İçi periton Yumurtalık Kanseri Metastaz kantitasyonu

Over kanseri metastazı, tümör yükünün doğru görsel kantitasyonunun zor olduğu çok sayıda yaygın intraperitoneal lezyon ile karakterizedir. Burada, kırmızı floresan protein (RFP) etiketli tümör hücreleri ve optik görüntüleme kullanarak metastatik tümör yükünün in situ ve ex vivo kantitasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır.

Bu deneyin genel amacı, sinjeneik ortotopik ksenogreft murin modelinde intraperitoneal over kanseri metastazının nispi tümör yükünü belirlemektir. Göreceli tümör yükünü görüntülemek ve ölçmek için kullanılan bu yeni yöntem, yumurtalık kanseri metastazının düzenlenmesinde temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, floresan spektrumların karıştırılmamasıyla, doku oto floresansının görüntülerden çıkarılması ve standartlaştırılmış, göreceli tümör yükünün ölçülmesini sağlamasıdır.

Bu teknik, insan yumurtalık kanseri metastazı hakkında, terapötiklerin etkinliğinin izlenmesine yönelik çıkarımlarla ilgili içgörüler sağlar. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir çünkü görüntülerden nicel verileri çıkarmak için sağlam bir görüntüleme tekniğini analitik bir prosedürle birleştiriyoruz. Bugünkü prosedürü Stack Lab'ın laboratuvar Program Yöneticisi Yueying Liu gösterecek.

10 haftalık tümör hücresi büyümesinden sonra, anestezi uygulanmış her farenin vücudunu birer birer küçük bir hayvan optik görüntüleme sistemine yerleştirin. Kohorttaki tüm fareleri her zaman noktasında tarayın. Floresan etiketli tümör hücrelerini gözlemlemek için, toplam beş görüntü toplamak için çok spektral bir edinim gerçekleştirin.

15 saniyelik standart bir pozlama, ikiye iki gruplama, 16 santimetrelik bir görüş alanı ve 1,1'lik bir F durağı seçin. Daha sonra, açık bir uyarma filtresinden gelen beyaz ışık, açık bir emisyon filtresi, ikiye iki gruplama ile 0,2 saniyelik standart bir pozlama ve 2,8'lik bir F durağı ile 16 santimetrelik bir görüş alanı kullanarak tüm hayvanın yansıma görüntüsünü elde edin. Ötenaziyi takiben, cildi farenin ventral orta hattı boyunca, uylukların üstünden göğüs kafesinin altına kadar öne doğru kesmek için sivri diseksiyon makası kullanın.

Periton duvarını delmemeye dikkat ederek cildi periton dokusundan nazikçe ayırın. Daha sonra, iki deri kanadı oluşturmak için hem göğüs kafesinin alt kısmı hem de uylukların üst kısmı boyunca yanlamasına kesin. Fareyi tarayıcıda ventral tarafına yerleştirin, böylece periton boşluğu cilt kanatları çekilerek aşağı bakacak şekilde yerleştirin.

Daha önce canlı fare için kullanılan parametrelerin aynısını kullanarak fareyi organlarıyla yerinde tarayın. Şimdi, standart teknikler kullanarak karaciğeri, omentumu, pankreası, mideyi, diyaframı ve ince ve kalın bağırsakları çıkararak fareyi incelemeye devam edin. Ayrıca sol ve sağ peritonu, yumurtalıkları, böbrekleri, mezenteri ve son olarak yağ pedini çıkarın.

Organlardaki görünür tümörlerin her birini gözlemleyin, numaralandırın ve kaydedin. Her tümörün çapını ölçmek için bir kumpas kullanın. Çapı iki milimetreden küçük, iki ila beş milimetre arasında orta ve beş milimetreden büyük olan tümörleri büyük olarak belirleyin.

Ardından, organları, beraberindeki metin protokolünün Şekil Dört'ünde bulunan organ tarama şablonuna yerleştirin ve bir sonraki tarama sırasında her organın konumunu düzenlemek için kullanın. Organları nemli tutmak için PBS kullanın. Küçük hayvan optik görüntüleme sistemini ve daha önce kullanılan parametreleri kullanarak her bir organ tabakasını tarayın.

Taramadan sonra, organları% 10 formaldehit içine yerleştirin ve standart teknikler kullanarak histoloji için işleyin. Her çok spektral taramada otomatik floresan miktarını azaltmak için, önce kırmızı floresan proteini in vivo spektral dosyayı, ardından karıştırılmamış görüntüler penceresinde otomatik zemin in vivo kırmızı dosyasını yükleyin ve karışımı kaldır'ı seçin. Ardından nokta bip dosyalarını 16 bit ölçeklenmemiş nokta tif biçiminde dışa aktarın ve dosya'ya gidip açarak ve ardından doğru 16 bit nokta tif dosyasını seçerek bunları Görüntü J'ye yükleyin.

Ardından, görüntü menüsüne gidin ve ayarla'yı, ardından parlaklık kontrastını seçin ve görüntülenen minimum değeri sıfıra ve görüntülenen maksimum değeri artı 35353 olarak ayarlayın. Ardından görüntü menüsü altında tekrar tabloları aramaya gidin ve kırmızı sıcak'ı seçin. Çeşitli hayvan modelleri farklı parlaklık seviyeleri gerektirecektir, ancak belirli bir çalışma boyunca parlaklığı tutarlı tutmak önemlidir.

Serbest el seçimi aracını kullanarak, her organın etrafına serbest formda bir ilgi alanı seçimi çizin. Serbest formla ilgilenilen bölge, organ sınırlarına yakın bir yerde çizilmelidir. Ardından, her organın yüzey alanını hesaplamak üzere ölçüm aracını kullanmak için control ve M yazın.

Bu verileri bir elektronik tabloya kaydedin. Her organın etrafına çizilen ilgi alanıyla, sağ tıklayın ve yalnızca organı dahil etmek için çoğalt'ı seçin. Ardından, görüntünün altında ayarla'ya, ardından eşiğe gidin ve alt eşik seviyesini artı 1, 200 ve üst eşik seviyesini artı 1, 700 olarak ayarlayın.

Ayrıca, koyu arka planı kontrol edin ve ardından Tamam'ı seçin. Bu, yalnızca en parlak floresan bölgeleri seçecektir. Görüntüler, yukarıda gösterildiği gibi, analiz adımı için daha önce en parlak alanların seçilmesi için Görüntü J'deki eşik kaydırıcılarının manuel olarak değiştirilmesini gerektirebilir.

Farklı hastalık modelleri farklı eşik kısıtlamaları gerektirecektir, ancak belirli bir çalışma boyunca eşik seviyelerini tutarlı tutmak önemlidir. Analiz altında, parçacıkları analiz et'i seçin ve pikselin karesinin boyutunu 10 olarak sonsuz olarak değiştirin. Anahatları göstermeyi seçin ve yalnızca sonuçları görüntüle'yi işaretlemek için işaretleyin ve ardından Tamam'ı tıklatın.

Bu, tümör olarak kabul edilen parlak bölgelerin hem alanlarını hem de ham entegre yoğunluklarını ölçecektir. Her bir tümör seçiminin yüzey alanı değerlerini ve ham entegre yoğunluğunu, organ yüzey alanlarını içeren aynı elektronik tabloda birlikte kaydedin. Ardından, analiz altında Araçlar'ı seçin ve kalibrasyon çubuğuna gidin.

Organların görüntülerine bir kalibrasyon ölçek çubuğu ekleyin. Montajlar, belirli bir çalışma tarafından dikte edildiği gibi daha fazla veya daha az sayıda organ içerebilir. Ardından, dosya altında, farklı kaydet'e gidin ve montajı hem nokta tif hem de nokta jpeg olarak kaydedin.

Ardından, organların nokta jpeg dosyasını açın ve her görüntüye bir metin kutusu eklemek için ekle menüsüne gidin. Üç organ satırının her birinin altında bir metin kutusu oluşturarak organ etiketleri ekleyin. Tüm vücut taramalarının 16 bitlik nokta tif dosyalarının her birini fare numarası sırasına göre Görüntü J'ye açın.

Ardından, görüntü menüsüne gidin ve ayarla'yı ve ardından parlaklık kontrastı'nı seçin. Görüntülenen minimum değeri sıfır olarak ve görüntülenen maksimum değeri artı 35353 olarak ayarlayın. Ardından, görüntü menüsüne geri dönün ve tablolara bakın ve ardından kırmızı sıcak'ı seçin.

Bu tamamlandıktan sonra, montajı hem nokta tif hem de nokta jpeg dosyası olarak kaydedin. Görüntülemeden 10 hafta önce farelere enjekte edilen ID8 murin yumurtalık kanseri hücre hattı, kırmızı kanalda floresan yayılır ve büyüme boyunca bunu yapmaya devam eder. Küçük bir hayvan optik görüntüleme sistemi kullanılarak yapılan canlı görüntüleme, faredeki genişleyen ID8 hücrelerini görüntüleyebilir ve tümör yükünü değerlendirmek için fareyi tartmaktan daha doğru bir yaklaşım sağlar.

Ötenazi ve ventral cilt tabakasının çıkarılmasını takiben, sağlam organlar daha ayrıntılı olarak görüntülenebilir. Bununla birlikte, organ tarama şablonuna yerleştirilen bireysel organlar, her organdaki tümör yükünü net bir şekilde gösterir. Solda gösterilen farenin omentum ve pankreas, yumurtalıklar ve mezenterindeki tümör yükü, sağda gösterilen faredeki aynı organlardan çok daha fazladır.

Diferansiyel tümör yükünün gözlenmesi, hem tümör servis alanı hem de tümör sinyal yoğunluğu açısından kantitatif olarak doğrulanmıştır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik saatte 18 canlı fareyi görüntülemek için kullanılabilir. Tek tek organların diseksiyonu ve ex vivo görüntülemesi numune başına yaklaşık 20 dakika sürer.

Bu prosedürü takiben, 2015 kanser araştırma makalemizde gösterildiği gibi, obezitenin yumurtalık kanseri metastazı üzerindeki etkisi gibi hipotezleri ele almak için kantitatif manyetik rezonans gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.