Fare Modeli Doğrulanması Hücre-spesifik şekilde LINC kompleksler bozacak

Bu deneyin genel amacı, floresan etiketli bir EGFP önbelleğinin, in vivo olarak iki peptitin indüklenebilir ve hedeflenmiş ekspresyonuna ve bunun sonucunda endojen bağlantı komplekslerinin bozulmasına izin veren bir transgenik fare modelinin kullanışlılığını göstermektir. Bu deneyde, floresan etiketli önbelleğin ekspresyonu, serebellar Perkin hücrelerine hedeflenecektir. Bu genetik yaklaşım, çoğu farklı dokuda nükleer konumlandırmada bağlantı komplekslerinin rolü hakkındaki temel soruları ele alabilir.

E-G-F-P-K iki'nin indüklenebilir ve hedeflenmiş ifadesinin çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, mevcut herhangi bir seyir suşuna sahip tek bir cay faresi üreme şeması gerektirir. İkincisi, bu yaklaşım, bağlantı kompleksi bileşenlerinin germ hattı mutasyonlarının fare modellerinde gözlemlenen perinatal aliteyi atlar.

Son olarak, bu yöntem, belirli hücreler veya dokular içindeki bağlantı komplekslerinin fizyolojisini incelemeye izin verir. İn vivo. Laboratuvarın bir üyesi olan Chloe Potter, serebellar Burkin G hücrelerinde E-G-F-P-K iki'yi görselleştirmek için gereken fark adımlarını gösterecek.

Önceki yayınlarda açıklandığı gibi PCP iki CAG C iki fare üretmek için clac Z farelerini PCP ile yetiştirmeye başlamak için iki CRE faresi. Elde edilen yavrular doğduğunda, genotipleme yapın. Daha önce tarif edildiği gibi hem EGFP hem de Cree Transgenlerini barındıranları belirlemek için, PBS'de 50 mililitre% 30'luk bir sükroz çözeltisi hazırlayın ve uygun yaşta doku toplama gününe kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın, Yazılı protokolde tarif edildiği gibi beyin dokusunu diseksiyona hazırlamak için anestezi altında farelerin trans kardiyo perfüzyonunu gerçekleştirin, diseke edilen beyni 10 mililitre PBS ile 10 santimetrelik bir doku kültürü plakasına yerleştirin ve beyinciği beyincikten ayırın.

Daha sonra, serebellumu sagital düzlemde incelemek için bir neşter kullanın ve bölümleri% 30 sükroz çözeltisine aktarın ve gece boyunca dört santigrat derecede saklayın. Bir bulamaç kuru buz ve iki metil bütan hazırlayın. Banyo sıcaklığının beş dakika dengelenmesine izin verin.

Daha sonra, bir kriyo kalıbını OCT bileşiği ile doldurun ve disseke edilmiş beyinciğin yarısını bir diseksiyon mikroskobu ve bir çift forseps kullanarak kalıba yerleştirin. Beyinciğe, beyinciğin orta hattına yakın olan iki disseke yüzey kalıpta yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Daha sonra kriyo kalıbını, OCT bileşiği doku örneğinin etrafında katı beyaz bir matris oluşturana kadar beş dakika boyunca kuru göz bulamacına aktarın.

Gömülü numuneyi ihtiyaç duyulana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Doku kesitlerini toplamak için ön işleme tabi tutulmuş polilisin slaytlarını etiketleyin ve serebellar doku bloğunu taze OCT ile doku tutucuya monte edin. Blok sıkıca takıldıktan sonra, doku tutucuyu monte edin ve dokuya ulaşılana kadar fazla OCT'yi çıkarmak için 40 mikrometrelik dilimler tıraş edin.

Kalınlığı 15 mikrometreye ayarlayın ve sürgünün polilisin kaplı tarafı ile OCT bölümünü dikkatlice temas ettirerek bölümleri toplayın. Boyama ve görüntülemeye devam edene kadar doku bölümlerini eksi 20 santigrat derecede saklayın. Devam etmeye hazır olduğunuzda, floresan proteinlerin solmasını önlemek için serebellar bölümleri karanlıkta çözün.

Hidrofobik bir bariyer kalemi kullanarak, doku bölümlerinin çevresine bir dikdörtgen çizin. Dokuyu sabitlemek için bölümlere beş dakika boyunca yaklaşık 500 mikrolitre% 4 paraform aldehit ekleyin. Ardından, sabitleyiciyi aspire etmek için bir vakum kullanın, doku bölümlerini bir pipetle rahatsız etmemeye özellikle dikkat edin.

Doku bölümlerini rahatsız etmeden slayta PBS'yi nazikçe uygulayın. Beş dakika sonra, sıvıyı dikkatlice çıkarmak için vakumlu pipeti kullanın, PBS durulamasını toplam üç kez tekrarlayın. Daha sonra, slaytlara yaklaşık 500 mikrolitre engelleme çözeltisi ekleyin ve 10 dakika boyunca inkübe edin.

Bloke edici çözeltiyi çıkarın ve daha sonra bir ila 300 dilüsyon kal bağlayıcı veya nesin iki antikor içeren aynı çözelti ile değiştirin. Daha sonra antikor solüsyonunu çıkarın ve slaytları PB S3 ile durulayın. Slaytları karanlıkta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Daha sonra, bağlama etiketli slaytlar için 1000 ila 5 ABD karşıtı Alexa zemin 5 94 ve Nesprin için anti Alexa Fluor 5 94'ü blokaj çözeltisinde hazırlayın ve çözeltileri ihtiyaç duyulana kadar karanlıkta saklayın. Son PBS durulamasını nazikçe çıkarın ve bölümleri karanlıkta bir saat boyunca seyreltilmiş ikincil antikorlarla örtün. İnkübasyonun ardından ikincil antikor solüsyonunu çıkarın.

Daha sonra PBS'de 300 nanomolar'da DPI gibi nükleer boyayı beş dakika boyunca uygulayın. Daha sonra, bölümleri PBS'de iki kez daha durulayın. Mümkün olduğu kadar çok PBS solüsyonunu çıkarın ve doku bölümünü bir damla montaj ortamı ile örtün.

Hava kabarcıklarını önleyerek doku bölümünün üzerine bir cam örtü yerleştirin ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 ila 30 dakika bekletin. Daha sonra antikor boyamasını ve floresan proteinleri görselleştirmek için bir floresan mikroskobu kullanın. Serebellar dilimler için 20 x veya 40 x objektif kullanın.

Burada gösterildiği gibi E-G-F-P-C iki nükleer jantı görüntülemek için, E-G-F-P-C iki Fitzy kanalındaki serebellar dilimlerde doğrudan görselleştirilebilir. Ayrıca, EGFP'nin özellikle Perkin hücrelerini etiketleyen bağlanması ile kolokalizasyonu, EGFP iki ekspresyonunun Perkin hücreleri içindeki perkin hücreleriyle sınırlı olduğunu doğrular. EGFP önbelleği iki, çekirdeğin etrafında gözlemlenen EGFP pozitif RIM benzeri desenlerle gösterildiği gibi nükleer zarfı hedefler.

Bu örnekte, bağlayıcı pozitif Perkin hücrelerinin %70'inden fazlasında EGFP önbelleği iki ekspresyonu tespit edilmiştir. EGFP önbelleği, mevcut güneş alanlarının doygunluğu yoluyla endojen nesprini nükleer zarftan uzaklaştırır. Buna göre, endojen NESIN iki, EGFP önbellek ikisini eksprese eden Perkin hücrelerinin nükleer zarfından yer değiştirir.

E-G-F-P-C iki eksprese etmeyen Perkin hücreleri, beklendiği gibi nükleer zarfta endojen nesin ikisini tutarken, CRE rekombinaz eksprese etmeyen hücreler, tüm bikini hücresi popülasyonunun nükleer zarfında NESIN iki gösterir. Bu nedenle BT doku blokları mevcuttur. E-G-F-P-K iki yaklaşık dört saat içinde görselleştirilebilir.

Bu prosedürü denerken, PFF fiksasyonunun ve / veya gömme koşullarının kapsamının, epitopunuzun antijenisitesini büyük ölçüde etkileyebileceğini hatırlamak önemlidir. Bu nedenle, spesifik epitopunuzu koruyan optimal fiksasyon koşullarını belirlemek çok önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, VGFP kaju fıstığının ifadesini belirli dokulara hedeflemek için CK iki transgenik fare modelinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.