Name: Korteks, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- ve Striatum özgü In Utero C57BL / 6 Fare Elektroporasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Öğrenin, C57BL/6 farelerde korteks, hipokampus, talamus ve hipotalamus gibi merkezi sinir sistemi bölgelerine in utero elektroporasyon yöntemiyle hücre manipülasyonu. Bu teknik, genetiği değiştirilmiş fare üretmeden hızlı ve verimli transfeksiyon sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teknik, Melanie Pfeifer ve Nikolai Schmarowski (Mikroskobik Anatomi ve Nörobiyoloji Enstitüsü, Mainz Üniversitesi Tıp Merkezi) tarafından desteklenmiştir.

Etik Beyanı: Farelerde ve deneysel prosedürlerin işleme hayvan bakımı için, Avrupa, ulusal ve kurumsal kurallara uygun olarak yapılmıştır. 1. Giriş Utero Elektroporasyon Not: Daha önce 12,14 yayınlanan utero elektroporasyon gerçekleştirildi. Bu nedenle, yöntem aşağıdaki (Şekil 1) kısaca tarif okunur. <ol><li> Hazırlıklar <ol><li> Daha önce açıklandığı gibi 12 (1,5 pCAGGS içeren) Hızlı Yeşil renkli endotoksin içermeyen gelişmiş transfeksiyon dereceli plazmid çözüm hazırlayın. </li><li> Enjeksiyonlar için (35 ° açı) borosilikat cam kılcal (0,8-0,9 çap) çekin ve eziyet. </li><li> Aletleri sterilize edin. </li></ol></li><li> Cerrahlık <ol><li> Ameliyat öncesi analjezikler (karprofen, 4 mg / kg vücut ağırlığı, sc, 24 saat depo) en az 30 dakika uygulayın. </li><li> Uzunluğunu tutun(- cerrahi anestezi aşaması guedel 15&#39;e göre - Evre III maksimal 25-30 dakika) 35-45 dakika arasında en fazla anestezi. </li><li> (: Maske ile% 2.8, ameliyat:% 2.5 indüksiyon bir odasında) izofluran ile zamanlanmış hamile fareler anestezi. Ayak tutam yanıtsızlık ile anestezi onaylayın. </li><li> Anestezi sırasında göz kuruluğu önlemek için göz merhemi sürün. </li><li> % 7.5 providon-İyot çözeltisi ile cerrahi alan sterilize ve maruz sadece cerrahi alana sahip (% 0.9 benzil alkol tuzlu su çözeltisi ile nemli) steril gazlı bez ile fare kaplayın. </li><li> (: 1.5-2 cm, kas kesi: 1-1.5 cm cilt kesisi) bir neşter ile karın boşluğuna açın kesin. </li><li> Veteriner personel veya komite tarafından yönlendirilen ısındı% 0.9 benzil alkol tuzlu su çözeltisi ya da diğer steril izotonik solüsyon ile nemlendirerek kurumasını açılan karın boşluğuna koruyun. </li><li> Dikkatle parmağınızla rahim dokunmayın, halka forseps kullanarak rahim boynuzları (ayıklamaks). </li></ol></li><li> DNA ve elektroporasyon enjeksiyonu. Not: Belirli bölgeleri hedefleyen için kesin ayrıntılar 2. bölümünde belirtilmiştir. <ol><li> Hazırlanan borosilikat camdan aracılığıyla Şekil 1 ve 2. bölümünde belirtildiği gibi yavaşça ventrikül içine renkli DNA çözüm enjekte edilir. </li><li> İlgili embriyonik aşama için uygun gerilim uygulayın (örn. E14 için, 36-38 V) özel forseps tipi platin elektrot (aralık döngüsü uzunluğu 50 ms, aralık duraklama 950 msn) aracılığıyla. Rahim duvarının hasarı en aza indirmek için voltajın uygulanması sırasında elektroporasyon kürekler Pulse. </li></ol></li><li> Mesaj elektroporasyon / post-operatif bakım <ol><li> Dikkatle karın boşluğunda rahim boynuzları değiştirin. </li><li> Kas ve ayrı ayrı cilt kesisi dikin. </li><li> Kurtarma için bir termal destek cihazı fare dinlendirin. </li><li> Kurtarma sırasında fare (davranış, yem denetlemek veSu tüketimi), 4 saat, 24 saat ve 48 saat sonra ameliyat. Gerekirse, 2 gün daha fazla analjezik (karprofen, 4 mg / kg vücut ağırlığı, 24 saat depo) uygulanır. </li></ol></li></ol> Belirli Serebral Alanlarının 2. Transfeksiyon Not: pozitif kutup pozisyonu DNA ana madde çözeltisi (sağ ya da üçüncü ventrikül) ve pozitif kutup konumu ile dolu ventrikül ile dikey merkez çizgisi arasındaki açı olarak gösterilir. Sol ventrikül doldururken pozisyonları ayna ters bulunmaktadır. Şekil 4&#39;te kulak Primordial pozisyonları önemli referans noktaları sağlayan gösterilir. <ol><li> Kortikal alanlara transfeksiyonu (Şekil 2A, Tablo 1). <ol><li> Bölüm 1.2&#39;de anlatıldığı gibi ameliyat. Kortikal alanların in utero elektroporasyon için E14 embriyolar kullanın. </li><li> Sağ lateral ventrikül 4 ug DNA içeren DNA çözeltisi ul 1.5-2 enjekteHazırlanan borosilikat kılcal damarların üzerinden. <ol><li> Dikkatle Ponksiyon üzerinde hiçbir görünür gemiler vardır, böylece halka forseps kullanarak embriyo yerleştirin. </li><li> Yavaş yavaş lambdoidal sütür yaklaşık 0.75 mm koronal ve sagital sütür (Şekil 3) 0,5 mm lateral DNA çözüm enjekte. Ekleme derinliği 1,2 mm (rahim duvarından ölçülen E14) olduğundan emin olun. Keskin bir sınır ile bir mavi-yeşil renk olup olmadığını kontrol edin. </li></ol></li><li> Özel forseps tipi platin elektrotlar yoluyla gerilim (aralık döngüsü uzunluğu 50 msn&#39;den, aralık duraklama 950 msn) uygulayın. <ol><li> 3 ya da 5 mm elektrot raket kullanın. </li><li> 36-38 V arasında değişen bir gerilim kullanın </li><li> Elektrotların kulak primordia sadece ön merkezini yerleştirin. </li><li> , Motor korteks 0-40 ° transfect transfect, somatosensoriyel korteks 40-95 ° transfect, 330-0 ° den retrosplenial korteks kullanım açıları transfectpiriform korteks 95-110 ° (Şekil 2A). </li></ol></li><li> Bölüm 1.4 de anlatıldığı gibi sonrası elektroporasyon / post-operatif bakım gerçekleştirin. Fareler kurban ve bölüm 3&#39;te tarif edildiği gibi elektroporasyon (E18) sonra, embriyolar 4 gün analiz eder. </li></ol></li><li> Hipokamp (Şekil 2B, Tablo 1) transfeksiyonu. <ol><li> Bölüm 1.2&#39;de anlatıldığı gibi ameliyat. Hipokampal formasyonun utero elektroporasyon için E15 embriyoların kullanın. </li><li> Hazırlanan borosilikat kılcal damarların üzerinden sağ lateral ventrikül içinde 4 ug DNA içeren DNA çözeltisi ul 2 enjekte edilir. </li><li> Özel forseps tipi platin elektrotlar yoluyla gerilim (aralık döngüsü uzunluğu 50 msn&#39;den, aralık duraklama 950 msn) uygulayın. <ol><li> 3 ya da 5 mm elektrot raket kullanın. </li><li> 38-40 arasında değişen bir gerilim kullanın. </li><li> Negatif kutup kulak primordiumunun sadece ön merkezi ve merkezi o koyunKulak primordiumunun ortasında pozitif kutup f. </li><li> Dentat girus CA1 250-275 ° (Şekil 2B) transfekte etmek üzere, Ca + 2 230-250 ° transfekte etmek, cornu ammonis (CA) 3 210-230 ° transfekte etmek, 190-210 ° &#39;den açılarıyla transfekte etmek. </li></ol></li><li> Bölüm 1.4 de anlatıldığı gibi sonrası elektroporasyon / post-operatif bakım gerçekleştirin. 3. bölümde açıklandığı gibi (doğum, p21 sonra) tamamlandıktan hipokampal oluşumundan sonra analiz gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Lateral septal çekirdeği ve striatum transfeksiyonu (Şekil 2C, Tablo 1) Not: açıları hipokampus transfecting için olanlar ile örtüşüyor. Etkin bir yanal septal çekirdeğe ve istenmeyen hipokampus transfeksiyon erken embriyonik aşamalarda (E12) olmadan striatum transfect için kullanılmalıdır. <ol><li> Bölüm 1.2&#39;de anlatıldığı gibi ameliyat. Lateral septal çekirdek ve striat in utero elektroporasyon içinum E12 embriyoları kullanılır. </li><li> Hazırlanan borosilikat kılcal damarların üzerinden sağ lateral ventrikül içinde 4 ug DNA içeren DNA çözeltisi ul 1 enjekte edilir. </li><li> Özel forseps tipi platin elektrotlar yoluyla gerilim (aralık döngüsü uzunluğu 50 msn&#39;den, aralık duraklama 950 msn) uygulayın. <ol><li> 0.5 mm&#39;lik bir elektrot kullanın. </li><li> 33 V kullanın </li><li> Kulak primordia düzeyinde elektrotların merkezini yerleştirin. </li><li> Striatum 170-240 ° (Şekil 2C) transfekte edilmesi için, 100-170 ° yanal septal çekirdeği kullanımı açıları transfekte etmek. </li></ol></li><li> Bölüm 1.4 de anlatıldığı gibi sonrası elektroporasyon / post-operatif bakım gerçekleştirin. Fareler kurban ve bölüm 3&#39;te tarif edildiği gibi elektroporasyon (E18) sonra, embriyolar 6 gün analiz eder. </li></ol></li><li> Talamus ve hipotalamus Transfeksiyonu (Şekil 2B, Tablo 1) <ol><li> Bölüm 1.2&#39;de anlatıldığı gibi ameliyat. U içintalamus ve hipotalamus kullanımı E12-E13 embriyoların tero elektroporasyon. </li><li> Hazırlanan borosilikat camdan aracılığıyla lateral ventrikül (sağ veya sol) 4 ug DNA içeren 1-1.5 ul DNA çözümü enjekte edilir. Çözüm, üçüncü ventrikül içine yayılır kadar, 2-3 dakika bekleyin. Alternatif doğrudan üçüncü ventrikül içine enjekte edilir. Not: Bu özgüllüğünü arttırır fakat azalmış sağkalım oranı (hasar riski yüksek) neden olabilir. </li><li> Özel forseps tipi platin elektrotlar yoluyla gerilim (aralık döngüsü uzunluğu 50 msn&#39;den, aralık duraklama 950 msn) uygulayın. <ol><li> 0.5 veya 3 mm elektrot kullanın. </li><li> 33-35 V arasında değişen bir gerilim kullanın </li><li> Kulaktan Primordia posterior elektrot merkezi yerleştirin. </li><li> Hipotalamus 90-180 ° (Şekil 2D) transfect, 25-40 ° ile talamus kullanım açıları transfect. </li></ol></li><li> Des gibi post elektroporasyon / post-operatif bakım gerçekleştirinbölüm 1.4 açıklanan şekilde. Fareler kurban ve bölüm 3&#39;te tarif edildiği gibi elektroporasyon (E18) sonra, embriyolar 6 gün analiz eder. </li></ol></li></ol> 3. Perfüzyon Fixation <ol><li> Hazırlıklar <ol><li> Sıcak% 4 paraformaldehid (PFA) 37 ° C arasındadır. </li><li> PBS ile 50 ml şırınga (4 ° C) ve ısıtılmış PFA ile ikinci bir şırınga doldurun. Kabarcıkları kaçının. </li><li> Üç yollu için şırınga bağlayın. Kanatlı infüzyon seti (kelebek) üçüncü ucunu. </li><li> PBS ile kanatlı infüzyon seti yıkayın. </li></ol></li><li> Serpilme <ol><li> Derin subkutan ketamin hidroklorür uygulama (60 mg / kg) ve ksilazin (7.5 mg / kg) ile (gebe veya doğum sonrası transfekte edilmiş) fareler anestetize. </li><li> Ayak tutam yanıtsızlık cerrahi tolerans sahne onaylayın. </li><li> Sadece göğüs kafesine altında karın boşluğuna açın. </li><li> Dikkatle diyaframı kesti. </li><li> Dikkatle e bir kesim üzerinden göğüs kafesini açmakköprücük kemiği kadar ach sitesi. </li><li> (Kalbin apeks başlayarak) sol kalp odasına kelebeğin ucu takın. </li><li> Sol atriyal apendiks kesin. </li><li> Yavaş yavaş PBS (yaklaşık 10 mi) ile fare serpmek. </li><li> Üç yönlü stopcock geçin. </li><li> 5-10 ml% 4 PFA ile fareyi serpmek. </li><li> Makas kullanılarak fare başını kesmek ve foramen magnum başlayan beyin teşrih. Daha önce 16 yayınlanan diseksiyon. </li><li> % 4 PFA 2 gün beyin Postfixate. Karanlıkta 4 ° C&#39;de tutun beyinleri. </li></ol></li></ol> 4. İmmünhistokimya <ol><li> (Bir vibratome ile örneğin) 70 mikron bölümleri oluşturun. </li><li> İsteğe bağlı: antikor boyama ile floresan geliştirin. <ol><li> Oda sıcaklığında 1 saat için bloke bölümleri (% 0.1-0.2 Triton X-100,% 5 normal keçi serumu) </li><li> Uygun bir antikor (: 1000 anti-GFP, 1) ile O / N inkübe </li><li> Yıkama 30.1 M fosfat tamponu ile -5 kez. </li><li> Uygun floresan-konjuge sekonder antikor (: 1000 Alexa Fluor 488 konjuge edilmiş anti-tavşan IgG, 1), 3-5 saat inkübe edin. </li><li> İsteğe bağlı: 1 dakika süre ile (0,1 M fosfat tampon maddesi içinde DAPI, 0.2 ug / ml), 4-6-diaminodino-2-fenilindol ile Counterstain. </li><li> Uygun bir floresan mikroskop ile floresan analiz. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19 Suppl 1. (July), i120-i125 (1991).</li>
<li>Nakahira, E., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+generation%2C+migration%2C+and+differentiation+in+the+mouse+hippocampal+primoridium+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> J Comp Neurol. 483 (3), 329-340 (2005).</li>
<li>Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+selective+gene+expression+in+developing+and+adult+hippocampal+pyramidal+neurons+using+focal+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-term, selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation.</a> J Neurosci. 27 (19), 5007-5011 (2007).</li>
<li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> J Neurosci Methods. 143 (2), 151-158 (2005).</li>
<li>Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Molecular+Approach+of+in+utero+Electroporation+to+Functionally+Decipher+Endophenotypes+in+Neurodevelopmental+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22FNMOL%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders.</a> FNMOL. 4 (November), 37(2011).</li>
<li>Tomita, K., Kubo, K. I., Ishii, K., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupted-in-schizophrenia-1+%28Disc1%29+is+necessary+for+migration+of+the+pyramidal+neurons+during+mouse+hippocampal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Hu+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">Disrupted-in-schizophrenia-1 (Disc1) is necessary for migration of the pyramidal neurons during mouse hippocampal development.</a> Hu Mol Gen. 20 (14), 2834-2845 (2011).</li>
<li>Niwa, M., Kamiya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+DISC1+by+In+Utero+Gene+Transfer+Disturbs+Postnatal+Dopaminergic+Maturation+in+the+Frontal+Cortex+and+Leads+to+Adult+Behavioral+Deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knockdown of DISC1 by In Utero Gene Transfer Disturbs Postnatal Dopaminergic Maturation in the Frontal Cortex and Leads to Adult Behavioral Deficits.</a> Neuron. 65 (4), 480-489 (2010).</li>
<li>Nakahira, E., Kagawa, T., Shimizu, T., Goulding, M. D., Ikenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+that+ventral+forebrain+cells+migrate+to+the+cortex+and+contribute+to+the+generation+of+cortical+myelinating+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct evidence that ventral forebrain cells migrate to the cortex and contribute to the generation of cortical myelinating oligodendrocytes.</a> Dev Biol. 291 (1), 123-131 (2006).</li>
<li>Baumgart, J., Grebe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C57BL%2F6-specific+conditions+for+efficient+in+utero+electroporation+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">C57BL/6-specific conditions for efficient in utero electroporation of the central nervous system.</a> J Neurosci Methods. 240, 116-124 (2015).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> JoVE. (54), (2011).</li>
<li>Guedel, A. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuedel%2C+AE+%22Inhalation+anesthesia%3A+a+fundamental+guide%22">Inhalation anesthesia: a fundamental guide</a>. , Macmillan. New York. (1937).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Mizutani, K., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitors+resume+generating+neurons+after+temporary+inhibition+of+neurogenesis+by+Notch+activation+in+the+mammalian+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Progenitors resume generating neurons after temporary inhibition of neurogenesis by Notch activation in the mammalian cerebral cortex.</a> Development. 132 (6), 1295-1304 (2005).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%2C+Growth+%26+Differ%22%5BJournal%5D)">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Dev, Growth & Differ. 50 (6), 507-511 (2008).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu protokol, C75BL/6 farelerinin retrosplenial korteksi, motor korteksi, somatosensoriyel korteks, piriform korteks, kornu ammonis 1-3, dentat girus, striatum, lateral septal çekirdek, talamus ve hipotalamusun nasıl transfekte edileceğini ayrıntılı olarak açıklar. Sağlanan tüm bilgilerle bu, C57BL/6 faresinde bu serebral bölgelerin transfeksiyonlarını kolayca yeniden oluşturmak için gerekli tüm bilgileri sağlayan ilk protokoldür. Önceki yayınlar çoğunlukla yalnızca birkaç belirli bölgeye odaklanmıştır ve bu nedenle belir...

Üç bağımsız gruplar 1-3 2001 yılında ilk açıklama beri i n utero elektroporasyon kemirgen, merkezi sinir sisteminde gen ifadesini analiz etmek için yaygın olarak kullanılan standart bir araç haline gelmiştir. Sürekli gelişen teknikler, hala zaman ve para kolaylığından dolayı, rahimde elektroporasyon temyiz tüketen rağmen bir nakavt farelerin nesil ile karşılaştırıldığında. Yani, in utero elektroporasyon hızlı ve verimli gain- ve zarar-fonksiyon çalışmalarını 4 sağlar. Serebral bölgeleri transfekte etmek için, negatif yüklü plasmid ihtiva eden bir çözelti, ventrikül içine enjekte edilir. Elektrik akımının sırasında, negatif yüklü DNA pozitif kutbuna doğru hareket eder ve bu nedenle, transfekte edilmiş bölgenin pozitif kutup konumunu değiştirerek basitçe seçilebilir. Sık sık, merkezi sinir sisteminin pek çok bölge ta olabilir gösterilmiştir3,5-8 rgeted. Örneğin, son çalışmalar hipokampus, striatum piriform kortekste veya 9-11 belirli transfections göstermektedir. Ancak, uygun pozisyonlar hakkında bilgiler genellikle sadece nadiren standardize ve her zaman farklı fare suşları aktarmak kolay değildir. Bazı embriyonik evrelerinin Transfeksiyon önemsiz olmaktan uzaktır. Utero elektroporasyon spesifik için set-up seçerken Birçok etkileyen faktörler dikkate alınmalıdır. İlk olarak, optimum ilgili embriyonik aşamalarında transfect uygun gerilimlerinin hakkında bilgiye ihtiyaç vardır. Düşük gerilimler transfeksiyon verimi 2,3,12 azaltmak ise yüksek gerilim, hayatta kalma oranını düşürmek. Ayrıca elektrot raket boyutu, önemli bir rol oynar düşürülmüş özgüllük çok büyük sonuçlar ya bağlı kalp ritmi 4,12,13 ve sevgi ile ölüme neden olabilir elektrot kürekler kullanımı nedeniyle. Uygulanangerilim ve boyut ve elektrot kürek konumu dikkat edilmesi gereken en önemli özelliklerdir, ancak DNA çözümün uygulanan miktarı gibi, elektroporasyon sonucu etkileyen başka faktörler de vardır. Biz C57BL / 6 fare 12 farklı beyin bölgelerinin hızlı ve etkin transfeksiyon sağlayan ayrıntılı bir protokol geliştirdik. Bu protokolde gerilimlerde hakkında ayrıntılı bilgiler kullanılmak üzere geliştirilmiş ve özgünlük için elektrot raket boyutu sağlanır. Bundan başka, ventrikül ilgili bilgiler plazmid solüsyonu miktarı ve elektrodun pozisyonu için öneriler sağlanır birlikte doldurulacak. Bir harita ve bu pozisyonlarda daha görselleştirme ayrıntılı konum bilgisi göstergesi retrosplenial korteks, motor korteks, somatosensoriyel korteks, piriform korteks, t utero elektroporasyon basit özgü ve verimli sağlarO ammonis 1-3, dentat girus, striatum, yan septal çekirdek, talamus ve hipotalamus Cornu.

<table><tbody><tr><td>EndoFree Plazmid Maxi Kiti</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Yeşil</td><td>Roth</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>borosilikat cam kılcal damarlar (0.8-0.9 mm çap)</td> <td>Hassas Alet A.Ş.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (Forene)</td><td>Abbott</td><td>PZN 4831850</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen (Rimadyl)</td><td>Pfizer GmbH</td><td>onay numarası: 400684.00.00</td><td></td></tr><tr><td>göz merhemi (Bepanthen Augen und Nasensalbe)</td><td>Bayer&nbsp;</td><td>PZN 01578681</td><td></td></tr><tr><td>%0,9 benzil alkol% 0,9 tuzlu su çözeltisi</td><td>Üniversite Tıp Merkezi Eczanesi Mainz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gazlı bez (ES-Kompressen)</td><td>Hartmann</td><td>407835</td><td></td></tr><tr><td>steril 5-0 Perma-El İpek Sütür</td><td>Ethicon Johnson & Johnson</td><td>K890H</td><td></td></tr><tr><td>halka forseps 1/ 1.5 mm</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>11101-09</td><td></td></tr><tr><td>halka forseps 4.8/ 6 mm</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>11106-09</td><td></td></tr><tr><td>halka forseps 2.2/ 3 mm</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Adson Forseps-Tırtıklı Düz 12 cm</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>IrisMakas-Narin Düz-Keskin/ Kör 10 cm</td><td>İnce Bilim Aletleri</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Mayo-Stille Makas-Düz 15 cm</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>14012-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forseps-Inox</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo İğne Tutucu-Kilitli-Tungsten Karbür 14 cm</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporatör CUY21 SC&nbsp;</td><td>Nepa Gen A.Ş.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FST 250 Sıcak Boncuk Sterilizatörü</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Mikro öğütücü EG-44</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 Mikropette Çektirme</td><td>Sutter Enstrüman Şirketi</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Platin elektrotlar 650P 0,5 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P0.5</td><td></td></tr><tr><td>Platin elektrotlar 650P 3 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P3</td><td></td></tr><tr><td>Platin elektrotlar 650P 5 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>Platin elektrotlar 650P 10 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P10</td><td></td></tr><tr><td>Anestezi sistemi</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>CV-30511-3 Buhar 19.3</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma plakası</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>HP-1M</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık Kontrol Cihazı 220V AC</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr></tbody></table>

korteks, hippocampus-, thalamus-, hypothalamus-, lateral septal nucleus- ve striatum özgü<em&gt; in utero</em&gt; c57bl / 6 fare elektroporasyon

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero elektroporasyon, kemirgen merkezi sinir sistemindeki çeşitli genlerin hızlı ve verimli uzay-zamansal manipülasyonu için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. İstenen genlerin aşırı ekspresyonu, shRNA aracılı fonksiyon kaybı çalışmaları kadar mümkündür. Bu nedenle geniş bir uygulama yelpazesi sunar. Belirli hücreleri farklı bir alanda hedeflemenin fizibilitesi, bu çok kullanışlı yöntemin potansiyel uygulama yelpazesini daha da arttırır. Belirli bölgeleri verimli bir şekilde hedeflemek için embriyonik aşama, uygulanacak voltaj ve en önemlisi elektrotların konumu gibi incelikler hakkında bilgi edinmek vazgeçilmezdir.
Burada, C57BL/6 fare merkezi sinir sisteminin çeşitli bölgelerinin utero elektroporasyonuna spesifik ve verimli bir şekilde izin veren ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Özellikle, retrosplenial korteks, motor korteks, somatosensoriyel korteks, piriform korteks, kornu ammonis 1-3, dentat girus, striatum, lateral septal çekirdek, talamus ve hipotalamusa gelişen bölgelerin nasıl transfekte edileceği gösterilmiştir. Uygun embriyonik aşama hakkında bu bilgi için, karşılık gelen embriyonik aşama için uygun voltaj sağlanır. En önemlisi, pozitif kutbun uygun konumunu gösteren bir açı haritası tasvir edilmiştir. Bu standartlaştırılmış protokol, utero elektroporasyonda verimliliği kolaylaştırmaya yardımcı olur ve bu da hayvan sayısının azalmasına neden olabilir.

Şekil 2, retrosplenial korteks içine gelişen bölgelerin utero elektroporasyon belirli için örnekler gösterir, motor korteks, somatosensorial korteks, piriform korteks, cornu 1-3 ammonis, dentat girus, striatum, yan septal çekirdek , talamus ve hipotalamus. Transfeksiyonlarının sonuçları tavsiye açı (Şekil 2) yanında gösterilmiştir. In vivo açıları daha iyi görüntülenmesi için elektrot (0,5 mm) konumu da (amniotik kese içinde Şekil 5&#39;te, rahimde...

Bu protokol, in utero elektroporasyon yoluyla C57BL/6 merkezi sinir sistemindeki farklı bölgelerin spesifik olarak nasıl transfekte edileceğini ayrıntılı olarak açıklar. Bu protokolde korteks, hipokampus, talamus, hipotalamus, lateral septal çekirdek ve striatuma dönüşen bölgelerin transfeksiyonları için ayrıntılı talimatlar bulunmaktadır.

Korteks, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- ve Striatum özgü<em&gt; In Utero</em&gt; C57BL / 6 Fare Elektroporasyon

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Bu in vivo hücre manipülasyonunun genel amacı; fare benzeri korteks, hipokampus, talamus, hipotalamus, lateral septal nukleus ve striatum gibi merkezi sinir sisteminin belirli bölgelerindeki hücreleri spesifik olarak modifiye etmektir. Bu yöntem; örneğin farklı sinyal yolaklarının tanımlanması ve hücre farklılaşma düzeyinin belirlenmesi yoluyla, beynin gelişimi ve işlevine ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, genetik olarak modifiye edilmiş farelerin oluşturulmasıyla geçen zaman kaybı olmaksızın, merkezi sinir sistemindeki çeşitli hücre tiplerinin hızlı ve verimli bir şekilde manipüle edilmesine olanak sağlamasıdır.Genel olarak, bu yöntemin gösterilmesi faydalıdır; çünkü bu yöntemde yeni olan kişiler, spesifik elektroporasyon için kritik önem taşıyan doğru elektrot konumunu belirleme konusunda sıklıkla zorluk yaşarlar. Bu prosedüre başlamak için, anestezi uygulanmış gebe bir farenin abdominal boşluğunu skalpel ile açın. Açılan abdominal boşluğun kurumasını önlemek için bölgeyi 0.9% sıcak metil alkol salin solüsyonu ile nemlendirin.Ardından, bir çift ring pens kullanarak uterus kornularını dikkatlice çıkarın. Sonrasında, ponksiyon bölgesinin üzerinde görünür damar kalmayacak şekilde bir E14 embriyosunu konumlandırın. Daha iyi bir görselleştirme sağlamak için, beyinde transfeksiyon için istenen bölgenin açısını ve konumunu belirlemek amacıyla 5 milimetrelik bir elektrot kullanın.Kortikal bölgenin in utero elektroporasyonu için, sol lateral ventriküle 1.5 ile iki µL arasında DNA çözeltisini yavaşça enjekte edin. Yerleştirme derinliğinin, uterus duvarından itibaren 1 ila 2 mm olduğundan emin olun. Ardından, keskin bir sınırla beraber mavi-yeşil renklenmeyi kontrol edin.Daha iyi görselleştirme için, transfeksiyon için beyinde istenen konumun açısını ve yerini belirlemek amacıyla 5 milimetrelik bir elektrot kullanın. Ardından, üç milimetrelik platin elektrot pedlerinin merkezini kulak primordiyumlarının hemen ön kısmına yerleştirin ve damarların veya plasentanın üzerine yerleştirilmediklerinden emin olun. Sonrasında, transfeksiyona başlamak için voltaj uygulayın.Hipokampal formasyonun in utero elektroporasyonu için, E15 embriyosunun sağ lateral ventrikülüne iki mikrolitre DNA çözeltisi enjekte edin. Ardından, üç ila beş milimetrelik platin elektrot pedlerinin negatif kutbunu kulak primordyumunun hemen önüne, pozitif kutbunu ise kulak primordyumunun ortasına yerleştirin. Daha sonra, transfeksiyonu başlatmak için voltaj uygulayın.Lateral septal nukleus ve striatumun in utero elektroporasyonu için, E12 embriyosunun sağ lateral ventrikülüne bir mikrolitre DNA çözeltisi enjekte edin. Ardından, 5 mm'lik elektrotları kulak primordiyumlarının seviyesine yerleştirin. Sonrasında, transfeksiyona başlamak için voltaj uygulayın.Talamus ve hipotalamusun in utero elektroporasyonu için, E12 ila E13 evresindeki bir embriyonun lateral ventrikülüne 1 ila 1,5 µL DNA çözeltisi enjekte edin. Ardından, çözeltinin üçüncü ventriküle difüze olması için iki ila üç dakika bekleyin. Sonra, 5 veya 3 mm'lik elektrotları kulak primordiyumlarının hemen posterioruna yerleştirin.Ardından, transfeksiyonu başlatmak için voltaj uygulayın. Bu şema, kortikal alanların transfeksiyona yönelik pozitif ve negatif kutupların uygun konumlarını göstermektedir. Bu şema ise hipokampal formasyonların transfeksiyona yönelik pozitif ve negatif kutup konumlarını göstermektedir.Striatum ve lateral septal nukleus transfeksiyonu için pozitif ve negatif kutupların konumları burada gösterilmektedir. Talamus ve hipotalamus transfeksiyonu için uygun elektrot konumları ise burada gösterilmektedir. Transfeksiyonun özgüllüğü, elektrot boyutuna bağlıdır.Elektrot pedalının boyutunun artırılması, transfeksiyonun özgüllüğünü azaltır. Bu durum özellikle daha genç embriyonik evrelerde belirgindir ancak geç embriyonik evrelerde de görülür. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde 15 dakikada tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, embriyolara ve annelere büyük bir özenle yaklaşmak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, Black 6 faresinin merkezi sinir sistemindeki belirli bölgelerin nasıl transfekte edileceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.

cortex-hippocampus-thalamus-hypothalamus-lateral-septal-nucleus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

E15 Fare Embriyolar Utero İntraventriküler Enjeksiyon ve Elektroporasyon

Utero elektroporasyon gelişmekte olan merkezi sinir sistemi (MSS) bir mekansal ve zamansal olarak kontrollü bir şekilde hızlı bir gen teslimat için izin verir. Burada son derece uyarlanabilir tarif telencephalon diensefalon ve retina da dahil olmak üzere birden fazla embriyonik MSS etki alanı ifade yapıları sunmak için kullanılabilir utero elektroporasyon protokol.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

Gelişmekte olan fare beyninin içine bir gen transferi yöntemi eşsiz bir cerrahi yöntem ve elektrotlar özel şekli ile tarif edilir. Bu benzersiz tekniği, beyin gelişimi okuyan birçok Nörobilimadamları yardımcı olacak zamansal ve mekansal plazmid DNA transfeksiyon sağlar.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

Bu makalede ayrıntılı olarak utero serebral korteks ve farelerde E14.5 de hipokampus electroporate bir protokol tanımlamaktadır. Biz de bu bu iki beyin bölgelerinde dendrit ve dikenler incelemek için değerli bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Bu protokol içerir geliştirilmiş bir eksplant yordam...

Eski utero Elektroporasyon ve Tüm Yarımküre Eksplantlarından: Erken Kortikal Kalkınma Çalışmaları İçin Basit Bir Deney Yöntemi

Hipotalamusun fonksiyonel ve tıbbi önemine...

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Burada, hipokampal gelişim sırasında belirli genlerin düzenleyici mekanizmalarını incelemek için bir araç sağlayan bir protokol sunuyoruz. Ex utero elektroporasyon ve organotipik dilim kültürünün kullanılması, tek hücrelerde ilgilenilen genlerin ekspresyonunun yukarı ve aşağı regülasyonuna izin verir ve gelişim sırasında kaderlerini takip eder.

Fare Hipokampal Doku Ex Utero Elektroporasyon ve Organotipik Dilim Kültür

Gen beyinde hücre-otonom fonksiyonları kaybı inducing tarafından okudu ya da seyrek nüfus hücre işlevinin kazanmak. Burada, rahim içinde elektroporasyon Cre recombinase işlev içinde vivokaybına neden için floxed genler ile kortikal nöronlar geliştirme seyrek nüfus sunmak için açıklamak.

CRE-lox rekombinasyon fare serebral korteks rahim içinde elektroporasyon ile inducing

Burada, electroporated beyin organotypic dilim kültürler fare embriyo confocal mikroskobu ve canlı görüntüleme teknikleri için uygun oluşturmak için düşük maliyetli ve güvenilir bir yöntem sağlamak.

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

Transmisyon elektron mikroskobu ve rahimde iletim sinir sisteminin iyi ultrastructure morfolojik değişiklikler geliştirme sırasında çalışmak için güçlü bir yaklaşımdır. Bu kombine yöntem değişiklikleri içine derin anlayışlar nöroplastisite ile ilgili topografik ifadelerinin temel yapısal detayları verir.

Sonra Ultrastructural nöroplastisite parametrelerinde Utero iletim gelişmekte olan fare beyin ve omurilik değerlendirilmesi

Uteros elektroporasyonda çift mekansal ve zamansal olarak ayrılmış hücre popülasyonları hedefleme sağlar. Bu teknik, bu hücre popülasyonları arasındaki etkileşimleri normal koşullarda floresan proteinler ihsallaştırmak için değil, aynı zamanda fonksiyonel deneylerden sonra ilgi genlerini tedirgin etmek için görselleştirmek için yararlıdır.

Geçici ve Mekansal Olarak Ayrılmış Hücre Popülasyonlarını Hedef lemek için Utero Elektroporasyonunda Çift

Öğrenin, C57BL/6 farelerde korteks, hipokampus, talamus ve hipotalamus gibi merkezi sinir sistemi bölgelerine in utero elektroporasyon yöntemiyle hücre manipülasyonu. Bu teknik, genetiği değiştirilmiş fare üretmeden hızlı ve verimli transfeksiyon sağlar.

Korteks, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- ve Striatum özgü In Utero C57BL / 6 Fare Elektroporasyon (Video) | JoVE Journal

Korteks, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- ve Striatum özgü

Daha fazla video keşfet