Name: Vitro Tahlil Fosfatidiletanolamin Metiltransferaz Aktivite Tedbir (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T13:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Öğrenin, Leishmania hücre ekstrelerinde fosfatidiletanolamin metiltransferaz (PEMT) aktivitesini ölçmek için bu in vitro enzimatik yöntemi. Bu protokol, enzim saflaştırması gerektirmeden lipid metabolizması araştırmalarına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, NIH hibeleri ARRA RO3 AI078145 ve RZ'ye 1SC3GM113743 tarafından desteklenmiştir.

1. Hücre Özüt Hazırlama <ol><li> 20 mM HEPES pH7.4, 100 U / ml penisilin / ml streptomisin, 5 ug / ml heme 100 ug ile takviye edilmiş M199 1 x yapılmış bir ortam içinde 26 ° C &#39;de hava geçirmez kapak ile sızdırmaz steril plastik şişe Leishmania hücreleri büyümek çalkalamadan, 0.35 g / L NACO 2H, 0.1 mM adenin, ve 2 ug / ml biopterin. Bunlar 1-2 x 10 7 / ml&#39;lik bir hücre yoğunluğuna ulaştığında 4 ° C &#39;de 5 dakika süre ile 1500 g&#39;de santrifüje edilerek hücreler hasat. </li><li> Bir pipet ile süpernatant atılır ve soğuk fosfat tamponlu serum fizyolojik kültürün hacmi (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI yarısı bir serolojik pipet hücre topağın tekrar askıda bırakılmasıyla yıkama hücreleri, 10 mM Na-2 HPO 4, 1.8 mM KH 2 PO 4, pH 7.4). BL2 güvenlik kurallarına göre hücre süpernatantlar bertaraf edin. </li><li> Hücrelerin tekrar santrifüj 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 1500 g&#39;de. Bir pipet ile süpernatant atın. T Devamya da bir sonraki adıma o -80 ºC (üç ay) uzun süreli saklama için sıvı nitrojen içinde hücre pelletini dondurmak oturtun. </li><li> 2x lizis tamponu (0.5 M sukroz, 0.1 M TrisHCl, pH 7.5, 2 mM EDTA ve 2 x proteaz inhibitör kokteyli) hazırlayın ve buz üzerinde 4 ° C&#39;de tutun. </li><li> 2x lizis tamponu eşit hacimde (taze veya dondurulmuş) hücre pelletini. Cam boncuklar 1x hacmi ekleyin. Vorteks kuvvetli bir şekilde 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de. </li><li> 1x liziz tamponu 2 hacim ekleyin ve karıştırın. 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 1500 x g&#39;de santrifüjleyin hücre ekstreleri kesintisiz hücre ve çekirdeklerin: pelet. </li><li> Bir taze soğuk bir santrifüj tüpü içine pipetle aktarın ve süpernatant deney tamamlanana kadar buz üzerinde hücre ekstreleri tutun. </li></ol> 2. Bu tür Bikinkoninik Asit Testi Protein Tahmin Kiti Kullanımı Cep Özü Protein Konsantrasyon belirleyin <ol><li> Bisinkoninik asit hazırlanması (BCA) çözeltisi BCA ve bakır (II) karıştırılması ile (1 mL / tüp) s49 oranında ulfate: 1 (v / v). </li><li> Protein standartlarını hazırlayın 0, 10, 20, 30, 40, 50 ve BCA solüsyonun 1 ml&#39;lik alikolar içinde bir 10 mg / ml bovin serum albümini (BSA) stok solüsyonu seyreltilerek 60 ug / ml olmuştur. </li><li> Tekrarlardaki BCA çözeltisi 1 ml hücre ekstrelerinin 2 ul ekleyin. Önceden ısıtılmış 60 ° C su banyosu içinde 10 dakika için standartlar ve protein örnekleri inkübe edin. </li><li> Aktarım numuneler 3 dakika boyunca buz. 562 nm bir dalga boyunda bir spektrofotometre ile standart ve protein örnekleri absorbansı ölçülür. </li><li> Üreticinin protokolünde tarif edildiği gibi, bir referans olarak BSA standardı kullanılarak hücre ekstrelerinin protein konsantrasyonu hesaplanır. 1x lizis tamponu ile mi, 10 mg / bir protein konsantrasyonuna hücre ekstreleri seyreltilir. </li></ol> Tüp başına 200ul 3. Enzimatik Deneyi NOT: Bir kimyasal kaputu aşağıdaki adımları uygulayın. <ol><li> 15 ml nüsha halinde her bir numune test edinkonik tüp. Tüp başına 20 ul 1 M TrisHCl pH 7.5 hazırlayın ve buz üzerinde tutmak. Her bir tüp, oda sıcaklığında, (çözelti durdurma 1 (h / h) 1) kloroform / metanol 2 ml hazırlayın. </li><li> Pipet, buz üzerinde, her 15 ml konik bir tüp içinde 1 M TrisHCl pH 7.5, 20 ul. </li><li> Burada radyasyon güvenlik kurallarına uyun. SAM 50,06 uM toplam tüp başına [metil- 3 H] adenosil-L-metionin ve 50 uM soğuk SAM - 0.06 uM (0.2 uCi), S eşdeğer ekleyin. Soğuk su ul x ekle x = 200- (20 (+ hücre ekstreleri için 20 () + soğuk ve radyoaktif SAM hacmi) tamponu için) tüp başına. </li><li> Önceden ısıtılmış 30 ºC su banyosunda her konik tüp aktarın. Reaksiyonu başlatmak için her bir tüpe, hücre ekstreleri (proteinin 200 ug eşdeğer) 20 ul ekle. İstediğiniz zaman (0-45 dakika) inkübe edin. </li><li> Kloroform / metanol 2 ml ilave ederek reaksiyonu durdurun (1: 1; v / v; durdurma çözeltisi) her tüpe. (Oda sıcaklığına 20-25 konik tüp transfer6 ° C). </li></ol> 4. Lipid Ekstraksiyon NOT: Bir kimyasal kaputu aşağıdaki adımları uygulayın. <ol><li> Enzimatik reaksiyon örneğini içeren her tüpe su 700 ul ekle. Kuvvetlice 30 saniye boyunca girdap. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1500 x g&#39;de santrifüjleyin su fazının organik ayırmak için. </li><li> Bir pipet yardımıyla yeni bir 15 ml konik tüp içine alt organik fazı aktarın. 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde boru ve vorteks içeren her &quot;düşük değerli faz&quot; su 1 ml ilave edilir. Tekrar santrifüj 5 dakika boyunca 1500 x g&#39;de su fazının organik ayırmak için. </li><li> Bir pipet, bir sintilasyon tüpüne alt organik faz transfer edin. N2 akışı altında kuru örnekleri. Olmayan anonim radyoaktif SAM ve radyasyon kurallarına göre radyoaktif konik tüpler içeren su fazları bertaraf edin. </li><li> 2 ml / sintilasyon sıvısı tüp ekleyin. Bir sintilasyon cou ile radyoaktiviteyi ölçünnter üreticilerin protokol ve enstrümanın kullanıma göre. </li><li> Aşağıdaki genel denklemi kullanarak nmol / mg protein enzimatik aktivite hesaplanır cpm x değeri 10 3 x [SAM (mM) &#39;nin toplam (radyoaktif ve soğuk) konsantrasyonu], radyoaktif SAM (Ci / mmol) x x 5 spesifik aktivitesi [radyoaktif SAM konsantrasyonu (mM)] Not: Yukarıdaki protokole bağlı SAM konsantrasyonu ya da bir protein bağlı PEMT tahlili için değiştirilebilir. SAM, konsantrasyona bağlı enzimatik deney için, zaman ise, protein bağlı PEMT tahlilinde, SAM konsantrasyonu için tahlil eklenir sabit (lineer aralığında 15 dakika) ve soğuk SAM çeşitli miktarlarda tutulur (biz mM 0.05 seçtik) ve zaman sabiti (15 dakika) tutulur. Ayrıca tampon çözeltisinin pH değeri, bazı PEMT enzimler farklı optimal pH değerine sahip olması gerektiği gibi değiştirilebilir. </li></ol>

<ol><li>Keogh, M. R., Courtney, P. D., Kinney, A. J., Dewey, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+phospholipid+N-.methyltransferases+from+Arabidopsis+and+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of phospholipid N-.methyltransferases from Arabidopsis and soybean.</a> J Biol Chem. 284 (23), 15439-15447 (2009).</li>
<li>Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+biosynthesis+and+function+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria.</a> Biochim Biophys Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+lipogenesis+in+white+adipose+tissue+contributes+to+the+resistance+to+high+fat+diet-induced+obesity+in+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Decreased lipogenesis in white adipose tissue contributes to the resistance to high fat diet-induced obesity in phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase-deficient mice.</a> Biochim Biophys Acta. 1851 (2), 152-162 (2015).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+alters+plasma+VLDL+phospholipids+and+attenuates+atherosclerosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase alters plasma VLDL phospholipids and attenuates atherosclerosis in mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (9), 1349-1355 (2009).</li>
<li>Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+methylation+in+mammals%3A+from+biochemistry+to+physiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Phospholipid methylation in mammals: from biochemistry to physiological function.</a> Biochim Biophys Acta. 1838 (6), 1477-1487 (2014).</li>
<li>Nishimaki-Mogami, T., Suzuki, K., Takahashi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+phosphatidylethanolamine+methylation+in+the+secretion+of+very+low+density+lipoproteins+by+cultured+rat+hepatocytes%3A+rapid+inhibition+of+phosphatidylethanolamine+methylation+by+bezafibrate+increases+the+density+of+apolipoprotein+B48-containing+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The role of phosphatidylethanolamine methylation in the secretion of very low density lipoproteins by cultured rat hepatocytes: rapid inhibition of phosphatidylethanolamine methylation by bezafibrate increases the density of apolipoprotein B48-containing lipoproteins.</a> Biochim Biophys Acta. 1304 (1), 21-31 (1996).</li>
<li>Noga, A. A., Zhao, Y., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+requirement+for+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+in+the+secretion+of+very+low+density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An unexpected requirement for phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase in the secretion of very low density lipoproteins.</a> J Biol Chem. 277 (44), 42358-42365 (2002).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+repression+of+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+%28PEMT%29+in+BRCA1-mutated+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Epigenetic repression of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase (PEMT) in BRCA1-mutated breast cancer.</a> Oncotarget. 5 (5), 1315-1325 (2014).</li>
<li>Cui, Z., Houweling, M., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+rat+hepatoma+cell+growth+by+expression+of+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Suppression of rat hepatoma cell growth by expression of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase-2.</a> J Biol Chem. 269 (40), 24531-24533 (1994).</li>
<li>Cui, Z., Shen, Y. J., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+correlation+between+expression+of+phosphatidylethanolamine.N-.methyltransferase-2+and+growth+rate+of+perinatal+rat+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Inverse correlation between expression of phosphatidylethanolamine.N-.methyltransferase-2 and growth rate of perinatal rat livers.</a> Biochim Biophys Acta. 1346 (1), 10-16 (1997).</li>
<li>Minder, A. C., de Rudder, K. E., Narberhaus, F., Fischer, H. M., Hennecke, H., Geiger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+levels+in.Bradyrhizobium+japonicum.+membranes+are+critical+for+an+efficient+symbiosis+with+the+soybean+host+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine levels in.Bradyrhizobium japonicum. membranes are critical for an efficient symbiosis with the soybean host plant.</a> Mol Microbiol. 39 (5), 1186-1198 (2001).</li>
<li>Kodaki, T., Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+phosphatidylethanolamine+methylation+pathway.+Cloning+and+characterization+of+two+distinct+methyltransferase+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast phosphatidylethanolamine methylation pathway. Cloning and characterization of two distinct methyltransferase genes.</a> J Biol Chem. 262 (32), 15428-15435 (1987).</li>
<li>Tanaka, Y., Amano, F., Maeda, M., Nishijima, M., Akamatsu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+phosphatidyl-N-.monomethylethanolamine+N-.methyltransferase%2C+the+enzyme+catalyzing+the+second+and+the+third+steps+in+the+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+system%2C+from+mouse+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Med+Sci+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of phosphatidyl-N-.monomethylethanolamine N-.methyltransferase, the enzyme catalyzing the second and the third steps in the phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase system, from mouse liver microsomes.</a> Jpn J Med Sci Biol. 43 (3), 59-73 (1990).</li>
<li>Bibis, S. S., Dahlstrom, K., Zhu, T., Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Leishmania+major+phosphatidylethanolamine+methyltransferases+LmjPEM1+and+LmjPEM2+and+their+inhibition+by+choline+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Leishmania major phosphatidylethanolamine methyltransferases LmjPEM1 and LmjPEM2 and their inhibition by choline analogs.</a> Mol Biochem Parasitol. 196 (2), 90-99 (2014).</li>
<li>deRudder, K. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizobium+meliloti.+mutants+deficient+in+phospholipid+N-.methyltransferase+still+contain+phosphatidylcholine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rhizobium meliloti. mutants deficient in phospholipid N-.methyltransferase still contain phosphatidylcholine.</a> J Bacteriol. 179 (22), 6921-6928 (1997).</li>
<li>Aktas, M., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+the+enzyme+properties+of+the+phospholipid+N-.methyltransferase+PmtA+from+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of the enzyme properties of the phospholipid N-.methyltransferase PmtA from Agrobacterium tumefaciens.</a> J Bacteriol. 191 (7), 2033-2041 (2009).</li>
<li>Ridgway, N. D., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase from rat liver.</a> Methods Enzymol. 209, 366-374 (1992).</li>
<li>Gaynor, P. M., Carman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylethanolamine+methyltransferase+and+phospholipid+methyltransferase+activities+from+Saccharomyces+cerevisiae.+Enzymological+and+kinetic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylethanolamine methyltransferase and phospholipid methyltransferase activities from Saccharomyces cerevisiae. Enzymological and kinetic properties.</a> Biochim Biophys Acta. 1045 (2), 156-163 (1990).</li>
<li>Arondel, V., Benning, C., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+expression+in+Escherichia+coli.+of+a+gene+encoding+phosphatidylethanolamine+methyltransferase+%28EC+2.1.1.17%29+from+Rhodobacter+sphaeroides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional expression in Escherichia coli. of a gene encoding phosphatidylethanolamine methyltransferase (EC 2.1.1.17) from Rhodobacter sphaeroides.</a> J Biol Chem. 268 (21), 16002-16008 (1993).</li>
<li>Wessel, M., Klusener, S., Godeke, J., Fritz, C., Hacker, S., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+Agrobacterium+tumefaciens.+requires+phosphatidylcholine+in+the+bacterial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Virulence of Agrobacterium tumefaciens. requires phosphatidylcholine in the bacterial membrane.</a> Mol Microbiol. 62 (3), 906-915 (2006).</li>
<li>Klusener, S., Aktas, M., Thormann, K. M., Wessel, M., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+physiological+relevance+of+Agrobacterium+tumefaciens.+phosphatidylcholine+biosynthesis+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Expression and physiological relevance of Agrobacterium tumefaciens. phosphatidylcholine biosynthesis genes.</a> J Bacteriol. 191 (1), 365-374 (2009).</li>
<li>Henderson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+the+gene+encoding+Leishmania+donovani.S.-adenosylhomocysteine+hydrolase%2C+a+potential+target+for+antiparasitic+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Cloning of the gene encoding Leishmania donovani.S.-adenosylhomocysteine hydrolase, a potential target for antiparasitic chemotherapy.</a> Mol Biochem Parasitol. 53 (1-2), 169-183 (1992).</li>
<li>Koszalka, G. W., Krenitsky, T. A. 5'-Methylthioadenosine (MTA) phosphorylase from promastigote of Leishmania donovani. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoszalka%2C+GW+%22Purine+and+Pyrimidine+Metabolism+in+Man+V%2C+Adv+Exp+Med+Biol%22">Purine and Pyrimidine Metabolism in Man V, Adv Exp Med Biol</a>. Nyhan, W. L., Thompson, L. F., Watts, R. W. E. 131, Springer US. 559-563 (1986).</li>
<li>Biastoff, S., Teuber, M., Zhou, Z. S., Dräger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+activity+measurement+of+a+recombinant+putrescine+N.-methyltransferase+from+Datura+stramonium%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Med%22%5BJournal%5D)">Colorimetric activity measurement of a recombinant putrescine N.-methyltransferase from Datura stramonium.</a> Planta Med. 72 (12), 1136-1141 (2006).</li>
<li>Hendricks, C. L., Ross, J. R., Pichersky, E., Noel, J. P., Zhou, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+colorimetric+assay+for+S.-adenosylmethionine-dependent+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled colorimetric assay for S.-adenosylmethionine-dependent methyltransferases.</a> Anal Biochem. 326 (1), 100-105 (2004).</li>
<li>Cannon, L. M., Butler, F. N., Wan, W., Zhou, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stereospecific+colorimetric+assay+for+%28S.%2CS.%29-adenosylmethionine+quantification+based+on+thiopurine+methyltransferase-catalyzed+thiol+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A stereospecific colorimetric assay for (S.,S.)-adenosylmethionine quantification based on thiopurine methyltransferase-catalyzed thiol methylation.</a> Anal Biochem. 308 (2), 358-363 (2002).</li>
<li>Hoffman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+analysis+of+the+chiral+and+covalent+instability+of+S.-adenosyl-L-methionine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chromatographic analysis of the chiral and covalent instability of S.-adenosyl-L-methionine.</a> Biochemistry. 25 (15), 4444-4449 (1986).</li>
<li>Wu, S. E., Huskey, W. P., Borchardt, R. T., Schowen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+instability+at+sulfur+of+S.-adenosylmethionine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chiral instability at sulfur of S.-adenosylmethionine.</a> Biochemistry. 22 (12), 2828-2832 (1983).</li>
<li>Dorgan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+continuous+spectrophotometric+assay+for+S.-adenosylmethionine-dependent+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for S.-adenosylmethionine-dependent methyltransferases.</a> Anal Biochem. 350 (2), 249-255 (2006).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması ilan

Bu basit, pratik PEMT tahlil, bir protein kaynağı olarak bütün hücre ekstresi kullanarak PE üzerine SAM radyoaktif metil gruplarının transferi sonucu PE metillenmiş formlarının ölçümü sağlar. Bu, hızlı, hassas ve tekrarlanabilir ve saflaştırılmış enzimler 17 için de uygundur. Ilgi metiltransferaz yerine PE 12,13,18,19 daha Bu yüzeylerde özgü olup olmadığını monometil veya dimetil-PE tahlilinde eklenebilir. Saflaştınldı PEMT enzim kullanılırsa, PE tahlilinde eklenebilir. Bu protokolün bir sınırlama ...

Fosfatidiletanolamin metiltransferaz (PEMT) PEMT enzimler monometil-PE, dimetil-PE ve / veya vermek için PE, monometil-PE veya dimetil-PE üzerine metil grubu donörü S -adenosylmethionine (SAM) ile bir veya daha fazla metil grubu kovalent bağlanmasını katalize eden bir fosfatidilkolin (PC). Bu enzimler, hayvan hücreleri ve mantarlar hemen hemen her zaman görülmektedir. Ayrıca, bazı bitkilerin 1 ve bakterilerin yaklaşık% 10, ökaryotlarda 2 ile etkileşim özellikle bulunabilir. PEMTs değil, aynı zamanda diğer önemli hücresel fonksiyonları yerine getirerek hayvan hücrelerinde ana lipid sınıf PC, üretimine katkıda bulunarak hücre biyolojisine alakalı. Memelilerde, PEMTs esas olarak çok düşük yoğunluklu lipoprotein normalin üzerinde bir salgılama için gerekli olan karaciğer olarak ifade edilmiştir ve ayrıca diyet indükte obeziteye 3, ateroskleroz 4 katkıda bulunur ve insülin karşıance 5. Buna ek olarak, bir memeli PEMT da her ne kadar düşük seviyelere, adipositler ile ifade edilmiştir ve yağ depolanması 6, 7 katılırlar. Kanser gelişimi 8, 9 apoptoz ve hücre büyümesi 10&#39;da PEMT rolü de ortaya konmuştur. Bakterilerde PEMT enzimler ana bitki 11, normal hücre çoğalması 2, virülans 2 ve simbiyoz için önemli olduğu gösterilmiştir. Mevcut protokolün amacı ve gerekçesi enzimi arındırmak gerek kalmadan bütün hücre ekstrelerinden PEMT aktivitesini ölçmektir. İki farklı protokoller PEMT aktivitesini ölçmek için, geliştirilmiştir. İlk ve en yaygın olanı, bu makalenin konusu olan PE, üzerine radyoaktif SAM trityumlu metil grubunun transferini ölçer. Bu protokol, ilk olarak bir underst elde etmek için maya 12 ve memeli hücrelerinde (karaciğer) 13 den PEMT aktivitesini ölçmek için, geliştirilmiştirBu hücrelerde PC biyosentezinin anding yanı sıra, bu enzim özgüllüğünü belirlemek için. Daha sonra, bu teknik ve tek hücreli parazitlerin 14 (15 olsa deneyi için bir bazik pH değeri kullanılarak) bu tür bakteri 2 gibi diğer hücre tiplerinde uygulanmıştır. Bu teknik, bütün hücre hülasaları hem de saflaştırılmış enzim ile birlikte kullanılabilir ve potansiyel olarak herhangi bir hücre ekstresi sistemine uygulanabilir. Olmayan bir radyoaktif deneyi de S -adenosylhomocysteine, SAM 16 metillenmenin ürünün enzimatik miktarının dayandığı dizayn edilmiştir. Bu radyoaktivite içermeyen olarak ikinci deney daha uygun olabilir ancak saflaştınldı enzimler için uygundur.

<table><tbody><tr><td>S- [Metil-3H] adenosil-L-metiyonin (5-15 Ci / mMole'un spesifik aktivitesi)</td> <td>Perkin Elmer</td><td>NET155050UC</td><td>Reaktifi aliquot ve -20 ° C'de dondurun; C; Bu reaktif</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Roche Life Sciences'ı</td> kullanırken radyasyon güvenliği yönergelerine uyun <td>11836170001</td><td>taze olarak seyreltin&nbsp;</td></tr><tr><td>Cam boncuklar, asitle yıkanmış, 425-600 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Bikinkoninik asit çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9643</td><td></td></tr><tr><td>Bakır (II) sülfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2284</td><td></td></tr><tr><td>Sintilasyon sayacı MicroBeta2, 1 dedektörlü</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>2450-0010</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre Biomate 3</td><td>Thermo Scientific</td><td>840208300</td><td></td></tr><tr><td>BSA stok çözeltisi (10 mg / ml)</td> <td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Sintilasyon sıvısı&nbsp;</td><td>Araştırma Ürünü International Corp</td><td>111198</td><td></td></tr><tr><td>S- (5'-Adenosil) -L-metiyonin klorür (hidroklorür) &nbsp;</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13956</td><td>, reaktifi 20 mM HCl'de seyreltin ve alikotları -80 ° C'de dondurun; C&nbsp;</td></tr></tbody></table>

vitro tahlil fosfatidiletanolamin metiltransferaz aktivite tedbir

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Fosfatidiletanolamin metiltransferazlar, bir veya daha fazla metil grubunun (gruplarının) S-adenosil-L-metiyoninden fosfatidiletanolamin, monometil-fosfatidiletanolamin veya dimetil-fosfatidiletanolamin üzerine transferini katalize eden biyosentetik enzimlerdir. Bu enzimler hayvan hücrelerinde, mantarlarda her yerde bulunur ve ayrıca bakterilerin yaklaşık% 10'unda bulunur. İnsülin direnci, diyabet, ateroskleroz, hücre büyümesi veya virülans gibi lipid metabolizmasındaki doğrudan rollerinin ötesinde hücre fizyolojisinde çeşitli önemli işlevleri yerine getirirler. Bu el yazması, bir enzim kaynağı olarak tam hücre ekstraktları kullanılarak tritiye metil gruplarının S-[Metil-3H]adenosil-L-metiyoninden fosfatidiletanolamin üzerine transferini ölçen basit bir hücresiz enzimatik test hakkında rapor vermektedir. Elde edilen metillenmiş fosfatidiletanolamin formları hidrofobiktir ve bu nedenle organik ekstraksiyon ile suda çözünür S- [Metil-3H] adenosil-L-metiyoninden ayrılabilir. Bu test potansiyel olarak diğer hücre tiplerine uygulanabilir ve enzimi saflaştırmaya gerek kalmadan ilgilenilen bir fosfatidiletanolamin metiltransferaza özgü inhibitörleri/ilaçları test etmek için kullanılabilir.

Şekil 1, bir alt-tabaka olarak endojen PE kullanılarak, bir enzim kaynağı olarak Leishmania bütün hücre ekstresi ile gerçekleştirildiği zamana bağlı PEMT deneyi göstermektedir. Organik faz içinde radyoaktivite miktarı, sintilasyon sayımı ile nicelendirildi. Elde edilen PE numaraları üzerine transfer tritiye metil gruplarının miktarını hesaplamak için kullanıldı. PEMT aktivitesi yaklaşık 20 dakika boyunca doğrusal olmuştur. Daha sonra, başka bir 15 dakika boyunca...

Mevcut rapor, Leishmania hücre ekstraktları kullanılarak fosfatidiletanolamin metiltransferaz aktivitesini ölçmek için in vitro enzimatik bir testi açıklamaktadır. Bu tahlil, bir radyoaktif metil grubunun S- [Metil-3H] adenosil-L-metiyoninden endojen fosfatidiletanolamin üzerine transferine dayanmaktadır.

Vitro Tahlil Fosfatidiletanolamin Metiltransferaz Aktivite Tedbir

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Bu metodolojinin genel amacı, tüm hücre ekstraktlarından fosfatidiletanolamin metiltransferaz veya PEMT aktivitesini nicelleştirmektir. Bu yöntem ile fosfatidilkolin biyosentezinde fosfatidiletanolamin metiltransferazların önemi gibi lipid metabolizması alanındaki temel sorulara yanıt vermemiz mümkün olmaktadır. Bu protokolün temel avantajı, ölçümün tüm hücre ekstraktı üzerinden yapılabilmesi ve enzimin saflaştırılmasını gerektirmemesidir.Böylece bu protokol, parazitlerin en bol bulunan lipidi olan fosfatidilkolini nasıl sentezlediklerine dair bazı bilgiler sağlayabilir. Bu protokol, memeli hücreleri ve bakteriler gibi diğer hücre tiplerine de uygulanabilir. Leishmania hücrelerinin, desteklenmiş M199 medyumunda, çalkalama olmadan, 26 °C'de, hava sızdırmaz bir kapakla kapatılmış steril plastik bir şişede büyütülmesi.Hücreleri 4 °C'de, beş dakika boyunca 1500G'de santrifüj ederek toplayın. Bu işlem, hücre yoğunluğu mililitre başına 10 ila 20 milyon hücreye ulaştığında gerçekleştirilmelidir. Süpernatant bir pipetle alındıktan sonra, hücre peletini serolojik bir pipetle kültür hacminin yarısı kadar soğuk fosfat tamponlu salin içinde yeniden süspanse ederek hücreleri yıkayın.Hücreleri tekrar 4 °C'de, 1550G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı bir pipet yardımıyla uzaklaştırın. Bir sonraki adıma geçin veya hücre peletini -80 °C'de uzun süreli saklama için sıvı azot ile şok dondurun.Ardından, hücre peletini eşit hacimde 2X liziz tamponu ile yeniden süspande edin. 1X hacminde cam boncuk ekleyin ve dört derece Celsius'ta 10 dakika boyunca kuvvetlice vorteksleyin. İki hacim 1X liziz tamponu ekleyin ve karıştırın.Ardından, parçalanmamış hücreleri ve çekirdekleri çöktürmek için hücre ekstraktlarını 1500G'de ve dört derece Celsius'ta 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı bir pipet yardımıyla yeni ve soğuk bir santrifüj tüpüne aktarın ve deney tamamlanana kadar hücre ekstraktlarını buz üzerinde bekletin. Bir mililitre bisinkoninik asit çözeltisine iki mikrolitre hücre ekstraktı ekleyin ve işlemi tekrarlayın.Standartları ve protein örneklerini önceden ısıtılmış 60 derece Celsius'lik bir su banyosunda 10 dakika boyunca inkübe edin. Örnekleri üç dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Standartların ve protein örneklerinin absorbanslarını bir spektrofotometre ile 562 nanometre dalga boyunda ölçün.Üretici protokolünde açıklandığı şekilde, sığır serum albümini standardını referans alarak hücre ekstraktlarının protein konsantrasyonunu hesaplayın. Hücre ekstraktlarını 1X liziz tamponu ile 10 mg/mL protein konsantrasyonuna seyreltin. Bir kimyasal çeker ocakta, her örneği ve düplikasyonunu 15 mL'lik konik tüplerde test edin.Her tüp için 20 µL 1 M TrisHCL pH 7.5 hazırlayın ve buz üzerinde muhafaza edin. Ayrıca her tüp için oda sıcaklığında iki mililitre kloroform metanol durdurma çözeltisi hazırlayın. Buz üzerindeki her bir 15 mililitrelik konik tüpe 20 µL 1 M TrisHCL pipetleyin.Ardından, radyasyon güvenliği kılavuzlarını takip ederek, tüp başına eşdeğer olarak 0,06 µM trityumlanmış SAM ve 50 µM soğuk SAM ekleyerek toplam 50,06 µM SAM sağlayın. Bu noktada, her tüpe metin protokolüne göre hesaplanmış miktarda soğuk su ekleyin. Her konik tüpü önceden ısıtılmış 30 °C'lik bir su banyosuna aktarın.Reaksiyonu başlatmak için her tüpe 20 microliters hücre ekstresi ekleyin. Numuneleri istenen süre boyunca inkübe edin. Her tüpe iki milliliters kloroform metanol ekleyerek reaksiyonu durdurun.Konik tüpleri oda sıcaklığına getirin. Kimyasal çeker ocak altında çalışarak, enzimatik reaksiyon örneği içeren her tübe 700 microliters su ekleyin. 30 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin.Ardından, organik fazı su fazından ayırmak için oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1500g'de santrifüjleyin. Alt fazı aktarırken, analiz hesaplamalarını saptıracağı için su fazından hiçbir miktar almamak kritik önem taşır. Alt organik fazı yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarmak için bir pipet kullanın.Alt faz içeren her tüpe bir mililitre su ekleyin ve 30 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin. Ardından, organik fazı su fazından ayırmak için 1500G'de beş dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. Alt organik fazı bir pipet yardımıyla sintilasyon tüpüne aktarın.Numuneleri bir nitrojen gazı akımı altında kurutun. İnkorpore olmamış radyoaktif SAM içeren su fazlarını ve radyoaktif konik tüpleri radyasyon kılavuzlarına uygun olarak bertaraf edin. Ardından, tüp başına iki mililitre sintilasyon sıvısı ekleyin.Üretici protokolüne ve kullanılan cihazlara uygun olarak, bir sintilasyon sayacı ile inklüde edilen radyoaktiviteyi ölçün. Metin protokolünde yer alan denklemi kullanarak enzimatik aktiviteyi protein miligramı başına nanomol cinsinden hesaplayın. Burada, endojen PE'nin substrat olarak kullanıldığı ve enzim kaynağı olarak Leishmania tüm hücre ekstraktı ile gerçekleştirilen zamana bağlı bir PEMT analizi gösterilmektedir.Organik fazdaki radyoaktivite miktarı sintilasyon sayımı ile belirlenmiş ve PE'ye aktarılan trityumlanmış metil gruplarının miktarını hesaplamak için kullanılmıştır. PEMT aktivitesi yaklaşık 20 dakika boyunca lineer seyretmiştir. Ardından yaklaşık 30. dakikada bir platoya ulaşmış ve sonrasında 15 dakika daha sabit kalmıştır. Beklendiği üzere, hücre ekstraktları eklenmediğinde PEMT aktivitesi saptanmamış, hücre ekstraktları analize eklendiğinde ise saptanmıştır.Ayrıca, bu aktivite, leishmania major fosfatidiletanolamin metiltransferazları LMJ PEM One ve LMJ PEM two'nun spesifik bir inhibitörü olan 100 micromolar oktadesiltrimetilamonyum bromür varlığında ortadan kalkmıştır. PEMT aktivitesi ayrıca protein konsantrasyonuna bağımlıydı ve bu aktivite, enzimatik analiz için uygulanan protein miktarı ile doğrusal olarak orantılıydı. Son olarak, artan SAM konsantrasyonlarının test edildiği, SAM konsantrasyonuna bağımlı bir PEMT analizi gerçekleştirilmiştir.PEMT aktivitesi, yaklaşık 0,5 mM SAM konsantrasyonunda bir platoya ulaştı. Örnek sayısına bağlı olarak, bu protokol üç ila beş saat içinde tamamlanabilir. Bu protokol uygulanırken, bileşiğin kararsız olması nedeniyle yakın zamanda satın alınmış SAM kullanılması oldukça önemlidir.Patojenler ve radyaktivite ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu nedenle, güvenlik kılavuzlarına uymak ve uygun laboratuvar ekipmanları kullanmak önemlidir.

in-vitro-assay-to-measure-phosphatidylethanolamine-methyltransferase

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol hazırlanması için sentetik bir tRNA substrat...

Entamoeba histolytica DNA ve tRNA Metiltransferaz Dnmt2 (Ehmeth) Enzim ile in vitro tRNA Metilasyon Testi

Bu videoda, radyoaktif işaretli nükleotidler kullanarak pirofosfokinaz aktivitesini belirlemek için ince tabaka kromatografisi tabanlı bir enzim testi gösterilmektedir. Yöntem, nükleotid sentezi ve fosfotransfer reaksiyonları hakkında bilgi sağlar.

İnce Tabaka Kromatografisine Dayalı Enzim Aktivitesi Deneyi: İnce Tabaka Kromatografisi Kullanılarak İn Vitro Pirofosfokinaz Aktivitesini Belirleme Tekniği

Protein arginin metilasyonu, diğer bir deyişle, enzimler sınıfı tarafından katalizlenmektedir. Protein arjinin metil transferaz (PRMTs), proteinler içindeki arginines metil grup (lar) ilave enzimatik işlemidir. In vitro deney, metilasyon, bilinen veya yeni PRMT substratların metilasyon durumunu değerlendirmek için en güvenilir bir araçtır.

In vitro Metilasyona Tahlil Protein Arginin metilasyon Okuyacak

in vitro ATPase aktivitesini ölçmek için temel bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, belirli bir saflaştırılmış ATPaz için aktivite düzeyine ve gereksinimlere göre optimize edilebilir.

ölçme<em&gt; İn Vitro</emEnzimatik Karakterizasyonu için&gt; ATPaz Aktivitesi

Önceden klinik test için "yetim" ilaçların farmakolojik chaperones tekrarlanabilir, hızlı ve verimli olarak adlandırılan yeni bir sınıf yapmak için bir talep var. Biz uygun hastalar için hem de roman farmakolojik refakatçi uyuşturucu ekran basit, yüksek standart ve çok yönlü hücre kültür tabanlı tahlil geliştirilmiştir.

Vitro Enzim ölçüm Test farmakolojik refakatçi yanıt Fabry ve Pompe hastalığı için

Burada, histidin öğesini pyrophosphokinase enzimler arındırıcı ve ince tabaka Kromatografi radiolabelled yüzeylerde ve ürünler için enzimatik aktivite içinde vitrotahlil kullanan bir yöntem açıklanmaktadır. Enzim etkinliği tahlil herhangi bir kinaz, nükleotit cyclase veya nükleotid trifosfat hidroliz olan mekanizma içerir fosfor-devret tepki genel olarak geçerlidir.

Bir arınma ve In Vitro etkinliği tahlil için (p) ppGpp sentetaz Clostridium difficile üzerinden

Burada, sentetik veya in vitro transkripsiyonu RNA üzerinde metiltransferaz aktivitesinin doğrudan analizi için antikor içermeyen bir in vitro tahlil açıklanmıştır.

RNA metiltransferaz aktivite analizi için Antibody Içermeyen tahlil

Burada membrana bağlı pirofosfataz (Thermotoga maritimadan) inhibitörleri için 96 kuyu plaka biçiminde mobibdenum mavi reaksiyonu dayalı bir tarama yöntemi salıyoruz.

Thermotoga maritima Membran Bağlı Pirofosfataz Inhibitörleri için tarama

Palmitoylation geri dönüşümlü bir şekilde hedef proteinlerin sistein artıkları için 16 karbon palmitate moiety dahil gerektirir. Burada, fare beyin lysates ilgi herhangi bir protein palmitoylation durumunu araştırmak için, bir biyokimyasal yaklaşım, asil-PEGyl değişim jel vardiya (APEGS) tsay açıklar.

Beyin Zarı Proteinlerinin Palmitoylarasyonunun Kantitatif Tayini için Acyl-PEGyl Exchange Jel Shift Tayini

Burada, diyasilgliseril peptid ve alkin-fosfolipitleri klik-kimyası ile substrat olarak kullanarak apolipoprotein N-asiltransferaz aktivitesini izlemek için hassas bir floresan testi sunulmaktadır.

Enzim Karakterizasyonundan Yüksek Verimli Taramaya Kadar Apolipoprotein N-asiltransferaz için Click-Kimya Tabanlı Florometrik Analiz

DNA metiltransferazlar potansiyel kanser ilaç hedefleridir. Burada, DNA metiltransferaz inhibisyonu için küçük molekülleri değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlil, DNA metilasyonunu floresan üretimine bağlamak için bir endonükleaz kullanır ve enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

Öğrenin, Leishmania hücre ekstrelerinde fosfatidiletanolamin metiltransferaz (PEMT) aktivitesini ölçmek için bu in vitro enzimatik yöntemi. Bu protokol, enzim saflaştırması gerektirmeden lipid metabolizması araştırmalarına olanak tanır.

Vitro Tahlil Fosfatidiletanolamin Metiltransferaz Aktivite Tedbir

Daha fazla video keşfet