8 Aralık 2015
Gelişmiş karanlık alan mikroskobu ve spektral haritalama ile hiperspektral görüntüleme, geleneksel yöntemlere göre daha hızlı ve doğru bir şekilde histolojik örneklerdeki nano ölçekli malzemelerin taranmasını, lokalizasyonunu ve tanımlanmasını sağlar. Bu makalenin amacı, histolojik örneklerde metal oksit nanopartiküllerinin karanlık alan görüntüleme ve hiperspektral haritalaması için yöntemler sağlamaktır.
Bu prosedürün genel amacı, karanlık alan mikroskobu ve hiperspektral haritalama ile histolojik örneklerdeki metal oksit nanopartiküllerini tanımlamaktır. Bu, önce nanopartiküller içeren pozitif bir kontrol numunesinde bir ilgi alanı tanımlanarak ve bir karanlık alan görüntüsü yakalanarak gerçekleştirilir. İkinci adım, hiperspektral kamerayı kullanarak ilgilenilen bölgenin bir hiperspektral görüntüsünü veya veri küpünü oluşturmaktır.
Daha sonra, pozitif kontrol veri küpünden bir referans spektral kitaplığı oluşturulur ve bu, herhangi bir yanlış pozitifi ortadan kaldırmak için negatif bir kontrole göre filtrelenir. Son adım, aynı bileşime sahip nanopartikülleri tanımlamak ve bulmak için deneysel örneklere karşı haritalama yapmak için referans spektral kitaplığını kullanmaktır. Sonuç olarak, gelişmiş karanlık alan mikroskobu ve hiperspektral haritalama, histolojik örneklerdeki metal oksit nanopartiküllerini elektron mikroskobu gibi diğer tekniklerden daha hızlı ve daha az kaynak yoğun bir şekilde tanımlamak için kullanılır.
Bu yöntem, elektron mikroskobu gibi geleneksel nanomalzeme görüntüleme ve karakterizasyon tekniklerine göre çeşitli avantajlar sunar. Bu durumda, numune hazırlama tipik olarak minimaldir ve tahribatsızdır. Görüntü elde etme ve analiz etme daha az zaman ve maliyet yoğundur ve çeşitli matrislerde nanopartikül görüntüleme için uygulanabilir.
Bireyler metodolojinin bazen mücadele ettiğini biliyorlardı çünkü uygun pozitif kontrol örneklerini ve referans spektral kütüphanelerini oluşturmak hem zor hem de zaman alıcıydı. Ancak bu ilk adımlar tamamlandıktan sonra, deneysel örnekler oldukça hızlı bir şekilde değerlendirilebilir. Bu yöntem, nanopartiküllerin kutanöz penetrasyonu hakkında bilgi sağlayabilirken, bronkoalveoler lavaj ve kan yaymaları gibi diğer biyolojik numunelerin yanı sıra mesleki maruziyet değerlendirmelerinde kullanılan filtreler gibi biyolojik olmayan numunelere de uygulanabilir.
Bu tekniği göstermek, laboratuvarımdan bir tıp öğrencisi olan Plar Sosa olacak Işık kaynağını, sahne denetleyicisini, optik kamerayı, hiperspektral kamerayı ve bilgisayar sistemini takıp açarak başlayın. Ardından tablayı ve kondansatörü çalışma konumuna getirin ve kondenser merceğine dikkatlice üç ila beş damla A Tipi daldırma yağı uygulayın. Herhangi bir kabarcık oluşursa, yağı silin ve lense tekrar uygulayın.
Ardından, numuneyi sahneye yerleştirin ve daldırma yağı kızağın alt tarafıyla temas edene kadar kondansatörü yavaşça kaldırın. Bu, yağın sürgü ile temas ettiği yerde hızla parlayan aydınlatma halkası aracılığıyla fark edilecektir. Kondansatör yerindeyken, 10 x objektife geçin ve ardından gerekirse parlaklığı en üst düzeye çıkarmak için kondansatörü odaklayın ve hizalayın, kondenser hizalama düğmelerini parlak noktayı ortalayacak şekilde ayarlayın.
Optik görüntüleme yazılımını açın. İnce objektif odak düğmesini kullanarak örneğe odaklanın. Ardından ilgilendiğiniz bir bölge bulun.
Aydınlatmayı dengelemek için kondansatör odağını gerektiği gibi ayarlayın. Menü çubuğundaki ayarlar sekmesine tıklayın ve görüntü yakalama düğmesine tıklayın. Yakalama olayı için.
İstediğiniz görüntü formatını seçin ve görüntü için bir dosya adı atayın. Ayrıca, varsayılan hızlandırılmış değeri seçin ve son olarak Tamam'ı tıklayın. Ardından, pozlama menüsüne gidin ve en yüksek kontrastlı görüntüyü oluşturan pozlama ayarlarını seçin.
Burada seviye %0.0 olarak ayarlanmıştırKazanç 2.8 desibel olarak ayarlanmıştır ve deklanşör hızı 56 milisaniye saniye olarak ayarlanmıştır. Menü çubuğundaki görüntü düğmesine tıklayarak görüntüyü yakalayın. Hedefi 40 x ve 100 x olarak değiştirin.
Görüntüleri daha yüksek büyütme oranlarında yakalayın, ışık kılavuzunun Hiperspektral kameraya yönlendirildiğinden emin olun ve ardından yazılımda HSI veri küplerinin alınması için Hiperspektral görüntüleme yazılımını açın, menü çubuğunda hiperspektral mikroskobu açın ve HSI mikroskop kontrollerini seçin. Burada objektif büyütmeyi ve güvenli yolu ayarlayın. Ardından, ayarlarda alan yakalamayı değiştirin ve satır sayısını değiştirin.
Bu çalışmada pozlama süresini ayarlamak için 720 kullandık. Burada 0.25 saniye kullandık. Diğer her şeyi varsayılan olarak bırakın ve görüntüyü görüntülemek için HSI'yi önizle'ye tıklayın.
Kullanıcı, kamera alanının merkezinin x ekseni boyunca hareket ederken en yüksek dalga boyunun yoğunluğunu temsil eden sonuç yoğunluk grafiğini gözlemleyin. Grafiğin doğru bir taslağını oluşturmak için imleci hareket ettirin. Bu, solda sayısal bir yoğunluk göstergesinin görünmesine neden olacaktır.
Bu görüntüdeki tepe noktalarını keskinleştirmek için ince objektif odağını ayarlayarak görüntüyü bu önizlemeye göre odaklayın. Ardından, kaynak parlaklığını, kondenser odağını ayarlayarak ışık yoğunluğunu optimize edin veya önizlemeyi iptal edin ve yazılımda pozlama süresini ayarlayın. Yakala'yı tıklayın ve mevcut adlara sahip dört yeni pencere olarak gözlemleyin.
Gruplar listesi. Bir numaralı yakınlaştırma. Bir numara, kaydırma ve bir numaralı RGB bandı görünür.
Bir numaralı RGB bant penceresini büyütün, çünkü bu, gelecekteki tüm referanslar için kullanılacak olan veri küpüdür. Sağ? Bu veri küpüne tıklayın, tiff dosyası olarak kaydedin ve Tamam'a tıklayın. Veri küpü görüntü penceresine sağ tıklayın ve Z profil spektrumuna sol tıklayın.
Açılır spektral profil penceresi solda göründüğünde, veri küpü hedefindeki ilgilenilen piksellere tıklayın. En parlak olanlar, ilgilenilen materyali temsil ettiği güvenle tanımlanabilenlerdir. Partikül analizi menüsü altında, veri küpünde bulunan partikülleri tanımlamak için partikül filtresi aracını seçin.
Yeni açılır pencere setinde, spektral maksimum değeri aşmalıdır, bu nedenle arka plan piksellerinden daha yüksek, ancak ilgilenilen malzemelerden daha düşüktür. Geçerli veri maksimum 16.000'dir. Partikül filtresi inceleme aracı penceresinde tümünü seç'e tıklayın.
Ardından spektral kütüphaneye dışa aktar'a tıklayın ve spektral kütüphaneniz için bir ad atayın. Negatif kontrol görevi görecek bir örnek seçtikten sonra, örnekten birkaç veri küpü elde edin. Hiperspektral kamerayı kullanarak en az bir tane gereklidir, ancak daha fazlası yakalanabilir.
Negatif kontrol veri küpü açıkken seçiciliği artırmak için, filtre spektral kitaplığına tıklayın Ana program araç çubuğunda bulunan analiz menüsü altında, yeni dosya aç'a tıklayın ve giriş dosyası olarak pozitif kontrol için daha önce oluşturulan spektral kitaplığı seçin, tamam'a tıklayın. Filtre cyto viva spektral kitaplık penceresinde. Resme tıklayın ve referans spektral kitaplığı için çıktı dosyası adını seçin ve Tamam'a tıklayın.
Ardından, kaynak görüntü olarak negatif kontrol veri küpünüzün dosya adına tıklayın. Yazılım, spektral kitaplığı analiz edecek ve negatif kontrol veri küpünün herhangi bir spektrumuyla eşleşen her spektrumu kaldıracaktır. Deneysel veri küpü açıkken deney örneklerinden Veri küpleri elde edin.
Haritalama yöntemleri alt menüsündeki spektral menüye tıklayın Spektral açı eşleyiciyi açın. Açılan pencerede deneysel veri küpünün adını seçin ve Tamam'ı tıklatın. Listede herhangi bir dosya adı yoksa, yeni dosya aç'ı tıklatın ve deneysel veri küpünü seçin.
Ardından, End Member collection, SAM adlı açılır pencerede tamam'a tıklayın, menü çubuğunda içe aktar'a tıklayın. Ardından Spectral Library dosyasından seçim yapın. Daha önce oluşturulan referans spektral kitaplığını açın ve Tamam'a tıklayın.
Input Spectral Library adlı yeni açılır pencerede, tüm öğeleri seç'e tıklayın, tamam'a tıklayın. Ardından renge sağ tıklayın ve seçin. Varsayılan renkleri tümüne uygula'ya tıklayın, tümünü seç'e ve ardından uygula'ya tıklayın ve ardından çıktı dosyası adını seçin ve Tamam'a tıklayın.
Veri küpü penceresinde kaplama menüsünü açın ve sınıflandırmayı seçin. Ardından çıktı dosyası adına gidin ve Tamam'ı tıklayın. Etkileşimli sınıf aracı penceresi menüsünde, seçenek menüsünü açın ve birleşik bir renk şeması oluşturmak için sınıfları birleştirmeyi seçin.
Verileri başka bir yazılım kullanarak analiz etmeyi kolaylaştırmak için, temel sınıf listesinden tek bir spektrum seçin. Ardından, tabanda birleştirmek için sınıflandırılmamış dışındaki tüm sınıfları seçin. Ardından Tamam'ı tıklayın.
Ardından, seçilen temel renge tıklayın ve eşleşen tüm spektrumlar bu renkte gösterilecektir. Siyah bir arka plan üzerinde eşleşen spektrumları gösterecek amatic görüntü elde etmek için, siyah olan sınıflandırılmamış renkler kutusuna tıklayın Varsayılan olarak, tekniğin en önemli avantajı, karanlık alan mikroskobu ve hiperspektral haritalama ile histolojik örneklerdeki metal oksit nanopartiküllerini tanımlama yeteneğidir. Bu görüntüler, histolojik deri örnekleri kullanılarak bu işlemi göstermektedir.
Bazı parçacıklar karanlık alanda, optik görüntüde kolayca görülebilirken, hiperspektral görüntüleme kullanılarak ek parçacıklar tespit edilir. Burada gösterilen, Illumina nanopartiküllerine maruz kalan epidermis tabakasındaki domuz derisi dokusudur. Silika nanopartiküllerine maruz kalan dermal tabakadaki stratum kornea üzerinde biriken yüksek kontrastlı bir nanopartikül kümesi bulundu.
Bağ dokusu üzerinde biriken çok sayıda yüksek kontrastlı nanopartikül görülebilir. Son olarak, Suriye nanopartiküllerine maruz kalan deri altı dokusunda. Bu yöntem kullanılarak adipositlerin nanopartikül tanımlaması boyunca biriken çoklu yüksek kontrastlı dağılmış nanopartiküller görülebilir.
Akciğer, karaciğer, dalak, böbrekler ve lenf bezleri gibi diğer doku örneklerinde mümkündür. Bu prosedürü takiben, partikül sayısı ve partikül konumu gibi ek soruları yanıtlamak için görüntü analizi yapılabilir. Son derece uzmanlaşmış kontrollere duyulan ihtiyaç ve fotonik görüntülemenin çözünürlüğündeki sınırlamalar gibi bazı hususlar ve dezavantajlar, geleneksel yöntemlerinkilerle tartılmalıdır.
Belirli araştırma sorularını araştırmak için en uygun analitik teknikleri seçerken, mevcut ve gelecekteki nano toksikoloji araştırmalarını tamamlama potansiyeline sahip olduğu için bu özel uygulamayı göstermeyi seçtik. Ayrıca organlar ve dokular boyunca nanopartikül emilimi, dağılımı, metabolizması ve atılımı ile ilgili araştırmaları da bilgilendirebilir.
Bu çalışma, histolojik numunelerdeki metal oksit nanopartiküllerinin tanımlanması için gelişmiş darkfield mikroskopi ve hiperspektral görüntüleme tekniklerini sunmaktadır. Bu yöntemler, geleneksel görüntüleme tekniklerine kıyasla nanopartikül lokalizasyonunun hızını ve doğruluğunu artırmaktadır.
Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral mapping address the growing need for rapid, cost-effective identification of metal oxide nanoparticles in biological matrices, reducing reliance on resource-intensive electron microscopy. This approach supports early-stage nanomaterial safety assessment by enabling localization and characterization in histological samples with minimal sample preparation. The method provides translational value for nanotoxicology studies by delivering spatially resolved data on nanoparticle distribution across tissues.
The technique fits within the discovery continuum from early nanomaterial screening to preclinical safety evaluation, providing imaging-based readouts that inform lead identification and risk assessment decisions.