Name: Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Öğrenin, anestezi altındaki farelerde mezenterik damarlardaki nötrofil ve monosit dinamiklerini intravital konfokal mikroskopi ile izlemeyi. Bu yöntem, lökosit davranışlarını gerçek zamanlı analiz etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma EMBO (Y.E.'ye), Foundation Machaon (Y.E.'ye) ve SNSF (B.A.I.'ye) tarafından desteklenmiştir. Nikon A1r mikroskobunun kullanılabilirliği ve teknik yardım için Biyogörüntüleme Çekirdek Tesisine teşekkür ederiz. İngilizce düzeltmesi için Bayan Clarissa Bartley'e teşekkür ederiz.

NOT: Hayvan prosedürleri İsviçre&#39;nin Cenevre şehrinde Hayvan Bakım kurumsal Etik Komitesi ve Kanton Veteriner Dairesi ile uygun olarak yapıldı. Yetkilendirme numarası GE / 63/14. Kemik iliğinden tek bir hücre süspansiyonu hazırlanması 1. <ol><li> Servikal dislokasyon ile Kurban fare (eski 8-12 hafta). % 70 etanol ile arka ayakları sterilize. Arka ayakları cildi çıkarın. </li><li> Fare uyluk ve kaval kemiklerinden inceleyin ve bir neşter ile bacaklarından doku kaldırmak. PBS ile dolu bir kültür çanak içine% 90 etanol ve yer ile bacakları durulayın. </li><li> Diz ekleminde bir neşter ve ayrı olan uyluk ve kaval kemiklerinden kültürü kaputu, temiz dokusu altında. Kemiklerin her bir ucunu kesti. </li><li> 50 ml&#39;lik bir 23G iğne ve hazırlama ortamı (fenol kırmızısız DMEM / F12,% 1 sıçan serum) ile dolu bir 1 ml şırınga kullanarak her bir kemikten kemik iliği yıkayın tüp vidalı. Ince 23G NE içinden Pasajlanması hücre agrega DisruptEdle ve 1 ml&#39;lik şırınga. Hazırlık ortamı ile, 25 ml toplam hacim getirin. </li><li> Santrifüj 250 xg 5 dak, 4 ° C. Atın süpernatant. 1 ml içinde süspanse pelet Eritrosit Lizis RBLC tamponu 15 ml tüp vidası (8.3 g NH4CI, distile su ile 1 L&#39;ye tamamlandı 1 g NaHCO 3, 1 ml EDTA (100 mM), 0,22 um filtre). Buz üzerinde 30 saniye inkübe edin. </li><li> Hazırlık orta ve santrifüj 250 x g&#39;de 10 ml, 5 dakika, 4 ° C ekleyin. 2 ml hazırlanmış sıvı supernatant ve tekrar süspansiyon atın. </li></ol> Negatif Seçim ile 2. Nötrofil Zenginleştirme <ol><li> Fare nötrofil zenginleştirme kokteyli (hücre izolasyonu platformu kiti gibi EasySep gibi) 150 ul ekleyin. Karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> Fenol kırmızısı içermeyen DMEM 10 ml ekleyin. Bir kez ters çevirin ve santrifüj 250 xg, 3 dakika, 4 ° C. </li><li> Atın süpernatant. Alt tüpler yuvarlak 5 ml polistiren 1.75 ml hazırlık ortamda süspanse pelet. 250 ul ekle BiotSeçim Kokteyl. Karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> Tanecikleri yeniden sübyeleştirmek için 30 saniye için (hücre izolasyon platformu kit) manyetik parçacıkları vorteksleyin. Hücre süspansiyonunun 500 ul manyetik parçacıkların ekleyin. Karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> Cazibe merkezi haline tüp yerleştirin. 3 dakika bekleyin. </li><li> İstenen Etiketsiz hücreleri toplamak için alt tüpler yuvarlak yeni bir 5 ml&#39;lik polistiren üzerine mıknatıs ters çevirin. Tüp içinde asılı son damlasına almayın. İstenmeyen hücre mıknatıs içine bir tüp içinde kalır. Bir biohazard atık içine bu tüp atın. </li><li> Mıknatıs yeni tüp yerleştirin. 3 dakika bekleyin. </li><li> Yeni 15 ml istenen etiketsiz hücreleri toplamak için tüp vidalı üzerine mıknatıs ters çevirin. Tüp içinde asılı son damlasına almayın. </li><li> Fenol kırmızısı serbest DMEM ile 5 ml Komple hacmi. </li></ol> Nötrofiller 3. Etiketleme <ol><li> Böyle Hücre Tracker Orange olarak turuncu bir boya 0.5 ul ekleyin (çalışma konsantrasyonu1 uM, CMRA - klorometil-RODOL-asetat, hazır DMSO içinde 10 mM). 37 ° C &#39;de 2 dakika kuluçkalayın. </li><li> Hazırlama ortamına 2.5 ml ilave edilir. Santrifüj 250 xg 5 dak, 4 ° C. </li><li> Atın süpernatant. 1.5 ml bir tüp içinde 1 ml hazırlanmış sıvı içinde süspanse pelet. </li><li> Hematositometre ile saymak için bir kısım atın. </li><li> 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edin. Santrifüj 250 xg 5 dak, 4 ° C. </li><li> Atın süpernatant. 1 ml PBS içinde yeniden süspanse pelet. Santrifüj 250 xg, 5 dk, yıkamak için 4 ° C. </li><li> Atın süpernatant. 100 ul PBS başına 10x10 6 hücre olarak süspanse pelet. Iv enjeksiyon kadar buz üzerinde tutun. NOT: Hücreler iv mümkün olduğunca çabuk enjekte olması gerekir. 6-12x10 6 nötrofil / fare genellikle elde edilir. </li></ol> İntra vital mikroskopik 4. Fare Hazırlama NOT:.. Adım 4.1) ve 4.2) ic üzerinde etiketli nötrofil uzun bekleme süresini önlemek için denemenin başında yapılmalıdıre. <ol><li> CX 3 CR1 GFP fare (eski 8-12 hafta) tartılır. </li><li> (PBS içinde 1.75 mg / kg ketamin acepromazone 60 mg / kg, ksilazin 4,5 mg / kg), anestezik 800 ul hazırlayın. </li><li> Fare anestezisi. Fare için 200 ul / 20 g Enjeksiyon ip. Kısma ayak tarafından ve solunum hızını kontrol ederek Kontrol anestezi. </li><li> Nötrofiller (100 ul PBS içinde 10x10 6 hücre), venöz deneyci kolaylık, yanal kuyruk venleri veya retro-orbital sinüs enjekte edilir. </li><li> Isıtma yastığı fare koyun ve göz jeli ile gözleri korumak. </li><li> Bir cam lamel (35 mm çapında), bir 30 mm çapında bir delik olan bir 10 cm doku kültürü çanağı içinde konur. Kullanım yağı lamel ile temas halinde doku kültürü çanak tutmaktır. </li><li> Periton maruz makas ile karın cildi İnsizyon. Bağırsak maruz makas ile periton İnsizyon. </li><li> 200 ul PBS p haline (37 ° C&#39;de önceden ısıtılmış) ilaveeritoneal boşluğu. Elinizdeki fareyi alın ve bağırsak nazik bir basınç ile periton boşluğuna dışarı çıkar böylece, yüzü aşağı çevirin. Doku kültürü çanak fare yerleştirin. </li><li> Yavaşça mezenterik damarları açığa amacıyla lamel üzerine steril pamuk tomurcukları ile bağırsak tekrar turlama. </li><li> Bantlarında kağıt mendil kesin ve 37 ° C ısıtılmış PBS ile ıslatın. Peristaltizm kaynaklanan hareketleri azaltmak için kağıt dokuların adet bağırsak hareketsiz. </li><li> Ters mikroskop ısmarlama tepsi sahneye 37 ° C termostatlı hazne içerisindeki doku kültürü çanak ve fare koyun. Arka bacak içine anestezik sc içeren bir şırınga tanıtın. NOT: Ayrıca, fare bir maske ile oksijen (0.5 L / dk) alabilirsiniz. </li><li> Ayak kısma ve solunum hızı her 30 dakikada bir kontrol ederek anestezi Kontrol fare. Gerekirse, düzgün anesteziyi idame ettirmek için anestezik bir destek (20 ul) teslim. DEĞİLE: damar kurutulması kaçınılmalıdır. Bu nedenle, nem oranının düzenli 37 ° C ısıtılmış PBS ile bağırsak immobilize etmek için kullanılan kağıt mendil ıslatıcı tarafından yapılmaktadır. </li></ol> Intravital Mikroskobu kullanılarak In Vivo iltihaplı Gemiler 5. Ölçme Nötrofil ve Monosit Davranışı <ol><li> Set lazerler ve lazer 488- kaynaklı fototoksisite önlemek için gerekli olan en düşük güçte 561- etmek. Deneylerde, 0,5% &#39;den düşüktür. Nötrofillerinde monositlerinde GFP ve portakal boya Yoğunluğu genellikle% 0.3 yeterli olduğunu çok parlak olduğunu. NOT: Bu bizim sistemimizle 0.15 mW 0.25 bir lazer gücü temsil eder. </li><li> Ters mikroskop 20X kuru objektif kullanarak açık bir iğne deliği ile 2.2 saniyede 512 x 512 piksel (yani 635 mikron) görüntülerini elde edin. Düşük lazer güçler yeterli sinyal sağlayan 20 um 10 arasında bir z-derinlik kullanın. NOT: Biz genellikle 12 ila 16 arasında bir z-derinliği ile deneyler gerçekleştirmek56 m. Sunulan rakamlar ve film durumunda, z-derinlik 20 mm. Faz kontrast endotel duvar belirlenmesini sağlar ve görüntüleme mesenterik damarlar üzerinde gerçekleştirilir. Devriye gezen hücreler ilgi alanı kayıt, 5-10 mikron / dk 6 hızında oldukça yavaş hareket beri her 20 sn tatmin edicidir. Açıklanan ayarlar ile, motorlu sahne aynı anda ilgi kadar 7 alanların kayıt sağlar. </li><li> Onları ilk film edinimi önce 30 dakika boyunca hazırlık kurtarmak için izin vardır fare ve mikroskop termostat odasında mezenterik damarlar yerleştirin. Bu süre zarfında, ilgi alanlarını çeşitli seçin. Amacına en yakın geminin lümen yüzeyi üzerinde odaklanın. Gerekirse, odağı ayarlamak için endotel hafif otomatik floresan yararlanın. NOT: Fare hazırlanması sırasında Cerrahisi hafifçe endotelyumu vurguluyor. Sonuç olarak, nötrofillerin haddeleme ve/ veya monositler, ilk 15 dakika takiben fare hazırlanmasında gözlenebilir. </li><li> Kararlı hal şartları altında, 30 dakika, tek bir görüntü her 20 saniye için bir birinci film kaydedin. NOT: Yazılım 2.2 sn ilgi her alan kazanır ve motorlu sahne otomatik olarak diğer bir alandan geçer. Bu kayıt film 30 dakika boyunca geri 20 saniye içinde ilk pozisyona gider. </li><li> Kan damarı iltihabı başlatmak için, TLR2 100 ug içeren PBS 20 ul bir damla ekleme / TLR1 agonisti Pam3CSK4 12, doğrudan görüntü verilen gemilerin üzerine. </li><li> Ilgi her alan için odağı kontrol edin. NOT: edinim sırasında, her zaman vardır z ekseni üzerindeki odak küçük değişiklikler. 10-20 mikron z-derinliğine rağmen, bu floresans yoğunluğunu bir azalmaya neden olabilir. Gerekirse nedenle, el, her filmin sonunda ilgi her alan yönlendirmesi. 30 dakika-sürelerle ve 3 saat kadar Tutanak filmlerital inflamasyon başladıktan sonra. </li><li> Deneyin sonunda, servikal dislokasyon ile anestezi uygulanmış fare kurban. </li></ol> Film Dosyaları ve lökosit ve Takip 6. Nesil NOT: Nikon kazanım yazılım dosyalarını .nd2 üretir ancak aşağıdaki prosedür diğer yazılım ve markalar ile benzer olacaktır. <ol><li> Tiff serisi olarak ihracat dosyaları. </li><li> ImageJ yazılım (Git <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/).</a> Tiff serisi içe aktarın. Farklı bir dosya olarak Her kanal. </li><li> Arka plan gürültüsünü azaltmak için yeşil ve kırmızı kanallar (Süreç&gt; Filtreler&gt; Medyan ...) için 2.0 piksel yarıçaplı bir medyan filtre uygulayın. </li><li> (İkili olun&gt; Proses&gt; Binary) ikili dosyaları dönüştürün. Her görüntü için eşiği hesaplamak için yazılım etkinleştirin. </li><li> Bir resim serisi (Görüntü&gt; Renk&gt; ... Kanallar Merge) içine kanalları Birleştirme. Lenmesi, monositler seçinn kanal, kırmızı kanal ve gri kanalda iletilen ışık nötrofiller bulunmaktadır. </li><li> RGB renk içine yığılmış görüntüleri dönüştürün (Görüntü&gt; Renk&gt; RGB Stack). </li><li> Avi olarak dosyayı kaydedin </li><li> Veriler ithal ve Imaris yazılımı (Bitplane) derlenmiştir. Monosit ve nötrofillerin hareketleri sonra Nokta İzleme Sihirbazı kullanılarak izlenir. </li></ol>

<ol><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaching+multiple+barriers%3A+leukocyte+motility+through+venular+walls+and+the+interstitium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).</li>
<li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41, 694-707 (2014).</li>
<li>Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLey%2C+K+%22Methods+Enzymol%22">Methods Enzymol</a>. 445, 255-279 (2008).</li>
<li>Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+leukocyte+rolling+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro.</a> Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).</li>
<li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+blood+vessels+and+tissues+by+a+population+of+monocytes+with+patrolling+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior.</a> Science. 317, 666-670 (2007).</li>
<li>Cros, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD14dim+monocytes+patrol+and+sense+nucleic+acids+and+viruses+via+TLR7+and+TLR8+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors.</a> Immunity. 33, 375-386 (2010).</li>
<li>Hanna, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+NR4A1+%28Nur77%29+controls+bone+marrow+differentiation+and+the+survival+of+Ly6C-+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes.</a> Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).</li>
<li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+junctional+adhesion+molecule+JAM-C+regulates+polarized+transendothelial+migration+of+neutrophils+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo.</a> Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).</li>
<li>Proebstl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+support+neutrophil+subendothelial+cell+crawling+and+breaching+of+venular+walls+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo.</a> J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).</li>
<li>Wantha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+cathelicidin+promotes+adhesion+of+classical+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes.</a> Circ Res. 112, 792-801 (2013).</li>
<li>Ozinsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+repertoire+for+pattern+recognition+of+pathogens+by+the+innate+immune+system+is+defined+by+cooperation+between+toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).</li>
<li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498, 371-375 (2013).</li>
<li>Carlin, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nr4a1-dependent+Ly6C%28low%29+monocytes+monitor+endothelial+cells+and+orchestrate+their+disposal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal.</a> Cell. 153, 362-375 (2013).</li>
<li>Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+mouse+bone+marrow+monocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Iqbal, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD68+promoter+GFP+transgenic+mice+allow+analysis+of+monocyte+to+macrophage+differentiation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo.</a> Blood. 124, e33-e44 (2014).</li>
<li>Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+spinning-disk+confocal+microscopy+for+the+intravital+analysis+of+platelet+dynamics+in+response+to+systemic+and+local+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation.</a> PloS One. 6, e25109(2011).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu yazıda anlatılan metodolojiler verimli kararlı durum ve inflamatuar koşullarda mezenterik venlerde monosit ve nötrofil davranışlarını incelemek için tutarlı bir yaklaşım sağlamak. Hazırlık önemli adım PBS ıslak mendil ile bağırsak immobilizasyonu olduğunu. Düzgün gerçekleştirilen Eğer mezenterik damarlar güzel görüntü elde etmek için lamel maruz kalmaktadır. Bu mezenterik venlerde lökosit davranışını izlemek için ilgi çeşitli alanlarda seçimini sağlar. Bizim p...

<html> Nötrofiller ve monositler sürekli dolaşıma doğuştan gelen bağışıklık sistemi hücreleri bulunmaktadır. Yaralanma ya da enfeksiyon üzerine, enflamatuar sinyaller burada hücresel bir bağışıklık tepkisi başlatılması 1-3, hasar görmüş enfekte dokulara lökosit ROS neden olur. Lökosit seferberlik hızlılığı bağışıklık tepkilerinin olumlu sonucunu belirler. Bu karmaşık süreçler lökosit karışmış moleküller üzerinde anlayışlar elde .To dolaşan lökositler ve endotelyum 1-3 arasındaki yapışma temasların kurulması için yardım iltihaplı endotel üzerinde bulunan belirli moleküllerin (örneğin, selektinler, endotel bağlı kemokinler) güveniyor işe alım çağlayan, hücre işe kinetiği görselleştirmek için ve her bir hücre / nüfus davranışlarını izlemek için önemlidir. Etkili bir yöntem ilgi hücrelerinde floresan proteinleri eksprese eden transgenik fareler üzerinde İntra vital mikroskopik içerir. Bugüne kadar içeriği &quot;&gt;, intravital mikroskopi kullanılarak çeşitli yaklaşımlar görüntüye geliştirilen damar 4,5. Mesela, kulak dermis damar sistemi ya da intravital konfokal mikroskobu ile mezenterik damarların görüntüleme kemirgen Ly6C düşük monosit ve insan devriye davranışını tanımlamak için kullanılan CD14 kararlı hal şartları altında 6-8 kan damarlarının lümen tarafında CD16 + monositleri dim. Fare cremaster damar modeli, genellikle transgenik farelerin enflamatuvar veya iskemik koşullar altında nötrofil veya enflamatuar Ly6C yüksek monosit davranışını izlemek için kullanılır. Bu ise durumda, Cremaster IL1β, CCL2, TNFβ ya fMLP intraskrotal enjeksiyon ile uyarılır. 2-4 saat sonra, dokular daha sonra cerrahi dışarı çıkarılmıştır ve intravital konfokal mikroskopi 9-11 ile analiz edilmiştir. Aşağıdaki protokol bir ile aynı anda monositleri ve nötrofilleri izlemek için bir yöntemi tarif etmektedirters floresan konfokal mikroskop. Ayrıca, yöntem lökosit işe kinetiği takip nasıl daha önce görüntü aynı geminin (kararlı hal durumu) ve inflamasyon sonra nasıl ayrıntıları. Bu amaç için, olan monositler eGFP ifade iv portakal renkli bir boya etiketli kemirgen nötrofillerinin, enjekte CX 3 CR1 gfp / ağ fare kullanılır. Ters konfokal mikroskop kullanılarak, (1) izler ve kararlı koşullar ve (2) lokal enflamasyon sonrasında aynı kap içinde iki monosit ve nötrofillerin ilerlemesini takip etmek altında devriye Ly6C düşük monositleri analiz etmek mümkündür. Burada TLR2 / TLR1 agonist Pam3CSK4 12 kullanarak inflamatuar koşullar yaratır. Ayrıca, bu tür görüntüleme belirli nakavt fareler üzerinde ya da engelleme antikorların 6,9,13 varlığında gerçekleştirilir ise lökosit işe çağlayan çeşitli adımlar ilgi belirli moleküllerin rolünü belirlemek için yardımcı olabilir.

<table><tbody><tr><td>5 ml polistiren yuvarlak tabanlı tüpler&nbsp;</td><td>Beckton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>10x CFI Plan Apochromat 0.45&nbsp; &nbsp; DT: 4mm ve nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT: 1mm ve nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Turuncu CMRA Boya</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mıknatıs Kök</td><td>Hücre Teknolojileri</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Fare Nötrofil Zenginleştirme kiti</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>19762</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA</td><td>A15-042</td><td></td></tr><tr><td>Daldırma Yağı Tip A</td><td>Nikon</td><td></td><td>herhangi bir viskoz yağ&nbsp;</td></tr><tr><td>Life Box Sıcaklık Kontrol Sistemi</td><td>Life Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R konfokal mikroskop</td><td>Nikon</td><td>A1R</td><td>ters mikroskop, motorlu x/y/z aşaması, NIS elemanları yazılımı</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>fenol kırmızı içermez DMEM / F12</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21041-025</td><td>herhangi bir fenol kırmızı serbest ortam,</td></tr><tr><td>Invivogen</td><td>tlrl-pms'nin</td> PBS Sıçan <td>serumunda sulandırılması</td><td>PAM3CSK4</td></tr> uygundur <tr><td>EasySep Fare Nötrofil Zenginleştirme kitinde bulunan</td><td></td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü kabı 100</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr></tbody></table>

real time anestetize farelerde intravital mikroskopi mezenterik damarlardaki nötrofiller ve monositler görüntüleme

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Etkin bağışıklık tepkisi enfeksiyon veya hasar bölgesinde kan lökositlerinin hızla harekete bağlıdır. In vivo lökosit göçü incelenmesi damar endotel ile lökosit endotel göç ve etkileşim moleküler temelini anlamak için çok önemlidir. Bir etkili bir yaklaşım ilgi hücrelerinde floresan proteinleri eksprese eden transgenik fareler üzerinde İntra vital mikroskopik içerir. Burada bir ters konfokal mikroskop ile turuncu boya etiketli nötrofil enjekte CX 3 CR1 GFP / ağırlık fare iv görüntüleme monosit ve nötrofillerin için bir protokol mevcut. Time-lapse film hem kararlı hal ve inflamatuar koşullarda mezenterik venlerde lökosit davranışının analizine imkan görüntüleme birkaç saat 30 dk toplandı. Yerel TLR2 / TLR1 agonisti Pam3SK4 kan damarı inflamasyonunu indüklemek ve subseque izlemek Ayrıca adımları açıklarnötrofil ve monositlerin nt işe. Sunulan teknik aynı zamanda lökositlerin diğer popülasyonları izlemek ve diğer uyaranlara veya transgenik fareler kullanılarak lökosit alımı veya insan ticareti karışmış molekülleri araştırmak için kullanılabilir.

Eser gerçek zamanlı olarak kolayca anestezi farelerin mesenterik damarlar içindeki monosit ve nötrofillerin davranışını izlemek için optimize edilmiş bir protokol açıklamaktadır. 37 ° C-termostatlı odacığın kullanımı fare sıcaklığı korumak için zorunludur ve aynı zamanda nedeniyle lökositlerin sıcaklığa bağlı hareket etmektir. Fare hazırlanması Şekil görüntülenir 1. Şekil 2 mikroskop altında görülen tüm bölgeyi gösterir. İletilen ışık mezenterik damarlar (kırmızı ok) ve arterler (mavi o...

Anestezi uygulanmış farelerde intravital konfokal mikroskopi kullanarak kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında mezenterik venlerdeki nötrofillerin ve monositlerin davranışını izlemek için bir protokolü detaylandırıyoruz.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Bu intravital konfokal mikroskopi prosedürünün genel amacı, farelerde kararlı durum ve inflamatuar koşullar altında mezenterik venlerdeki nötrofil ve monositlerin dinamiklerini izlemektir. Bu yöntem, lökosit migrasyonunun, rejrutmanının ve vasküler endotelyum ile etkileşiminin moleküler temellerinin neler olduğu gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, kararlı durum koşulları altında LY 60 düşük monositlerin devriye gezme hareketlerini takip edip analiz edebilme ve lokal inflamatuar stimülasyonlar sonrası aynı damara hem monositlerin hem de nötrofillerin rejrutmanını izleyebilme yeteneğidir. Prosedürü, laboratuvardan teknisyen Stefan ler gösterecektir. Kemik iliğinden tek hücreli bir preparat hazırlamak için, 8 ila 12 haftalık bir farenin arka bacaklarını %70 etanol ile sterilize edin ve ardından tüm kemikler ayrıldıktan sonra femur ve tibiayı toplamak için bir skalpel kullanın.Bacakları %90 etanol ile durulayın ve kemikleri PBS ile doldurulmuş bir kültür kabına aktarın. Ardından, bir kültür kabininde, femur ve tibyaları temizlemek ve diz ekleminden ayırmak için neşter kullanın. Sonrasında, kemiklerin uç kısımlarını kesin ve her bir kemikteki iliği 50 mL'lik konik bir tüpe boşaltmak için 23 gauge iğne takılmış, hazırlama medyumu ile doldurulmuş bir mililitrelik şırınga kullanın.Hücre agregatlarını, iğne ucundan tekrar geçirerek dağıtın ve ardından hücre süspansiyonunun toplam hacmini taze hazırlama besiyeri ile 25 mililitreye tamamlayın, hücreleri santrifüjle çöktürün ve yeniden süspanse edin. Peletini bir mililitre eritrosit lizis tamponunda süspanse edin ve hücreleri buz üzerinde 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. 30 saniye sonra, lizisi 10 mililitre hazırlama besiyeri ile durdurun.Hücreleri tekrar çöktürün ve pelleti, nötrofilleri negatif seleksiyon yoluyla zenginleştirmek için iki mililitre daha hazırlama ortamında yeniden süspande edin. İlk olarak, kemik iliği hücrelerini 150 µL fare nötrofil zenginleştirme kokteyli ile buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.10 ml fenol kırmızısı içermeyen DMEM ile inkübasyonun sonunda, tüpü bir kez ters çevirin ve hücreleri çöktürmek için santrifüjleyin. Peleti 1,75 ml hazırlama besiyerinde yeniden süspande edin ve hücreleri beş mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.Ardından hücreleri, buz üzerinde 10 dakika boyunca 250 µL biotin seçme kokteyli ile inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, hücre izolasyon kitindeki manyetik partikülleri 30 saniye vortexleyerek süspande ederiz. Daha sonra hücreleri, buz üzerinde 10 dakika boyunca 500 µL partikül ile inkübe edin.İnkübasyonun sonunda, tüpü mıknatısa yerleştirin. Üç dakika sonra, mıknatısı yeni bir beş mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı tüpe ters çevirin. İşaretlenmemiş hücreleri toplamak için, işaretlenmemiş hücrelerin bulunduğu tüpü mıknatısa yerleştirin.Üç dakika sonra, etiketlenmemiş hücreleri aktarmak için mıknatısı 15 mililitrelik konik bir tüpe ters çevirin ve son damlayı tüpte bırakın. Ardından, hacmi taze fenol kırmızısı içermeyen dm ile beş mililitreye tamamlayın. Şimdi, burada kullanılan cell tracker orange gibi uygun bir sitoplazmik boyanın yarım mikrolitresini 37 degrees Celsius'de hücrelere ekleyin.İki dakika sonra, 37 °C'de hücreleri 2,5 mL hazırlama medyumu ile yıkayın ve pelletini 1,5 mL'lik bir tüp içinde bir mL hazırlama medyumu ile yeniden süspanse edin, hücreleri sayın ve ardından 37 °C'de beş dakika inkübe edin. Hücreleri santrifüjle çöktürdükten sonra, pelletini bir mL PBS içinde süspanse edin ve hücreler dönerken ardından bir santrifüj daha uygulayın. 30 mm çapında bir deliğe sahip 10 cm'lik bir doku kültürü kabına 35 mm'lik bir cam lameli yapıştırmak için yağ kullanın.Ardından peleti 10⁷ hücre/100 µL PBS olacak şekilde yeniden süspande edin ve etiketleme işleminden hemen sonra hücreleri buz üzerine yerleştirin. Etiketlenmiş nötrofil hücrelerini, anestezi uygulanmış 8 ila 12 haftalık bir CX3CR1-GFP faresine intravenöz olarak enjekte edin ve fareyi bir ısıtma pedinin üzerine yerleştirin. Hemen ardından hayvanın gözlerine merhem uygulayın ve abdominal deriyi açmak için makas kullanarak peritonyumu açığa çıkarın, ardından bağırsakları ortaya çıkarmak için peritonyumu makasla kesin.Ardından, periton boşluğuna 200 µL 37 °C PBS uygulayın ve bağırsakları hafif bir basınçla periton boşluğundan çıkarmak için fareyi doku kültürü kabının üzerine yüzüstü çevirin. Daha sonra, steril pamuklu çubuklar kullanarak bağırsakları dikkatlice lamelin üzerine yuvarlayın; böylece mezenterik damarları açığa çıkarın ve peristaltik hareketlerden kaynaklanan hareketleri azaltmak için dokuyu 37 °C PBS ile ıslatılmış doku kağıdı parçalarıyla sabitleyin. Bağırsağı PBS ile ıslatılmış dokularla dikkatlice sabitlemek için acele etmemek oldukça önemlidir.Aksi takdirde, görüntüleme sırasında peristaltik hareketlerden kaynaklanan yer değiştirmeler deneyi bozacaktır. Ardından, doku kültürü kabını ve fareyi, ters mikroskobun özel yapım takip sahnesi üzerindeki 37 °C sıcaklığındaki termostat odasına aktarın ve arka bacağa intramüsküler olarak ikinci doz anestezik uygulayın. Şimdi, lazer kaynaklı fototoksisiteyi önlemek için uygun lazerleri gerekli olan en düşük güce ayarlayın ve farenin 30 dakika boyunca dinlenmesini sağlayın.Hayvan iyileştiğinde, kararlı durum koşulları altında 30 dakika boyunca ilk videoyu kaydedin. Ardından, kan damarı inflamasyonunu başlatmak için, 100 µg TLR2 TLR1 agonisti PAM3CSK4 içeren 20 µL'lik bir PBS damlasını görüntülenen damarların üzerine doğrudan damlatın. Son olarak, agonistin eklenmesinden sonra odaklamayı kontrol etmeye dikkat ederek ikinci bir video edinin; çünkü inflamasyon endotel genişliğinde değişikliklere yol açarak Z ekseninin odağını değiştirmektedir. Burada, az önce gösterildiği gibi, kararlı durum koşulları altında edinilen bir videonun ilk zaman noktası için görüntü işleme adımları bu videoda gösterilmektedir.Yeşil LASIK cilo monositlerin kararlı durum koşulları altındaki devriye gezme hareketleri, kan akışında dolaşan kırmızı nötrofillerle birlikte görselleştirilebilir. Burada, PAM three CSK four eklenmesinden 90 dakika sonraki aynı ilgi alanı gösterilmektedir; bu durum, nötrofillerin ve monositlerin endotel duvarına kitlesel göçüyle sonuçlanmıştır. Monositlerin izlediği kesin yollar, uygun yazılım kullanılarak titizlikle taranmaktadır. Endotelde devriye gezen monositlerin ve nötrofillerin hareketleri, inflamasyonun başlatılmasından önce ve sonra takip edilebilir.Bağırsak hareketlerinin deneyi bozması sonucunda Z ekseninde odak kaybı veya XY yer değiştirmesi meydana gelebileceğini belirtmek önemlidir. Bu teknik, löksit davranışında ilgilenilen belirli moleküllerin rolünü belirlemek amacıyla farklı genetiği değiştirilmiş fare modelleri kullanılarak veya bloklayıcı antikorlar ya da farmasötik ilaçlar enjekte edilerek daha da geliştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, mezenterik venlerdeki saturasyon yapan lökositlerin dinamiklerini nasıl izleyeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

imaging-neutrophils-monocytes-mesenteric-veins-intravital-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz aydınlık intravital mikroskopi, in vivo olarak nötrofil kemoatraktan kaynak yanıt nötrofil göçünü sırasında dinamik nötrofil-endotel hücre etkileşimleri ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır. Nötrofil intraluminal tarama, fare Cremaster'ın kas dokusu transendoteliyal göç ve kemotaksis zaman lapsed video ImageJ ile fotoğraf ve takip ile görüntülendi.

Takip Nötrofil Lumen Crawling, intravital video Mikroskopi Doku transendoteliyal Göç ve Kemotaksis

Bu videoda, intraperitoneal olarak lipopolisakkarit enjekte edilen bir fare modelinin mezenterial damarlarındaki kan hücresi-endotel etkileşimlerinin gerçek zamanlı görselleştirmesini gösteriyoruz.

Bir Enflamasyon Fare Modelinde Kan Hücresi-Endotel Etkileşimlerini Analiz Etmek için İntravital Mikroskopi

Burada vasküler inflamasyon ve canlı farelerde trombüs oluşumu sırasında aktive endotel üzerindeki heterotipik trombosit-nötrofil etkileşimleri görselleştirmek için floresan intravital mikroskobu deneysel bir tekniktir rapor. Bu mikroskobik teknoloji vasküler hastalığın moleküler mekanizmasını incelemek ve patofizyolojik durumlardaki farmakolojik ajanları test için değerli olacaktır.

Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme

Farelerde mezenter damarlarının intravital mikroskopisinin bu basitleştirilmiş uygulaması, lökosit-endotel ve trombosit-lökosit etkileşimlerini gözlemlemek için farklı inflamasyon modellerinde kullanılabilir.

Farelerde mesenteriumda Damarlardaki intravital Mikroskopi Lökosit-endotelyal ve Trombosit-lökosit Etkileşimleri

Bu mevcut protokol, canlı hayvanlarda nötrofil hazırlamanın dinamik sürecinin izlenmesini sağlamak için floresan raportörler, in vivo etiketleme ve intravital görüntüleme teknikleri kullanır.

IL-1β Promoter odaklı DsRed Muhabir Fare kullanma Nötrofil Hazırlama intravital Görüntüleme

Protokol, femoral kemik iliğindeki hücrelerin hareketini in vivo olarak izlemek için kullanılabilecek yeni bir murin femur pencere odası modelini tanımlar. İntravital multifoton floresan mikroskobu, zaman içinde femur kemik iliğinin üç bileşenini (vaskülatür, kollajen matrisi ve nötrofiller) görüntülemek için kullanılır.

için Femur Pencere Odası Modeli<em&gt; İn Vivo</emFare Kemik İliği içinde&gt; Hücre Takibi

Monosit arteriogenesis periferik arter hastalığı bağlamında önemli arabulucu vardır. Bu iletişim kuralı bir membran benzeri matris ve intravital mikroskobu kullanarak, monosit enjeksiyon femoral arter ligasyonu fare modeli sonra monosit izleme ve tümör ile ilgili angiogenez inceler.

Monosit posta ve tümör ile ilgili angiogenez periferik arter hastalığı, bir fare modeli intravital mikroskobu

Biz GFP etiketli γδ IELS görselleştirmek için bir yöntem açıklamak, ters dönen disk konfoksel mikroskobu tarafından murine ince bağırsak intravital görüntüleme kullanarak. Bu teknik, 4 h 'ye kadar mukoza içindeki canlı hücrelerin takibini sağlar ve çeşitli bağırsak immün-epitelyal etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir.

Murine Ince bağırsak INTRAEPİTELYAL lenfosit intravital görüntüleme

Lökosit ve trombositlerin işe alınması, arteriyogenez sırasında kollateral arterlerin etkili büyümesi için gerekli olan önemli bir bileşeni oluşturur. Multifoton mikroskopisi, arteriyogenez sırasında lökosit alımını ve ekstravazasyonunu incelemek için in vivo yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe ve daha az foto-toksisiteye sahip hücre dinamiklerini izlemek için etkili bir araçtır.

Bir Murin Arka Bacak Modelinde Arteriyogenez Sırasında Lökosit Alımını İzlemek için Multifoton İntravital Görüntüleme

Nötrofil göçü, kemoatraktana ve hücre dışı mikro çevre ile etkileşimlerine yanıt olarak plazma zarının hızlı ve sürekli olarak yeniden şekillenmesine dayanır. Burada açıklanan, anestezi uygulanmış farelerin kulağına enjekte edilen nötrofillerde zar yeniden şekillenmesinin dinamiğini araştırmak için İntravital Hücre Altı Mikroskobuna dayalı bir prosedürdür.

Fizyolojik Koşullar Altında Hücre Altı Membran Yeniden Şekillenmesini Araştırmak için Fare Derisinde Nötrofil Migrasyonunun Görüntülenmesi

Bu protokol, mezenterik iskemi-reperfüzyon hasarını indüklemek ve mezenterik venüllerde nötrofil hücre dışı tuzakları (NET'ler) intravital mikroskopi kullanarak görüntülemek için bir yöntem sunar. Superior mezenterik arterdeki kan akışı 1 saat boyunca kısıtlandı, ardından reperfüzyon yapıldı ve lökosit yapışması ve NETosis'in doğrudan ölçülmesine izin verildi.

Mezenterik İskemi-Reperfüzyon Yaralanması Sonrası Mezenterik Venüllerde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İntravital Mikroskopi ile Görüntülenmesi

Öğrenin, anestezi altındaki farelerde mezenterik damarlardaki nötrofil ve monosit dinamiklerini intravital konfokal mikroskopi ile izlemeyi. Bu yöntem, lökosit davranışlarını gerçek zamanlı analiz etmeyi sağlar.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Daha fazla video keşfet