleştiren ve mikrodizi teknolojisi kullanılarak, bu algoritmayı aşağıdaki araştırmacılar genomik ölçekte yakalamak mümkün olacaktır nasıl herhangiilgi herhangi bir hücre tipinde transkripsiyon faktörü mıkroRNA-transcriptome ifadesini düzenleyen ve mikroRNA ekspresyonunu düzenleyen transkripsiyon faktörü mRNA&#39;nın varsayılan bir katkı keşfetmek için.

<table><tbody><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>0.45 ve mikro; m şırınga filtresi</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td> <td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>100 & nbsp eşikli Amicon ultrasantrifüj filtre cihazı; kDa</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polibrene</td><td>Merck Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol reaktifi</td><td>Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>293 Hücre hattı insan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85120602</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrorna transcriptome bir transkripsiyon faktörü bağımlı regülasyonu açıklayan

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

Protein kodlayan genlerin transkripsiyon düzenlemesi fazla çalışılan iken, çok az, özellikle mikroRNA, transkripsiyon faktörleri kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar, transkripsiyona dahil bir şekline göre bilinmektedir. Burada, kamuya açık verileri, hesaplama kaynakları ve yüksek verimli verilerini kullanarak microRNA transkripsiyonunu düzenleyen transkripsiyon faktörü potansiyel rolünü incelemek için bir strateji önermek. Biz transkripsiyon faktör bağlanma siteleri ile zenginleştirilmiş microRNA destekleyicileri tanımlamak için ENCODE projeden -sequencing verileri microRNA promotör ve kromatin immünopresipitasyon (chip) tanımlamak için H3K4me3 epigenetik imza kullanın. ShRNA ilgi transkripsiyon faktörü hedef ve mikroRNA diziye hücreleri tabi olan ilgi hücreleri transfekte, biz microRNA transcriptome bu transkripsiyon faktörünün etkisini araştırmak. bir örnek olarak kronik ly mikroRNA transcriptome üzerinde STAT3 etkisi üzerine çalışmamızı kullanınmphocytic lösemi (CLL) hücre.

STAT3 tipik olarak anti-apoptotik ve proliferatif etkilere 12 olan genlerin transkripsiyonu uyaran bir transkripsiyon faktörüdür. İster STAT3 da kodlamayan RNA transcriptome bilinmemektedir etkiler. Tüm KLL hücrelerinde STAT3 serin 707 artıkları 10,13 üzerinde yapısal fosforile olduğunu. Çekirdeğe fosfoserin STAT3 servisleri, DNA&#39;ya bağlanır ve diğer hücre tipleri 10 tirosin pSTAT3 ile aktive edileceği bilinen bir gen aktif hale getirir. CLL mikroRNA ...

Burada, ilgilenilen bir transkripsiyon faktörünü hedefleyen küçük firkete (sh)RNA ile hücreleri transfekte ettikten sonra, kamuya açık verileri, hesaplama kaynaklarını ve mikroRNA dizilerinden elde edilen yüksek verimli verileri kullanarak, ilgilenilen bir transkripsiyon faktörünün mikroRNA transkriptomu üzerindeki etkisini incelemek için bir strateji öneriyoruz.

MikroRNA transcriptome bir transkripsiyon faktörü bağımlı regülasyonu açıklayan

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Bu metodolojinin genel amacı, ilgilenilen bir transkripsiyon faktörünün mikroRNA transkriptomunu nasıl düzenlediğini tanımlamaktır. Bu yöntem, protein kodlayan genlerin transkripsiyonunu modüle eden transkripsiyon faktörlerinin mikroRNA'ların transkripsiyonunda da rol oynayıp oynamadığına dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu metodolojinin temel avantajı; ilgilenilen transkripsiyon faktörünün aktivitesine bağımlı olan mikroRNA geni transkripsiyonlarının kapsamlı bir tanımını sağlamak için veri madenciliğini, laboratuvar verilerini ve biyoinformatik analizleri entegre etmesidir.Bu yöntem, mikroRNA gen transkripsiyonu ile transkripsiyon faktörü durumunun aktivitesi arasındaki etkileşime dair bilgi sağlayabilse de, bunun tanımlayıcı bir yöntem olduğunu ve böyle bir ilişkinin ek analizler kullanılarak doğrulanması gerektiğini unutmamak önemlidir. Başlamak için, kromatin immünopresipitasyon sekanslama verilerini çıkarmak amacıyla University of California Santa Cruz genom tarayıcısı gibi bir genom tarayıcısı açın. Siteye girdikten sonra üst menüye gidin, Araçlar'ı (Tools) seçin ve Tablo Tarayıcı'yı (Table Browser) açın.Burada gösterildiği gibi özellikleri ilgili kutucuklara girin ve ardından tabloyu çıkarmak için Get Output seçeneğini belirleyin. Çıktıyı bir metin dosyası olarak kaydedin. Daha sonra, dosyayı bir hesap tablosuna aktarın.Elektronik tablo programına geçildiğinde, isim sütunu sıralanmalı ve sonuçlar STAT2 gibi ilgi duyulan bir transkripsiyon faktörü için filtrelenmelidir. Ardından, H3K4me3 epigenetik imzalarına dayalı mikroRNA promotörleri listesi kopyalanmalı ve bir txt dosyasına yapıştırılmalıdır. Daha sonra, toplanan verileri eşlemek ve medyan bağlanma afinitesini belirlemek için ek veri dosyalarında sağlanan ve SQL ile yazılmış ek kod kullanılmalıdır.İlk olarak, 10 santimetrelik bir kaba 1,5 milyon HEK293 hücresi ekleyin ve %10 FBS ile takviye edilmiş DMEM ekleyin. Hücreleri yaklaşık %50 konfluense ulaşana kadar 24 saat boyunca kültüre edin. Ardından, medyayı değiştirin.Ardından, üretici talimatları doğrultusunda, hedef shRNA içeren beş mikrogram yeşil floresan protein Lentivirüsü ve beş mikrogram paketleme vektörü ile birleştirilmiş bir transfeksiyon ajanı ekleyin. Kontrol olarak, benzer bir hücre plağını scrambled shRNA ve paketleme vektörlerini kullanarak transfekte edin. Transfeksiyon karışımını hücreler üzerinde 16 saat inkübe edin ve ardından medyumu %10 FBS ile desteklenmiş 10 mililitre taze DMEM medyumu ile değiştirin.Transveksiyondan 48 saat sonra, ortamı hücrelerden uzaklaştırın. Ardından, enfeksiyöz süpernatantı toplamak için beş dakika boyunca santrifüjleyin. Yüzen hücreleri temizlemek için süpernatantı 0,45 mikronluk bir şırınga filtresinden süzün.Ardından, medyayı 100 kilodalton eşiğine sahip bir ultrasantrifüj filtre cihazına ekleyin. Lentivirüsü konsantre etmek için medyayı hacim 250 microliter'ın altına düşene kadar santrifüjleyin. Kalan sıvıyı bir kriyotüpe aktarın ve konsantre edilmiş virüsü ihtiyaç duyulana kadar minus 80 degrees Celsius'ta saklayın.Devam etmeye hazır olduğunuzda, dondurulmuş Lentivirüsü -80°C dondurucudan çıkarın ve tüpün oda sıcaklığına gelmesini sağlayın. Viral süpernatantın 100 µL'sini taze bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 900 µL serumsuz besiyeri ekleyin. Ardından, bir mL'lik virüs süspansiyonuna mL başına 10 ng heksadimetrin bromür ekleyin.Tüpü nazikçe karıştırın ve karışımı beş dakika boyunca bekletin. Planlanan her bir transduksiyon için beş milyon hücre toplayın ve ardından hücre peletini virüs içeren 0.5 mililitre medyumda nazikçe yeniden süspanse edin. Hücreleri 12 kuyucuklu bir plakaya aktarın ve dört ila 24 saat boyunca inkübe edin.Ardından, %20FBS içeren 0,5 milliliters ek besiyeri ekleyin. Transdüksiyondan 48 ila 72 saat sonra hücreleri hasat edin ve üretici talimatlarına göre propidyum iyodür ile boyayın. Boyama işleminden sonra hücreleri ışıktan koruyun ve GFP pozitif, propidyum iyodür negatif hücrelerin oranlarını ölçerek transveksiyon verimliliğini tahmin etmek için FACS kullanın.Ardından, sıralanmış GFP pozitif hücre popülasyonunu toplayın ve proteinlerini ekstrakte edin. Son olarak, hücrelerin belirlenen shRNA ile enfekte edilmesinden önce ve sonra hedeflemiş olduğunuz transkripsiyon faktörünün seviyelerini belirlemek için western blotting yöntemini kullanın. CLL hücrelerinin STAT3 shRNA ile transveksiyonundan sonra, hem STAT3 mRNA hem de STAT3 protein seviyeleri önemli ölçüde azalmıştır.Ek olarak, CLL hücrelerinde yapılan bir mikroRNA dizilemesi, STAT3 shRNA ile transfekte edilen CLL hücreleri ile boş vektör ile transfekte edilen CLL hücreleri arasında ekspresyonu anlamlı düzeyde farklılık gösteren 23 mikroRNA ortaya koymuştur. MikroRNA dizilemesinin sonuçları, burada gösterilen yedi gen için kantitatif RT-PCR kullanılarak doğrulanmıştır. Bu prosedürün ardından, bu transkripsiyon faktörünün belirli bir hedef genin promotörüne bağlandığını ve onu aktive ettiğini doğrulamak amacıyla kromatin immünopresipitasyonu, elektromobilite kayma analizi ve fark analizi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Bu videoyu izledikten sonra; biyoinformatik analizlerin, kamuya açık verilerin ve bir transkripsiyon faktörünün shRNA yaklaşımıyla susturulmasının, bu transkripsiyon faktörünün mikroRNA genlerinin ekspresyonunu nasıl düzenlediğini bulmak için nasıl entegre edileceğine dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

describing-transcription-factor-dependent-regulation-microrna

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Hedef Kimliği Kütüphane miRNA hedefleri belirlemek için kullanılan klonlanmış cDNA bir plazmid tabanlı, genom koleksiyondur. Burada kullanımı ve uygulama göstermektedir.

MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane Kullanımı miRNA Hedefler için genom Ekran

MicroRNA (miRNA'lar), gen ekspresyonu önemli düzenleyiciler ve çok sayıda biyolojik süreçlerin önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. MiRNA-UTR etkileşimleri daha iyi anlamak için, biz, bir roman luciferase geninin ve tahlil reaktif, LightSwitch sistemi ile eşleştirilmiş 3 UTR lusiferaz gazetecilere bir genom-geniş bir koleksiyon oluşturduk.

3&#39;UTR muhabiri oluşturur ve bir microRNA kullanarak LightSwitch Lusiferaz Test Sistemi ile İnsan microRNA belirlenmesi Hedefler yapışık hücrelere Mimik

Burada, spesifik mikroRNA'lara tamamlayıcı dizileri viral genoma dahil ederek picornavirüs tropizmini düzenlemek için bir yöntem açıklıyoruz.  Bu protokol, yaşam döngülerinin uzunluğuna ve doğasına bağlı olarak yapılan değişikliklerle tüm farklı virüs sınıflarına uyarlanabilir.

Picornavirüs tropizm MicroRNA tabanlı Yönetmelik

Bu rapor hücresel miRNAs mRNA hedefleri doğrulamak için hızlı ve güvenilir bir yöntem açıklanır. Sentetik biotinylated miRNA kilitli nükleik asit LNA tabanlı yakalamaya taklit eden yöntemi kullanır mRNA hedef. Daha sonra manyetik boncuklar streptavidin kaplı açılan için istihdam edilmektedir hedef mRNA qPCR polimeraz zincir reaksiyonu tarafından miktar için.

Biotin tabanlı açılan tahlil için Doğrula mRNA hedefleri hücresel miRNAs

Dört plazmidli in vitro hücrelerde kullanılmak üzere bir intronic mikroRNA biyogenez muhabir testi geliştirdik: biri intronic miRNA ile, biri hedefli, biri düzenleyici bir proteini aşırı eksprese etmek ve biri Renilla lusiferaz için. MiRNA işlendi ve hedef diziye bağlanarak lusiferaz ekspresyonunu kontrol edebildi.

Memeli Hücrelerinde Intronic mikroRNA Olgunlaşmasını Analiz Etmek İçin Bir Muhabir Testi

Burada örnek sınırlı miktarda çalışma, özellikle microRNA (miRNA) ekspresyon düzeyleri için bir maliyet ve zaman etkili yüksek verimli bir tarama aracı olarak mikroakışkan platformu ile birlikte optimize edilmiş bir multiplex ters transkriptaz kantitatif PCR (QRT PCR) protokolü açıklamak.

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

Tahribatsız ses görselleştirme sadece x-ray mikro bilgisayarlı tomografi (BT) en verimli olduğu tomografi teknikleri ile elde edilebilir.

Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme Ex-Vivo Biyolojik örnekler Micro CT

Bu indirgeyici ve oksidatif yarı-reaksiyonların her ikisi de araştırmak için bir durduruldu akış aletinin kullanımı...

Durduruldu-Akış Spektrofotometri kullanarak Flavin-Bağımlı monooksijenaz ve indirgeyici ve Oksidatif Yarı-Tepkime İzlenmesi

İnsan ve domuz: İki yüksek ölçüde homolog FVIII formlarının zara-bağlı yapısını çözmek için uygulanan Cryo-elektron mikroskobu, lipid nanoteknoloji, ve yapı analizleri bir arada mevcut. Helezonik negatif yüklü lipid nanotüpler (LNT) üzerine iki fonksiyonel rekombinant FVIII formları düzenlemek için laboratuvarda geliştirilen metodoloji açıklanmıştır.

Lipid Nanotüpler Kan Pıhtılaşma Faktör VIII Sarmal Organizasyonu

Bu yazıda veziküller, transkripsiyon ve çeviri makine kapsülleme ve protein üretiminin izlenmesi hazırlanması için basit bir yöntem tarif eder. Elde edilen hücre-içermeyen sistemler gittikçe daha karmaşık hücresel taklit oluşturmak için bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılabilir.

Hücresel Mimics İnşası için Veziküller Hücre-ücretsiz Transkripsiyon ve Çeviri Makine Sarma

Keşfedin transkripsiyon faktörlerinin mikroRNA transkriptomunu nasıl düzenlediğini biyoinformatik analiz, veri madenciliği ve shRNA ile sessizleştirme yöntemlerini kullanarak. Bu hesaplamalı yaklaşım, gen regülasyonu ve nörobilim araştırmalarında yeni içgörüler sağlar.

MikroRNA transcriptome bir transkripsiyon faktörü bağımlı regülasyonu açıklayan

Daha fazla video keşfet