Kök Hücre Biyolojisine Giriş
Adından da anlaşılacağı gibi, kök hücreler birçok farklı hücre tipinin "kaynaklandığı" öncülerdir. Potansiyelleri veya her üç germ katmanından hücrelere farklılaşma yeteneklerinin yanı sıra yenilenebilirlikleri veya daha fazla kök hücre üretme kapasiteleri ile karakterize edilirler. Gelişimsel biyoloji ve rejeneratif tıp alanlarını ilerletme umuduyla, kök hücre araştırmacıları, bu benzersiz hücrelerin bu kadar büyük bir başarıyı nasıl başardığını anlamak için çalışıyorlar.
Bu video, kök hücre biyolojisi alanındaki önemli keşifleri, bu alandaki bilim insanlarının sorduğu temel soruları, kök hücre araştırmacıları tarafından kullanılan öne çıkan yöntemleri ve kök hücre araştırmalarının uygulamalarını kapsamaktadır.
Kök hücre kavramını tanıttığımıza göre, kök hücre araştırmalarının zengin tarihine geçelim.
1960'lı yıllarda, Dr. Ernest McCulloch ve Dr. James Till, yetişkin memelilerin kemik iliğinde hematopoetik kök hücrelerin varlığına dair ilk kesin kanıtlardan bazılarını keşfettiler. Bu hücreler kendi kendini yenileme yeteneğine sahiptir ve multipotenttir, yani çok sayıda, ancak sınırlı hücre türlerine, yani kan ve bağışıklık sistemi hücrelerine farklılaşabilirler.
1988'de Irving Weissman ve meslektaşları, hematopoetik kök hücrelerin fare kemik iliğinden saflaştırılması için bir yöntem geliştirdiler.
1981'de Profesör Gail Martin "embriyonik kök hücre" terimini icat etti. Hematopoetik kök hücrelerin aksine, embriyonik kök hücreler pluripotenttir ve vücudun tüm hücre tiplerine farklılaşma yeteneğine sahiptir. O ve bilim adamları Martin Evans ve Matthew Kaufman, aynı anda, ancak ayrı ayrı, fare blastosistlerinden iç hücre kütlesini çıkarmak ve bunları in vitro kök hücreler olarak kültürlemek için yöntemler geliştirdiler.
1998 yılında, fare embriyonik kök hücrelerinin izolasyonundan on yıldan fazla bir süre sonra, Dr. James Thomson ilk insan embriyonik kök hücre hatlarını başarıyla kurdu.
2006 yılında, Dr. Shinya Yamanaka tarafından tasarlanan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin ortaya çıkmasıyla büyük bir atılım meydana geldi. John Gurdon'un çalışmalarına dayanan Yamanaka, şimdi "Yamanaka faktörleri" olarak bilinen küçük bir transkripsiyon faktörü kümesinin ekspresyonunu indüklemek için retrovirüs kullanarak farklılaşmış hücreleri pluripotent bir duruma yeniden programlamak için bir yöntem geliştirdi. Elde edilen hücreler "indüklenmiş pluripotent kök hücreler" veya "iPSC'ler" olarak adlandırıldı. Bu deneyler o kadar önemli kabul edildi ki, Yamanaka ve Gurdon 2012 yılında Nobel Ödülü'ne layık görüldü.
Şu anda, çeşitli insan hastalıklarının iPSC modellerine ve çoklu dokularda rejenerasyon platformlarına sahibiz.
Günümüzde, kök hücre araştırmaları birkaç kapsayıcı soru tarafından yönlendirilmektedir.
Bu soruların en önemlilerinden biri şudur: Kök hücreler pluripotentliği ve yenilenebilirliği nasıl korur? Kök hücrelerin bu özellikleri kazandıran iki ilgili özelliği vardır. Birincisi, kök salgı ve kendini yenileme için gerekli olan belirli genlerin ifadesidir. İkincisi, kök hücrelerin bu genlerin ekspresyonunu etkileyen düzenleyici faktörlere karşı duyarlılığıdır.
Bir sonraki mantıklı soru şudur: kök hücrelerin farklılaşması nasıl yönlendirilir? Bir kök hücre olgun bir hücreye dönüştükçe, spesifik farklılaşma yollarının aktivasyonu, gen ekspresyonunda değişikliklere neden olur, kök hücre genlerini kapatır ve dokuya özgü genleri açar, bu da hücre fonksiyonu ve morfolojisinin uzmanlaşmasının artmasına neden olur.
Son olarak, kök hücre araştırma fonlarını yönlendiren ana soruyu ele alalım: kök hücreler hastalıkları tedavi etmek için kullanılabilir mi? Rejeneratif tıp bu soruyu iki şekilde ele alıyor: 1) laboratuvarda organları yeniden büyüterek ve 2) doku dejenerasyonunu tedavi etmek için nakil yoluyla kök hücreler vererek.
Artık kök hücre biyolojisi ile ilgili bazı önemli soruları sunduğumuza göre, bunları ele almak için kullanılan öne çıkan yöntemlerden bazılarını gözden geçirelim.
Mikroarray teknolojisi, kök hücrelerde hangi genlerin güç ve yenilenebilirlik sağladığını keşfetmek için kullanılabilir. Bu teknikte, toplam RNA, mevcut gen ekspresyonunun bir anlık görüntüsü olarak işlev gören bir hücre popülasyonundan izole edilir. Bir dizi adımda, bu mRNA, floresan olarak etiketlenmiş bir proba dönüştürülür ve tüm insan genomunun transkriptlerini içeren bir çipe hibritlenir. Bu çipin taranması, göreceli gen ekspresyon profillerinin bir okumasını sağlar. Gördüğünüz gibi, bir kök hücre, farklılaşmış bir hücreden farklı olan belirli bir gen kümesini ifade eder.
Pluripotens genleri için başka bir test, Oct4-GFP tespit sistemini içerir. Oct4 kendini yenileme için gereklidir ve farklılaşma sırasında hızlı bir şekilde aşağı regüle edilir. Bu nedenle, ifadesi "saplılık" ın güvenilir bir göstergesi olarak işlev görür. Bu deneyde, hücreler Oct4 promotörün kontrolü altında yeşil floresan proteini eksprese eder. Bu hücreler daha sonra deneysel olarak manipüle edilebilir ve GFP ifadesindeki değişiklikler, kendini yenilemeyi modüle eden yeni genleri veya çözünür faktörleri tanımlamak için analiz edilir.
Kök hücreleri in vitro olarak incelemek için önce onları nasıl kültürleyeceğimizi anlamalıyız. Kök hücreler, saplılığı korumak için belirli bir mikro çevreye ihtiyaç duyar. Bu, kök hücrelerin fare embriyonik fibroblastları veya MEF'ler gibi besleyici hücrelerle birlikte kültürlenmesiyle elde edilebilir. MEF'ler, gerekli pluripotentlik ve kendini yenileme faktörlerinin karmaşık bir karışımını salgılar.
Bazen, besleyici içermeyen kök hücre kültürlerine sahip olmak arzu edilir. Besleyicisiz hücre hatlarını korumanın ana yöntemi, hücre kültürü ortamını büyüme ve inhibitör faktörlerin stok reaktifleri ile takviye etmektir.
Kök hücrelerin in vitro olarak ayırt edilmesi çeşitli yöntemler kullanılarak gerçekleştirilir. Diferansiyel gen ekspresyonu sonuçta hücrelerin özelleşmesinden sorumludur. Burada gördüğünüz iki aşamalı yöntemde, kültürlenmiş fare embriyonik kök hücreleri, motor nöron indüksiyon ortamı ile daha fazla farklılaşmadan önce bir nöronal kader için hazırlanır. Bu faktörler, gen ekspresyonunun spesifik yollarını aktive ederek motor nöronların karakteristik morfolojik ve proteomik değişikliklerine neden olur.
Geleneksel in vitro farklılaşmanın en büyük dezavantajlarından biri, düz plakaların hücrelerin 3D büyümesini kısıtlamasıdır. Asılı bırakma yöntemi ve mikrokapsül yöntemleri bu sorunları ortadan kaldırır. Asılı damla tekniğinde, küçük damla kök hücre süspansiyonları bir petri kabının kapağına kaplanır ve embriyoid cisimleri olarak bilinen kök hücre agregatlarını oluşturmak için baş aşağı kültürlenir.
Mikroenkapsülasyon yöntemlerinde kök hücreler, aljinat adı verilen biyouyumlu yarı geçirgen bir zar ile karıştırılır ve boncuklar halinde hücre kültürü plakalarına bırakılır. Her iki yöntem de dopaminerjik nöronlar ve kardiyomiyositler gibi özel hücrelere daha fazla farklılaşmaya izin verir.
Farklılaşmanın nasıl yönlendirileceğini bilmek, kök hücrelerin rejeneratif tıpta kullanılmasına yönelik önemli bir adımdır. Kök hücre nakli tedavisi, hasarlı dokuları kök hücrelerle onararak dejeneratif hastalıkları tedavi etmeyi ve iyileştirmeyi amaçlar. Bu deneyde, hastalardan alınan somatik hücreler, Yamanaka faktörlerinin lentivral enfeksiyonu yoluyla iPS hücrelerine yeniden programlanmıştır. Pluripotent durumlarından, hücreler belirli hücre tiplerine ayrılır ve hasarlı dokuyu onarmak için konakçıya geri gönderilir.
Artık kök hücreleri araştırmak için kullanılan yöntemlerden bazılarını bildiğinize göre, bu yöntemlerin belirli deneylerde nasıl uygulandığına bir göz atalım.
Multipl sklerozlu bir fare modeli kullanılarak yapılan bu deneyde, nöral kök hücreler etkilenen farelere intravenöz olarak enjekte edilir. Transplantasyonun başarısını değerlendirmek için tedavi edilen farelerin beyin dilimleri toplanır ve mikroskop altında görüntülenir. Donör nöronal öncü hücrelerden türetilen hücreler, raportör gen LacZ kullanılarak izlenir. Gördüğünüz gibi, bir dizi donör kök hücre farklılaşmış ve hastalıklı farelerin merkezi sinir sistemine entegre edilmiştir.
Her hastalık sistemik enjeksiyonlarla tedavi edilemez. Örneğin kıkırdak yaralanmaları, etrafını yeniden inşa etmek için özel bir iskele gerektirir. Bu deneyde, mezenkimal kök hücreler ve pıhtılaşma faktörlerinin bir karışımı, bir pıhtı oluşturmak için birlikte kültürlenir. Pıhtı daha sonra bir tavşanın hasarlı diz kıkırdağına yerleştirilir ve bütünleşmesine izin verilir. Bu prosedürü takiben, diz kıkırdağının düzgün ve fonksiyonel bir eklem haline gelmesi gözlemlenebilir.
Bazen, kök hücre araştırmacıları ve doku mühendisleri tüm organları yeniden inşa etmek için bir araya gelirler. Bu deneyde, primat akciğerleri organı hücreden arındırmak için yıkanır ve geride sadece hücresel olmayan yapısal bileşenler kalır. Bu "hayalet" akciğer daha sonra bir biyoreaktöre aktarılır ve burada vasküler ve epitelyal kök hücrelerle tohumlanır. Doğal bir akciğerin deneyimlediği basınç ve davranışı daha fazla taklit etmek için, biyoreaktör ortamı dolaştırır, basınç ve gaz seviyelerini korur ve akciğerleri şişirir.
Az önce JoVE'nin kök hücre biyolojisine genel bakışını izlediniz. Özetlemek gerekirse, bu videoda kök hücreleri ve tarihçesini, bakımını, farklılaşma ve verme yöntemlerini ve kök hücre uygulamalarını ele aldık. İzlediğiniz için teşekkürler!
Kök hücreler olarak bilinen çeşitli hücre tiplerine farklılaşabilen hücreler, günümüzün en heyecan verici bilim alanlarından birinin merkezinde yer al…
Adından da anlaşılacağı gibi, kök hücreler birçok farklı hücre tipinin "kaynaklandığı" öncülerdir. Potansiyelleri veya her üç germ katmanından hücrelere farklılaşma yeteneklerinin yanı sıra yenilenebilirlikleri veya daha fazla kök hücre üretme kapasiteleri ile karakterize edilirler. Gelişimsel biyoloji ve rejeneratif tıp alanlarını ilerletme umuduyla, kök hücre araştırmacıları, bu benzersiz hücrelerin bu kadar büyük bir başarıyı nasıl başardığını anlamak için çalışıyorlar.
Bu video, kök hücre biyolojisi alanındaki önemli keşifleri, bu alandaki bilim insanlarının sorduğu temel soruları, kök hücre araştırmacıları tarafından kullanılan öne çıkan yöntemleri ve kök hücre araştırmalarının uygulamalarını kapsamaktadır.
Kök hücre kavramını tanıttığımıza göre, kök hücre araştırmalarının zengin tarihine geçelim.
1960'lı yıllarda, Dr. Ernest McCulloch ve Dr. James Till, yetişkin memelilerin kemik iliğinde hematopoetik kök hücrelerin varlığına dair ilk kesin kanıtlardan bazılarını keşfettiler. Bu hücreler kendi kendini yenileme yeteneğine sahiptir ve multipotenttir, yani çok sayıda, ancak sınırlı hücre türlerine, yani kan ve bağışıklık sistemi hücrelerine farklılaşabilirler.
1988'de Irving Weissman ve meslektaşları, hematopoetik kök hücrelerin fare kemik iliğinden saflaştırılması için bir yöntem geliştirdiler.
1981'de Profesör Gail Martin "embriyonik kök hücre" terimini icat etti. Hematopoetik kök hücrelerin aksine, embriyonik kök hücreler pluripotenttir ve vücudun tüm hücre tiplerine farklılaşma yeteneğine sahiptir. O ve bilim adamları Martin Evans ve Matthew Kaufman, aynı anda, ancak ayrı ayrı, fare blastosistlerinden iç hücre kütlesini çıkarmak ve bunları in vitro kök hücreler olarak kültürlemek için yöntemler geliştirdiler.
1998 yılında, fare embriyonik kök hücrelerinin izolasyonundan on yıldan fazla bir süre sonra, Dr. James Thomson ilk insan embriyonik kök hücre hatlarını başarıyla kurdu.
2006 yılında, Dr. Shinya Yamanaka tarafından tasarlanan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin ortaya çıkmasıyla büyük bir atılım meydana geldi. John Gurdon'un çalışmalarına dayanan Yamanaka, şimdi "Yamanaka faktörleri" olarak bilinen küçük bir transkripsiyon faktörü kümesinin ekspresyonunu indüklemek için retrovirüs kullanarak farklılaşmış hücreleri pluripotent bir duruma yeniden programlamak için bir yöntem geliştirdi. Elde edilen hücreler "indüklenmiş pluripotent kök hücreler" veya "iPSC'ler" olarak adlandırıldı. Bu deneyler o kadar önemli kabul edildi ki, Yamanaka ve Gurdon 2012 yılında Nobel Ödülü'ne layık görüldü.
Şu anda, çeşitli insan hastalıklarının iPSC modellerine ve çoklu dokularda rejenerasyon platformlarına sahibiz.
Günümüzde, kök hücre araştırmaları birkaç kapsayıcı soru tarafından yönlendirilmektedir.
Bu soruların en önemlilerinden biri şudur: Kök hücreler pluripotentliği ve yenilenebilirliği nasıl korur? Kök hücrelerin bu özellikleri kazandıran iki ilgili özelliği vardır. Birincisi, kök salgı ve kendini yenileme için gerekli olan belirli genlerin ifadesidir. İkincisi, kök hücrelerin bu genlerin ekspresyonunu etkileyen düzenleyici faktörlere karşı duyarlılığıdır.
Bir sonraki mantıklı soru şudur: kök hücrelerin farklılaşması nasıl yönlendirilir? Bir kök hücre olgun bir hücreye dönüştükçe, spesifik farklılaşma yollarının aktivasyonu, gen ekspresyonunda değişikliklere neden olur, kök hücre genlerini kapatır ve dokuya özgü genleri açar, bu da hücre fonksiyonu ve morfolojisinin uzmanlaşmasının artmasına neden olur.
Son olarak, kök hücre araştırma fonlarını yönlendiren ana soruyu ele alalım: kök hücreler hastalıkları tedavi etmek için kullanılabilir mi? Rejeneratif tıp bu soruyu iki şekilde ele alıyor: 1) laboratuvarda organları yeniden büyüterek ve 2) doku dejenerasyonunu tedavi etmek için nakil yoluyla kök hücreler vererek.
Artık kök hücre biyolojisi ile ilgili bazı önemli soruları sunduğumuza göre, bunları ele almak için kullanılan öne çıkan yöntemlerden bazılarını gözden geçirelim.
Mikroarray teknolojisi, kök hücrelerde hangi genlerin güç ve yenilenebilirlik sağladığını keşfetmek için kullanılabilir. Bu teknikte, toplam RNA, mevcut gen ekspresyonunun bir anlık görüntüsü olarak işlev gören bir hücre popülasyonundan izole edilir. Bir dizi adımda, bu mRNA, floresan olarak etiketlenmiş bir proba dönüştürülür ve tüm insan genomunun transkriptlerini içeren bir çipe hibritlenir. Bu çipin taranması, göreceli gen ekspresyon profillerinin bir okumasını sağlar. Gördüğünüz gibi, bir kök hücre, farklılaşmış bir hücreden farklı olan belirli bir gen kümesini ifade eder.
Pluripotens genleri için başka bir test, Oct4-GFP tespit sistemini içerir. Oct4 kendini yenileme için gereklidir ve farklılaşma sırasında hızlı bir şekilde aşağı regüle edilir. Bu nedenle, ifadesi "saplılık" ın güvenilir bir göstergesi olarak işlev görür. Bu deneyde, hücreler Oct4 promotörün kontrolü altında yeşil floresan proteini eksprese eder. Bu hücreler daha sonra deneysel olarak manipüle edilebilir ve GFP ifadesindeki değişiklikler, kendini yenilemeyi modüle eden yeni genleri veya çözünür faktörleri tanımlamak için analiz edilir.
Kök hücreleri in vitro olarak incelemek için önce onları nasıl kültürleyeceğimizi anlamalıyız. Kök hücreler, saplılığı korumak için belirli bir mikro çevreye ihtiyaç duyar. Bu, kök hücrelerin fare embriyonik fibroblastları veya MEF'ler gibi besleyici hücrelerle birlikte kültürlenmesiyle elde edilebilir. MEF'ler, gerekli pluripotentlik ve kendini yenileme faktörlerinin karmaşık bir karışımını salgılar.
Bazen, besleyici içermeyen kök hücre kültürlerine sahip olmak arzu edilir. Besleyicisiz hücre hatlarını korumanın ana yöntemi, hücre kültürü ortamını büyüme ve inhibitör faktörlerin stok reaktifleri ile takviye etmektir.
Kök hücrelerin in vitro olarak ayırt edilmesi çeşitli yöntemler kullanılarak gerçekleştirilir. Diferansiyel gen ekspresyonu sonuçta hücrelerin özelleşmesinden sorumludur. Burada gördüğünüz iki aşamalı yöntemde, kültürlenmiş fare embriyonik kök hücreleri, motor nöron indüksiyon ortamı ile daha fazla farklılaşmadan önce bir nöronal kader için hazırlanır. Bu faktörler, gen ekspresyonunun spesifik yollarını aktive ederek motor nöronların karakteristik morfolojik ve proteomik değişikliklerine neden olur.
Geleneksel in vitro farklılaşmanın en büyük dezavantajlarından biri, düz plakaların hücrelerin 3D büyümesini kısıtlamasıdır. Asılı bırakma yöntemi ve mikrokapsül yöntemleri bu sorunları ortadan kaldırır. Asılı damla tekniğinde, küçük damla kök hücre süspansiyonları bir petri kabının kapağına kaplanır ve embriyoid cisimleri olarak bilinen kök hücre agregatlarını oluşturmak için baş aşağı kültürlenir.
Mikroenkapsülasyon yöntemlerinde kök hücreler, aljinat adı verilen biyouyumlu yarı geçirgen bir zar ile karıştırılır ve boncuklar halinde hücre kültürü plakalarına bırakılır. Her iki yöntem de dopaminerjik nöronlar ve kardiyomiyositler gibi özel hücrelere daha fazla farklılaşmaya izin verir.
Farklılaşmanın nasıl yönlendirileceğini bilmek, kök hücrelerin rejeneratif tıpta kullanılmasına yönelik önemli bir adımdır. Kök hücre nakli tedavisi, hasarlı dokuları kök hücrelerle onararak dejeneratif hastalıkları tedavi etmeyi ve iyileştirmeyi amaçlar. Bu deneyde, hastalardan alınan somatik hücreler, Yamanaka faktörlerinin lentivral enfeksiyonu yoluyla iPS hücrelerine yeniden programlanmıştır. Pluripotent durumlarından, hücreler belirli hücre tiplerine ayrılır ve hasarlı dokuyu onarmak için konakçıya geri gönderilir.
Artık kök hücreleri araştırmak için kullanılan yöntemlerden bazılarını bildiğinize göre, bu yöntemlerin belirli deneylerde nasıl uygulandığına bir göz atalım.
Multipl sklerozlu bir fare modeli kullanılarak yapılan bu deneyde, nöral kök hücreler etkilenen farelere intravenöz olarak enjekte edilir. Transplantasyonun başarısını değerlendirmek için tedavi edilen farelerin beyin dilimleri toplanır ve mikroskop altında görüntülenir. Donör nöronal öncü hücrelerden türetilen hücreler, raportör gen LacZ kullanılarak izlenir. Gördüğünüz gibi, bir dizi donör kök hücre farklılaşmış ve hastalıklı farelerin merkezi sinir sistemine entegre edilmiştir.
Her hastalık sistemik enjeksiyonlarla tedavi edilemez. Örneğin kıkırdak yaralanmaları, etrafını yeniden inşa etmek için özel bir iskele gerektirir. Bu deneyde, mezenkimal kök hücreler ve pıhtılaşma faktörlerinin bir karışımı, bir pıhtı oluşturmak için birlikte kültürlenir. Pıhtı daha sonra bir tavşanın hasarlı diz kıkırdağına yerleştirilir ve bütünleşmesine izin verilir. Bu prosedürü takiben, diz kıkırdağının düzgün ve fonksiyonel bir eklem haline gelmesi gözlemlenebilir.
Bazen, kök hücre araştırmacıları ve doku mühendisleri tüm organları yeniden inşa etmek için bir araya gelirler. Bu deneyde, primat akciğerleri organı hücreden arındırmak için yıkanır ve geride sadece hücresel olmayan yapısal bileşenler kalır. Bu "hayalet" akciğer daha sonra bir biyoreaktöre aktarılır ve burada vasküler ve epitelyal kök hücrelerle tohumlanır. Doğal bir akciğerin deneyimlediği basınç ve davranışı daha fazla taklit etmek için, biyoreaktör ortamı dolaştırır, basınç ve gaz seviyelerini korur ve akciğerleri şişirir.
Az önce JoVE'nin kök hücre biyolojisine genel bakışını izlediniz. Özetlemek gerekirse, bu videoda kök hücreleri ve tarihçesini, bakımını, farklılaşma ve verme yöntemlerini ve kök hücre uygulamalarını ele aldık. İzlediğiniz için teşekkürler!
Adından da anlaşılacağı gibi, kök hücreler birçok farklı hücre tipinin "kaynaklandığı" öncülerdir. Potansiyelleri veya her üç germ katmanından hücrelere farklılaşma yeteneklerinin yanı sıra yenilenebilirlikleri veya daha fazla kök hücre üretme kapasiteleri ile karakterize edilirler. Gelişimsel biyoloji ve rejeneratif tıp alanlarını ilerletme umuduyla, kök hücre araştırmacıları, bu benzersiz hücrelerin bu kadar büyük bir başarıyı nasıl başardığını anlamak için çalışıyorlar.
Bu video, kök hücre biyolojisi alanındaki önemli keşifleri, bu alandaki bilim insanlarının sorduğu temel soruları, kök hücre araştırmacıları tarafından kullanılan öne çıkan yöntemleri ve kök hücre araştırmalarının uygulamalarını kapsamaktadır.
Kök hücre kavramını tanıttığımıza göre, kök hücre araştırmalarının zengin tarihine geçelim.
1960'lı yıllarda, Dr. Ernest McCulloch ve Dr. James Till, yetişkin memelilerin kemik iliğinde hematopoetik kök hücrelerin varlığına dair ilk kesin kanıtlardan bazılarını keşfettiler. Bu hücreler kendi kendini yenileme yeteneğine sahiptir ve multipotenttir, yani çok sayıda, ancak sınırlı hücre türlerine, yani kan ve bağışıklık sistemi hücrelerine farklılaşabilirler.
1988'de Irving Weissman ve meslektaşları, hematopoetik kök hücrelerin fare kemik iliğinden saflaştırılması için bir yöntem geliştirdiler.
1981'de Profesör Gail Martin "embriyonik kök hücre" terimini icat etti. Hematopoetik kök hücrelerin aksine, embriyonik kök hücreler pluripotenttir ve vücudun tüm hücre tiplerine farklılaşma yeteneğine sahiptir. O ve bilim adamları Martin Evans ve Matthew Kaufman, aynı anda, ancak ayrı ayrı, fare blastosistlerinden iç hücre kütlesini çıkarmak ve bunları in vitro kök hücreler olarak kültürlemek için yöntemler geliştirdiler.
1998 yılında, fare embriyonik kök hücrelerinin izolasyonundan on yıldan fazla bir süre sonra, Dr. James Thomson ilk insan embriyonik kök hücre hatlarını başarıyla kurdu.
2006 yılında, Dr. Shinya Yamanaka tarafından tasarlanan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin ortaya çıkmasıyla büyük bir atılım meydana geldi. John Gurdon'un çalışmalarına dayanan Yamanaka, şimdi "Yamanaka faktörleri" olarak bilinen küçük bir transkripsiyon faktörü kümesinin ekspresyonunu indüklemek için retrovirüs kullanarak farklılaşmış hücreleri pluripotent bir duruma yeniden programlamak için bir yöntem geliştirdi. Elde edilen hücreler "indüklenmiş pluripotent kök hücreler" veya "iPSC'ler" olarak adlandırıldı. Bu deneyler o kadar önemli kabul edildi ki, Yamanaka ve Gurdon 2012 yılında Nobel Ödülü'ne layık görüldü.
Şu anda, çeşitli insan hastalıklarının iPSC modellerine ve çoklu dokularda rejenerasyon platformlarına sahibiz.
Günümüzde, kök hücre araştırmaları birkaç kapsayıcı soru tarafından yönlendirilmektedir.
Bu soruların en önemlilerinden biri şudur: Kök hücreler pluripotentliği ve yenilenebilirliği nasıl korur? Kök hücrelerin bu özellikleri kazandıran iki ilgili özelliği vardır. Birincisi, kök salgı ve kendini yenileme için gerekli olan belirli genlerin ifadesidir. İkincisi, kök hücrelerin bu genlerin ekspresyonunu etkileyen düzenleyici faktörlere karşı duyarlılığıdır.
Bir sonraki mantıklı soru şudur: kök hücrelerin farklılaşması nasıl yönlendirilir? Bir kök hücre olgun bir hücreye dönüştükçe, spesifik farklılaşma yollarının aktivasyonu, gen ekspresyonunda değişikliklere neden olur, kök hücre genlerini kapatır ve dokuya özgü genleri açar, bu da hücre fonksiyonu ve morfolojisinin uzmanlaşmasının artmasına neden olur.
Son olarak, kök hücre araştırma fonlarını yönlendiren ana soruyu ele alalım: kök hücreler hastalıkları tedavi etmek için kullanılabilir mi? Rejeneratif tıp bu soruyu iki şekilde ele alıyor: 1) laboratuvarda organları yeniden büyüterek ve 2) doku dejenerasyonunu tedavi etmek için nakil yoluyla kök hücreler vererek.
Artık kök hücre biyolojisi ile ilgili bazı önemli soruları sunduğumuza göre, bunları ele almak için kullanılan öne çıkan yöntemlerden bazılarını gözden geçirelim.
Mikroarray teknolojisi, kök hücrelerde hangi genlerin güç ve yenilenebilirlik sağladığını keşfetmek için kullanılabilir. Bu teknikte, toplam RNA, mevcut gen ekspresyonunun bir anlık görüntüsü olarak işlev gören bir hücre popülasyonundan izole edilir. Bir dizi adımda, bu mRNA, floresan olarak etiketlenmiş bir proba dönüştürülür ve tüm insan genomunun transkriptlerini içeren bir çipe hibritlenir. Bu çipin taranması, göreceli gen ekspresyon profillerinin bir okumasını sağlar. Gördüğünüz gibi, bir kök hücre, farklılaşmış bir hücreden farklı olan belirli bir gen kümesini ifade eder.
Pluripotens genleri için başka bir test, Oct4-GFP tespit sistemini içerir. Oct4 kendini yenileme için gereklidir ve farklılaşma sırasında hızlı bir şekilde aşağı regüle edilir. Bu nedenle, ifadesi "saplılık" ın güvenilir bir göstergesi olarak işlev görür. Bu deneyde, hücreler Oct4 promotörün kontrolü altında yeşil floresan proteini eksprese eder. Bu hücreler daha sonra deneysel olarak manipüle edilebilir ve GFP ifadesindeki değişiklikler, kendini yenilemeyi modüle eden yeni genleri veya çözünür faktörleri tanımlamak için analiz edilir.
Kök hücreleri in vitro olarak incelemek için önce onları nasıl kültürleyeceğimizi anlamalıyız. Kök hücreler, saplılığı korumak için belirli bir mikro çevreye ihtiyaç duyar. Bu, kök hücrelerin fare embriyonik fibroblastları veya MEF'ler gibi besleyici hücrelerle birlikte kültürlenmesiyle elde edilebilir. MEF'ler, gerekli pluripotentlik ve kendini yenileme faktörlerinin karmaşık bir karışımını salgılar.
Bazen, besleyici içermeyen kök hücre kültürlerine sahip olmak arzu edilir. Besleyicisiz hücre hatlarını korumanın ana yöntemi, hücre kültürü ortamını büyüme ve inhibitör faktörlerin stok reaktifleri ile takviye etmektir.
Kök hücrelerin in vitro olarak ayırt edilmesi çeşitli yöntemler kullanılarak gerçekleştirilir. Diferansiyel gen ekspresyonu sonuçta hücrelerin özelleşmesinden sorumludur. Burada gördüğünüz iki aşamalı yöntemde, kültürlenmiş fare embriyonik kök hücreleri, motor nöron indüksiyon ortamı ile daha fazla farklılaşmadan önce bir nöronal kader için hazırlanır. Bu faktörler, gen ekspresyonunun spesifik yollarını aktive ederek motor nöronların karakteristik morfolojik ve proteomik değişikliklerine neden olur.
Geleneksel in vitro farklılaşmanın en büyük dezavantajlarından biri, düz plakaların hücrelerin 3D büyümesini kısıtlamasıdır. Asılı bırakma yöntemi ve mikrokapsül yöntemleri bu sorunları ortadan kaldırır. Asılı damla tekniğinde, küçük damla kök hücre süspansiyonları bir petri kabının kapağına kaplanır ve embriyoid cisimleri olarak bilinen kök hücre agregatlarını oluşturmak için baş aşağı kültürlenir.
Mikroenkapsülasyon yöntemlerinde kök hücreler, aljinat adı verilen biyouyumlu yarı geçirgen bir zar ile karıştırılır ve boncuklar halinde hücre kültürü plakalarına bırakılır. Her iki yöntem de dopaminerjik nöronlar ve kardiyomiyositler gibi özel hücrelere daha fazla farklılaşmaya izin verir.
Farklılaşmanın nasıl yönlendirileceğini bilmek, kök hücrelerin rejeneratif tıpta kullanılmasına yönelik önemli bir adımdır. Kök hücre nakli tedavisi, hasarlı dokuları kök hücrelerle onararak dejeneratif hastalıkları tedavi etmeyi ve iyileştirmeyi amaçlar. Bu deneyde, hastalardan alınan somatik hücreler, Yamanaka faktörlerinin lentivral enfeksiyonu yoluyla iPS hücrelerine yeniden programlanmıştır. Pluripotent durumlarından, hücreler belirli hücre tiplerine ayrılır ve hasarlı dokuyu onarmak için konakçıya geri gönderilir.
Artık kök hücreleri araştırmak için kullanılan yöntemlerden bazılarını bildiğinize göre, bu yöntemlerin belirli deneylerde nasıl uygulandığına bir göz atalım.
Multipl sklerozlu bir fare modeli kullanılarak yapılan bu deneyde, nöral kök hücreler etkilenen farelere intravenöz olarak enjekte edilir. Transplantasyonun başarısını değerlendirmek için tedavi edilen farelerin beyin dilimleri toplanır ve mikroskop altında görüntülenir. Donör nöronal öncü hücrelerden türetilen hücreler, raportör gen LacZ kullanılarak izlenir. Gördüğünüz gibi, bir dizi donör kök hücre farklılaşmış ve hastalıklı farelerin merkezi sinir sistemine entegre edilmiştir.
Her hastalık sistemik enjeksiyonlarla tedavi edilemez. Örneğin kıkırdak yaralanmaları, etrafını yeniden inşa etmek için özel bir iskele gerektirir. Bu deneyde, mezenkimal kök hücreler ve pıhtılaşma faktörlerinin bir karışımı, bir pıhtı oluşturmak için birlikte kültürlenir. Pıhtı daha sonra bir tavşanın hasarlı diz kıkırdağına yerleştirilir ve bütünleşmesine izin verilir. Bu prosedürü takiben, diz kıkırdağının düzgün ve fonksiyonel bir eklem haline gelmesi gözlemlenebilir.
Bazen, kök hücre araştırmacıları ve doku mühendisleri tüm organları yeniden inşa etmek için bir araya gelirler. Bu deneyde, primat akciğerleri organı hücreden arındırmak için yıkanır ve geride sadece hücresel olmayan yapısal bileşenler kalır. Bu "hayalet" akciğer daha sonra bir biyoreaktöre aktarılır ve burada vasküler ve epitelyal kök hücrelerle tohumlanır. Doğal bir akciğerin deneyimlediği basınç ve davranışı daha fazla taklit etmek için, biyoreaktör ortamı dolaştırır, basınç ve gaz seviyelerini korur ve akciğerleri şişirir.
Az önce JoVE'nin kök hücre biyolojisine genel bakışını izlediniz. Özetlemek gerekirse, bu videoda kök hücreleri ve tarihçesini, bakımını, farklılaşma ve verme yöntemlerini ve kök hücre uygulamalarını ele aldık. İzlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are the two key characteristics that allow stem cells to maintain pluripotency and self-renewal?
Stem cells maintain pluripotency and self-renewal through two related characteristics. First, they express specific genes essential for stemness and self-renewal. Second, stem cells are responsive to regulatory factors that affect the expression of these genes, allowing them to sustain their unique properties and capacity to generate more stem cells.
Q2: How do microarray technology and Oct4-GFP detection systems help researchers study stem cell gene expression?
Microarray technology isolates total RNA from cells and converts mRNA into fluorescently labeled probes hybridized to chips containing the entire human genome, revealing gene expression profiles. The Oct4-GFP detection system uses green fluorescent protein under Oct4 promoter control, since Oct4 is quickly down-regulated during differentiation, making it a reliable indicator of stemness for identifying genes that modulate self-renewal.
Q3: What is the difference between hematopoietic stem cells and embryonic stem cells?
Hematopoietic stem cells, discovered in the 1960s, are multipotent and can differentiate into limited cell types of the blood and immune systems. Embryonic stem cells, identified in 1981, are pluripotent and can differentiate into all cell types of the body. This fundamental difference makes embryonic stem cells more versatile for regenerative medicine applications.
Q4: How do feeder cells and feeder-free culture methods maintain stem cell stemness in vitro?
Feeder cells, such as mouse embryonic fibroblasts, secrete a complex mixture of pluripotency and self-renewal factors necessary for maintaining stemness. Feeder-free cultures achieve this by supplementing cell culture media with stock reagents of growth and inhibitory factors. Both approaches provide the particular microenvironment stem cells require to maintain their unique properties.
Q5: What breakthrough did Shinya Yamanaka achieve with induced pluripotent stem cells?
Shinya Yamanaka developed a method to reprogram differentiated cells to a pluripotent state using retrovirus to induce expression of transcription factors now called the Yamanaka factors. This breakthrough, building on John Gurdon's work, created induced pluripotent stem cells, or iPSCs, which can now model human diseases and support regeneration platforms in multiple tissues.
Q6: How do hanging drop and microencapsulation methods improve stem cell differentiation compared to traditional flat plate cultures?
Traditional flat plate cultures restrict three-dimensional cell growth. The hanging drop method forms embryoid bodies by culturing stem cell suspensions upside down in petri dish drops. Microencapsulation methods mix stem cells with alginate, a biocompatible semipermeable membrane, and deposit them as beads. Both techniques enable three-dimensional differentiation into specialized cells like dopaminergic neurons and cardiomyocytes.
Q7: How are stem cells being applied in regenerative medicine to treat degenerative diseases?
Regenerative medicine uses two main approaches: regrowing organs in the lab and delivering stem cells via transplantation to treat tissue degeneration. Somatic cells are reprogrammed into iPSCs, differentiated into specific cell types, and returned to patients to repair damaged tissue. Examples include neural stem cell injections for multiple sclerosis and mesenchymal stem cells with coagulation factors for cartilage repair.
Chapters in this video
0:00
Overview
0:58
A Brief History of Stem Cell Research
3:22
Key Questions in Stem Cell Biology
4:46
Prominent Methods
9:01
Applications
10:56
Summary
Videos from this collection: