Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Bu intra vital konfokal mikroskopi prosedürünün genel amacı, farelerde kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında mezenterik venlerdeki nötrofillerin ve monositlerin dinamiklerini izlemektir. Bu yöntem, lökosit göçünün, işe alımın ve vasküler endotel ile etkileşimin moleküler temeli gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, devletçi devlet koşulları altında LY 60 düşük monositlerin devriyesini izleme ve analiz etme ve hem monositlerin hem de nötrofillerin aynı damara alımını takip etme yeteneğidir Prosedürü gösteren lokal enflamatuar uyaranlardan sonra laboratuvardan teknisyen Stefan ler Kemik iliğinden tek bir hücre preparasyonu hazırlamak için, Sekiz ila 12 haftalık bir farenin arka bacaklarını% 70 etanol ile sterilize edin ve ardından femurları ve tibiayı toplamak için bir neşter kullanın, tüm kemiklerin bağlantısı kesildiğinde.

Bacakları% 90 etanol ile durulayın ve kemikleri PBS ile doldurulmuş bir kültür kabına aktarın. Daha sonra bir kültür başlığında, femurları ve tibiaları temizlemek ve diz ekleminden ayırmak için neşteri kullanın. Daha sonra, kemiklerin uçlarını kesin ve iliği her kemikten 50 mililitrelik konik bir tüpe akıtmak için 23 gauge iğne ile donatılmış hazırlama ortamı ile yapılmış bir mililitrelik bir şırınga kullanın.

Hücre agregalarını iğne ucundan geri geçirerek parçalayın ve daha sonra hücre süspansiyonunun toplam hacmini taze hazırlık ile 25 mililitreye getirin, hücreleri orta derecede döndürün, ardından yeniden canlandırın. Damağı bir mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponunda askıya alın ve hücreleri buz üzerinde 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. 30 saniye sonra, 10 mililitre hazırlık ile lizisi durdurun. Orta.

Hücreleri tekrar döndürün ve Resus peleti içeri salın. Negatif seleksiyonla nötrofilleri zenginleştirmek için iki mililitre daha hazırlama ortamı. İlk olarak, kemik iliği hücrelerini 150 mikrolitre fare nötrofil zenginleştirme kokteyli ile buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun sonunda 10 mililitre fenol kırmızı içermeyen dmem. Tüpü bir kez ters çevirin ve hücreleri aşağı doğru döndürün. Peleti 1.75 mililitre hazırlama ortamında yeniden askıya alın ve hücreleri beş mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.

Daha sonra hücreleri 250 mikrolitre biotin seçim kokteyli ile 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyon sonunda manyetik partikülleri 30 saniyelik vorteksleme ile hücre izolasyon kitinden uzaklaştırıyoruz. Daha sonra hücreleri 500 mikrolitre parçacık ile 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Kuluçka işleminin sonunda, tüpü mıknatısın içine yerleştirin. Üç dakika sonra, mıknatısı yeni bir beş mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı tüpe ters çevirin. Etiketlenmemiş hücreleri toplamak için, etiketlenmemiş hücrelerin tüpünü mıknatısın içine yerleştirin.

Üç dakika sonra, etiketsiz hücreleri tüpte son damlayı bırakarak aktarmak için mıknatısı 15 mililitrelik konik bir tüpe ters çevirin. Ardından taze fenol kırmızısı ücretsiz dm ile hacmi beş mililitreye getirin. Şimdi burada kullanılan hücre izleyici turuncu gibi uygun sitoplazmik boyadan yarım mikrolitre 37 santigrat derecedeki hücrelere ekleyin.

İki dakika sonra, 37 santigrat derece, hücreleri 2.5 mililitre hazırlama ortamı ile yıkayın ve peleti 1.5 mililitrelik bir tüpte bir mililitre hazırlama ortamında yeniden süspanse edin, hücreleri sayın ve ardından 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Hücreleri döndürdükten sonra, peleti bir mililitre PBS'de askıya alıyoruz ve ardından hücreler dönerken başka bir santrifüjleme yapıyoruz. 30 milimetre çapında bir deliğe sahip 10 santimetrelik bir doku kültürü kabına 35 milimetrelik bir cam kapak kızağı takmak için yağ kullanın.

Daha sonra peleti 100 mikrolitre PBS başına 10 ila yedi hücrede bir kez yeniden süspanse edin ve hücreleri etiketlemeden sonra mümkün olan en kısa sürede buzun üzerine yerleştirin. Etiketli nötrofil hücrelerini intravenöz olarak anestezi uygulanmış sekiz ila 12 haftalık bir CX üç CR bir GFP fareye enjekte edin ve fareyi bir ısıtma yastığına yerleştirin. Daha sonra hemen hayvanın gözlerine merhem sürün ve karın derisini açmak için makas kullanın, peritonu açığa çıkarın, bağırsağı açığa çıkarmak için peritonu makasla kesin.

Daha sonra periton boşluğuna 200 mikrolitre 37 santigrat derece PBS uygulayın ve bağırsakları periton boşluğundan hafif bir basınçla çıkarmak için fareyi doku kültürü kabının üzerine yüzü aşağı çevirin. Daha sonra steril pamuk tomurcukları kullanarak, mezenterik damarları açığa çıkarmak için bağırsakları dikkatlice kapak fişi üzerine sarın ve peristaltizmden kaynaklanan hareketleri azaltmak için dokuyu 37 santigrat derece PBS ile ıslatılmış kağıt mendil parçalarıyla hareketsiz hale getirin. PBS ağırlıklı dokularla bağırsağı dikkatli bir şekilde hareketsiz hale getirmek için zaman ayırmanız çok önemlidir.

Aksi takdirde görüntü elde etme sırasında peristaltik sonucu ortaya çıkan hareketler deneyi bozacaktır. Daha sonra, doku kültürü kabını ve fareyi, ters çevrilmiş bir mikroskobun özel olarak yapılmış bir eser aşamasında 37 derecelik bir termostat odasına aktarın ve arka bacağa intramüsküler olarak ikinci bir anestezik turu uygulayın. Şimdi lazer kaynaklı fototoksisiteyi önlemek için uygun lazerleri gereken en düşük güce ayarlayın ve farenin 30 dakika dinlenmesine izin verin.

Hayvan iyileştiğinde, ilk filmi sabit durum koşullarında 30 dakika boyunca kaydedin. Daha sonra kan damarı iltihabını başlatmak için, 100 mikrogram TLR iki, bir agonist, PAM üç CSK, dört içeren 20 mikrolitrelik bir PBS damlasını doğrudan görüntülenen damarlara dağıtın. Son olarak, iltihap endotel genişliğinde değişikliklere neden olduğundan, agonistin eklenmesinden sonra odağı kontrol etmeye özen göstererek ikinci bir film elde edin, burada Z ekseninin odağını değiştirerek, bir filmin ilk zaman noktası için görüntü işlemenin farklı adımları, az önce gösterildiği gibi, kararlı durum koşulları altında elde edilir, bu filmde gösterilmektedir.

Yeşil LASIK cilo monositlerinin kararlı durum koşulları altında devriye gezmesi, kan dolaşımında dolaşan kırmızı nötrofillerle görselleştirilebilir. Burada. Aynı ilgi alanı, PAM üç CSK dördünün eklenmesinden 90 dakika sonra gösterilir, bu da monositlerin ve nötrofillerin uygun yazılım, monositlerin ve nötrofillerin kesin yollarını kullanarak titizlikle taradığı endotel duvarına büyük miktarda nötrofillerin ve monositlerin alınmasına neden olur. Endotel devriyesi, iltihabın başlamasından önce ve sonra izlenebilir.

Deneyi mahveden bağırsak hareketlerinin bir sonucu olarak Z ekseninde odak kaybının veya XY yer değiştirmesinin meydana gelebileceğine dikkat etmek önemlidir. Bu teknik, lökosit davranışında ilgilenilen spesifik moleküllerin rolünü belirlemek için farklı genetik olarak değiştirilmiş fare modelleri kullanılarak veya bloke edici antikorlar veya farmasötik ilaçlar enjekte edilerek daha da modifiye edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, mezenterik damarlardaki doymuş lökositlerin dinamiklerini nasıl izleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.