Name: Fare Modeli Doğrulanması Hücre-spesifik şekilde LINC kompleksler bozacak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Öğrenin, Cre/Lox sistemiyle transgenik fare modelinde hücre-spesifik LINC kompleks bozulmasını inceleyin. Bu yöntem, nükleer pozisyonlama ve hücre biyolojisi araştırmalarında değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar (Bölüm Göz ve Görsel Bilimler) Tıp St. Louis Okulu Washington Üniversitesi&#39;nde Fare Genetik Core Moleküler Genetik çekirdek, Morfoloji ve Görüntüleme çekirdeğinin çalışanlarına teşekkür ederiz. Yazarlar Cellular için McDonnell Merkezi ve Moleküler Nörobiyoloji, Sinir Hastalıkları Umut Merkezi&#39;nden küçük hibe programı tarafından desteklenen, Ulusal Göz Enstitüsü (DH # R01EY022632), Ulusal Göz Enstitüsü Merkezi Çekirdek Grant (# P30EY002687) ve Research sınırsız hibe Göz ve Görsel Bilimler Bölümü&#39;ne Körlük Önlemek için.

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürler St. Louis Washington Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Fare Islahı ve Genotiplendirme <ol><li> (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20 Tg üretmek için Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Tg fareler (PCP2-Cre) fareler Breed. Not: Bu protokol kalanı serebellumdaki Purkinje hücreleri EGFP-KASH2 ekspresyonunu sınırlamak için Tg (PCP2-Cre) fare hattı kullanımı üzerinde odaklanmasına rağmen, benzer bir prosedür başka Tg (Cre) fare ile takip edilebilir ( Şekil 2A). </li><li> Daha önce açıklandığı gibi 19 hem EGFP ve Cre transgenini barındıran yavrular tanımlamak için genotipleme gerçekleştirin. </li></ol> Diseksiyon ve Doku Koleksiyonu için Materyallerin 2. Hazırlık <ol><li> -20 ° C&#39;de% 30 PBS sükroz (1x PBS 30 g sükroz / 100 mi) ve deposunun 100 ml hazırlayın. Doku h günlüktranscardial perfüzyonları bir 35 ml şırınganın içine arvesting, çözündürme ve sukroz çözeltisi yük ~ 30-35 ml olmuştur. </li><li> PBS içinde% 4 PFA 40 ml (10 mi,% 16 paraformaldehit ve 30 ml PBS) hazırlayın. Transcardial perfüzyonları için 35 ml şırınganın içine Yük ~ 30-35 ml% 4 PFA. </li><li> Doku diseksiyon 10 ml PBS ile bir 10 cm&#39;lik bir doku kültürü plağı doldurun. </li><li> 16 mg / ml ketamin ve 3 mg / ml ksilazin içeren bir ketamin / ksilazin kokteyli hazırlanır. </li><li> Diseksiyon için% 70 etanol içinde bir çözelti hazırlayın. </li></ol> 3. Diseksiyon ve Doku Koleksiyonu <ol><li> Bir tane 1 ml&#39;lik şırınga kullanılarak, vücut ağırlığının her 25 gramı için, ketamin / ksilazin kokteyli 500 ul enjekte edilir ve 15 dakika ~ bekleyin. Alternatif olarak, ilgi biyolojik sistemine uygun olan başka bir kurumsal onaylı sedasyon yöntemi kullanın. </li><li> Sedasyon üzerine hafifçe dorsal tarafı ile strafor tepsi üzerinde tüm pençeleri pin, ağrı yanıtı eksikliği onaylamak için arka pençe tutamfare aşağı bakacak. </li><li> % 70 etanol ile karın Sprey ve kalp erişmek için göğüs kafesinin üst alt karın bir kesi yapmak. </li><li> Kalbin sağ atrium küçük bir kesi yapmak ve kalbin sol ventrikül içine% 30 sukroz çözeltisi içeren şırınga yerleştirin. </li><li> ~ 2-5 mi başına dakika bir hızda çözelti serpmek. Ne zaman boş şırınga kaldırmak ve% 4 PFA çözümü ile tekrarlayın. </li><li> Strafor tepsiden fare sabitlemesini ve beyin erişmek için başını kesmek. </li><li> Forseps ve makas kullanılarak hayvanın başının etrafında deri kaldırmak. Bir iğne ile kafatasının arka kısmında bir delik Poke ve dikkatli makas ve kesme forseps ile kafatası çıkarın. </li><li> Beyin açıkça erişilebilir bir kez, beyincik kaldırmak ve PBS içinde yerleştirmek için forseps kullanabilir. Bir neşter ile sajital düzlemde beyincik iki eşit parçaya böler ve 4 ° C&#39;de bir gece% 30 sukroz çözeltisi aktarın. Not: hazırlık içinparafin kesitler vardır öncesinde doku gömme ve kesit için% 4 PFA 4 ° C&#39;de gece boyunca beyincik sabitleyin. </li></ol> 4. Doku İşleme ve Kesit <ol><li> Kuru buz ve 2-metil bütan içeren bir bulamaç hazırlanır. Banyosunun sıcaklığı 5 dakika boyunca dengelenmeye bırakın. </li><li> OCT bileşiği ile cryomold doldurun ve kalıba iki eşit parçaya bölünmüş beyincik yarısı yerleştirin. </li><li> Bir diseksiyon mikroskobu ve forseps pozisyon bir çift (beyincik orta hat yakınında) iki eşit parçaya bölünmüş bir yüzey yukarı bakacak şekilde beyincik kullanma. </li><li> Ekim bileşiği, bir doku numunesinin yaklaşık beyaz bir katı matris oluşana kadar 5 dakika boyunca kuru buz bulamaca cryomold aktarın. Not: Gerekirse dondurulmuş numune hemen -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Etiket cere 15 mikron bölümleri toplamak amacıyla üreticinin talimatlarına göre, doku bölümleri toplamak için poli-lisin slaytlar tedavi edilen ön ve Kriyostat hazırlanmasıbellum. Bölümleri toplamak için dikkatle slayt poli-lizin kaplı tarafı Ekim bölümüne başvurun. Bölümünün yönünü korumak için, bu aşama esnasında slayt dönmez. </li><li> Boyama ve görüntüleme ile devam kadar -20 ° C&#39;de saklayın doku bölümleri. </li></ol> 5. Boyama ve Beyincik Bölümlerin Görüntüleme <ol><li> Doku boyamadan önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın: PBS ~ 50 mi ~ PBS içinde% 4 PFA 5-10 mi ~ PBS içinde% 0.5 Triton X-100,% 10 eşek serumu 10-20 mi </li><li> Çözülme serebellar kesitler. Önemli olarak, EGFP solmasının engellenmesi için, sürekli ve yoğun herhangi bir ışık kaynağı maruz kaldıkları en aza indirir. </li><li> Hidrofobik bir bariyer kalemini kullanarak, doku kesitlerinde etrafına bir dikdörtgen çizin. </li><li> 5 dakika boyunca% 4 PFA ile bölümleri Post-fix. Hidrofobik bariyer (genellikle ~ 500 ul) tarafından tarif tüm alanı kapsayacak şekilde yeterli sıvı kullanın. , Bir vakum ya da pipet yeniden kullanmasabitleştirici doku kesitlerinde rahatsız etmemek için özellikle dikkatli olmak taşıyın. </li><li> Bir pipet ile hafifçe doku bölümleri bozmadan slayt PBS uygulanır. 5 dakika sonra dikkatlice sıvıyı çıkarmak için vakum veya pipet kullanın. PBS üç kez toplam durulama tekrarlayın. </li><li> Bir pipet kullanarak dikkatli bir şekilde, PBS içinde% 0.5 Triton X-100,% 10 eşek serumu (çözeltisi 900 ul başına 3 ul kalbindin ve / veya Nesprin2 antikoru) uygun bir primer antikor seyreltme uygulanır. Karanlıkta, oda sıcaklığında bir saat süreyle inkübe edilir. Not: EGFP-KASH2 dondurulmuş kesitler üzerinde doğrudan floresan mikroskobu ile görünür olacaktır, ve bir anti-EGFP antikor kullanılması gerekli değildir. Parafin kesitleri hazırlanmış, ancak EGFP-KASH2 görüntüleme, bir anti-EGFP antikor ile immunodeteksiyon gerektirir. </li><li> Antikor çözüm çıkarın ve PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> 1 Hazırlama:% 0.5 Triton X-100 içinde Alexa Fluor sekonder antikor seyreltileri 1000,Karanlıkta% 10 eşek PBS serum ve mağaza. </li><li> Yavaşça Nihai PBS durulama çıkarın ve karanlıkta bir saat süreyle ikincil antikor seyreltme uygulanır. </li><li> Ikincil antikor çözüm çıkarın yıkayın ve bölüm üç kez yıkayın. Gerekirse, ilk PBS uygulama esnasında, örneğin DAPI (~ 300nM) olarak nükleer leke, uygulanır. </li><li> Tamamen doku ve doku bölümünde medya montaj yeri ~ 5-7 ul yerinden PBS çözüm kaldırmak. Doku bölümünün üstünde bir cam lamel yerleştirin ve karanlıkta, oda sıcaklığında ~ 15-30 dakika boyunca bekletin. </li><li> EGFP ve adımları 5,8 / 5,9 kullanılan ikincil antikorlar için uygun olan herhangi bir başka dalga boylarını görselleştirmek için uygun filtreler ile donatılmış bir fluoresans mikroskopu kullanın. Serebellar dilimleri, EGFP-KASH2 nükleer jantlar görüntülemek için bir 20X objektif kullanın. </li></ol>

<ol><li>Hutchison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins%3A+building+blocks+or+regulators+of+gene+expression%3F+Nature+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).</li>
<li>Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+lamins%3A+their+structure%2C+assembly%2C+and+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions.</a> Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).</li>
<li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm%3A+role+of+the+LINC+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).</li>
<li>Haque, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUN1+interacts+with+nuclear+lamin+A+and+cytoplasmic+nesprins+to+provide+a+physical+connection+between+the+nuclear+lamina+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton.</a> Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).</li>
<li>Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sun2+is+a+novel+mammalian+inner+nuclear+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein.</a> The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).</li>
<li>Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KASH+and+SUN+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">KASH and SUN proteins.</a> Current biology : CB. 21, R414-R415 (2011).</li>
<li>Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprins+LINC+the+nucleus+and+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton.</a> Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).</li>
<li>Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+and+dynein+at+the+nuclear+envelope+mediate+the+bidirectional+migrations+of+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei.</a> The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).</li>
<li>Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNC-83+is+a+nuclear-specific+cargo+adaptor+for+kinesin-1-mediated+nuclear+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration.</a> Development. 136, 2725-2733 (2009).</li>
<li>Padmakumar, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enaptin%2C+a+giant+actin-binding+protein%2C+is+an+element+of+the+nuclear+membrane+and+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton.</a> Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).</li>
<li>Roux, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin+4+is+an+outer+nuclear+membrane+protein+that+can+induce+kinesin-mediated+cell+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).</li>
<li>Wilhelmsen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+outer+nuclear+membrane+protein%2C+associates+with+the+cytoskeletal+linker+protein+plectin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin.</a> The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).</li>
<li>Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprins+anchor+kinesin-1+motors+to+the+nucleus+to+drive+nuclear+distribution+in+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells.</a> Development. 142, 218-228 (2015).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KASH+protein+Syne-2%2FNesprin-2+and+SUN+proteins+SUN1%2F2+mediate+nuclear+migration+during+mammalian+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development.</a> Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syne-1+and+Syne-2+play+crucial+roles+in+myonuclear+anchorage+and+motor+neuron+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation.</a> Development. 134, 901-908 (2007).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin+1+is+critical+for+nuclear+positioning+and+anchorage%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage.</a> Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).</li>
<li>Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+assembly+of+LINC+complexes+and+their+function+in+cellular+mechanical+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness.</a> Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUN1%2F2+and+Syne%2FNesprin-1%2F2+complexes+connect+centrosome+to+the+nucleus+during+neurogenesis+and+neuronal+migration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice.</a> Neuron. 64, 173-187 (2009).</li>
<li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+tissue-specific+disruption+of+LINC+complexes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo.</a> Genesis. 52, 359-365 (2014).</li>
<li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+Nesprin1+giant+devoid+of+KASH+domain+underlies+the+molecular+etiology+of+autosomal+recessive+cerebellar+ataxia+type+I%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I.</a> Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).</li>
<li>Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+mediate+the+positioning+of+cone+photoreceptor+nuclei+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina.</a> PloS one. 7, e47180(2012).</li>
<li>Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+linkers+of+the+nucleoskeleton+to+the+cytoskeleton+during+mouse+postnatal+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis.</a> Nucleus. 4, 399-409 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

En kritik aşama başarılı Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) modeli, uygun bir Cre fare hattı (ler) i belirlemek için kullanıldığı in vivo LINC komplekslerinin rolünü incelemek için. Cre içindeki yollar yer alan diğer hücre tiplerinde aktif Gerçekten de, eğer, bu sonuçların yorumunu komplike olabilir. Beyincik (Şekil 2B), moleküler ve granül hücre katmanlarında burada gösterildiği gibi Dolayısıyla, bu, at hücreleri incelemek için önemlidir. Aynı şekilde, herhangi bir fizyolojik ilgili fenotipleri maksim...

Nükleer zarf (NE) Sitoplazmadan nükleolazma ayırır. Nükleer gözeneklerin bağlamak bir iç ve bir dış çekirdek zarı (INM sırasıyla Onm,) oluşmaktadır. Her iki membranlarla tarif lümen perinükleer alanı (PNS) olarak adlandırılır. Onm granüllü endoplazmik retikulum (ER) bir uzantısı olan ve INM nükleer lamina yapışır, A ve B tipi ile temsil edilen çekirdek tip V ara ipliklerin bir ağ örgüsü 1,2 lamins. Nucleoskeleton ve hücre iskeleti (LINC) komplekslerinin bağlayıcılar fiziksel iskelet ipliklerin ve moleküler motorlar (Şekil 1A) çekirdeğin iç bağlamak için bütün çekirdek zarfı kapsayan makromoleküler monte edilmiş halleridir. Güneş (Sad1 / Unc84) proteinler ve Nesprins (Nükleer Zarf SPectRINS): Bunlar KD ayrılmaz transmembran proteinlerinin iki aileyi karakterize evrimsel korunmuş motiflerinin arasındaki etkileşimleri oluşur. Memelilerde, Sun1 ve Sun2 arN-terminal bölgesi nucleoplasmic A ve B tipi lamins 3-5 ile doğrudan etkileşip etkileşmediği INM e transmembran proteinleridir. PNS içinde INM diğer tarafında, Sun proteinler 150 C-terminal amino asitler, SUN alanı adı verilen ~ evrimsel korunmamış streç barındırır. SUN etki evrimsel korunmuş Kash ile doğrudan etkileşim (Klarsicht / Anc-1, Syne Homology) etki, Nesprins moleküler imza. Kash etki, bir zar geçiş alanı 6 ve ardından PNS içine çıkıntı ~ 30 C-terminal amino asidi bir streç oluşur. En az dört farklı Nesprin genler (Nesprin1-4) NE 7 lokalize proteinler Kash içeren kodlar. Şaşırtıcı bir 1000 kDa (Nesprin1 dev) için boyutları değişir ~ 50kDa (Nesprin4) den Nesprins, sitoplazmik bölgeleri, çoklu spektrin gibi aktin, plectin ve moleküler motorlar 8- olarak iskelet bileşenleri ile etkileşimi sağlayarak tekrar yanı sıra özel motifler içeriyor 13. &lt;omurgalı ve omurgasız p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Araştırmalar Lamin / Güneş / Nesprin / moleküler motorlar bir evrimsel olarak korunmuş &quot;eksen&quot; nükleer göç ve ankraj kontrol teşkil ettiğini göstermiştir. Linc karmaşık bileşenlerin çeşitli knock-out (KO) fare modelleri tanımlanmış ve memeli gelişim 9,14,15 sırasında KD Sun ve Nesprin proteinlerinin rollerini anlamak için bir çerçeve sağlayan aracı vardı oylandı. Ancak, bu modeller en önemlisi mevcut birçok önemli sakıncaları: of fenotipik katkılarını ayırt olmayan özerk etkileri, 2) zorluk hücre nedeniyle fenotipleri yorumlarken 1) zorluk Kash-az Nesprin vs Kash içeren, 3) 16 izoformları Çok sayıda hücre tiplerinde NE Sun ve Nesprin proteinlerin işlevsel fazlalık hem Kash-etki alanı için eksik farelerde 17 tüm SUN-Kash etkileşimleri ve farelerin 4) perinatal öldürücülüğü inaktive karmaşık ıslah planları gerektirirNesprins1 ve 2 yetişkin analizi 18 fenotip engellemektedir. Bu protokol, böylece yukarıda özetlenen sakıncaları birçok atlayarak bir hücre özerk ve gelişimsel olarak düzenlenen bir şekilde in vivo tüm SUN-Kash etkileşimleri bozmak için tasarlanmış yeni bir fare modeli açıklanmaktadır. Bu Cre / lox tabanlı fare modeli, iki önemli kavramları dayanır: 1) bilinen herhangi bir Nesprin proteininin Kash alanı hücre kültür sistemlerinde KD EGFP hedef ve 2) SUN etki fazla sentezlenmesi, böylece, Kash etki alanları ile etkileşime promiscuously için yeterlidir Herhangi Kash etki tüm endojen Paz etki doyurmak ve dominant-negatif bir şekilde 17 (Şekil 1B) Linc kompleksleri inaktive edecek. Bu protokol, doku hasat ve serebellar Purkinje hücrelerinde tüm SUN-Kash etkileşimlerinin bozulması doğrulamak için kullanılan işlem adımları açıklar.

<table><tbody><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>%16 Paraformaldehit Çözeltisi</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>OCT Bileşik</td><td>Doku-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Yapışma Slaytları</td><td>StatLab</td><td>M1000W</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Serumu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>ImmuEdge Kalem</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Calbindin Antikoru</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9848</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EGFP Antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nesprin2 Antikoru</td><td></td><td></td><td>Daha önce Ref. 21'de açıklanmıştır</td></tr><tr><td>Floresan Montajı Medya</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>2-metil bütan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3551</td><td></td></tr></tbody></table>

fare modeli doğrulanması hücre-spesifik şekilde linc kompleksler bozacak

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Gelişmekte olan ve yetişkin dokulardaki nükleer göç ve ankraj, büyük ölçüde Nükleoskeleton ve Hücre İskeletinin LInker'leri (LINC kompleksleri) adı verilen büyük makromoleküler protein düzeneklerine dayanır. Bu protein iskeleleri nükleer zarfı kaplar ve çekirdeğin içini çevredeki sitoplazmik hücre iskeletinin bileşenlerine bağlar. LINC kompleksleri, evrimsel olarak korunmuş iki protein ailesinden oluşur, Sun proteinleri ve sırasıyla SUN ve KASH alanları olarak adlandırılan C-terminal moleküler imza motiflerini barındıran Nesprins. Güneş proteinleri, N-terminal nükleoplazmik alanı nükleer lamina ile etkileşime girerken, C-terminal SUN alanları perinükleer boşluğa çıkıntı yapan ve Nesprins'in KASH alanı ile etkileşime giren iç nükleer zarın transmembran proteinleridir. Kanonik Nesprin izoformları, sitoplazmaya çıkıntı yapan ve hücre iskeletinin bileşenleriyle etkileşime giren değişken boyutlu bir N-terminaline sahiptir. Bu protokol, endojen SUN/KASH etkileşimlerini hücre tipine özgü bir şekilde bozan baskın-negatif bir transgenik fare stratejisinin doğrulanmasını açıklar. Yaklaşımımız, LINC kompleksi inaktivasyonunun germ hattı modelleriyle ilişkili perinatal ölümcüllük ve hücre otonom olmayan fenotipleri gibi birçok dezavantajı atlayan Cre / Lox sistemine dayanmaktadır. Bu nedenle, bu model, çok çeşitli dokularda gelişim ve homeostaz sırasında LINC komplekslerinin rolünü anlamak için yararlı bir araç sağlar.

Bu protokol, Tg (PCP2-Cre) fareler kullanılarak beyincik Purkinje hücreleri için EGFP ekspresyonu KASH2 kısıtlamak için Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) fare modelinde yararını göstermektedir. Tg olarak (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) yavruları, LacZ / V5 açık okuma çerçevesi bu şekilde özellikle Purkinje hücreleri (Şekil 2A) için hedeflenen EGFP-KASH2 ekspresyonuna yol açan Cre rekombinaz tarafından P6 eksize edilir. Beklendiği gibi çekirdeğe (Şekil 2B) çevresinde gözlenmiştir EGFP-poz...

Nükleer zarf proteinleri birçok temel biyolojik süreçte merkezi bir rol oynar ve çeşitli insan hastalıklarında rol oynamıştır. Bu protokol, LINC komplekslerinin bozulmasının uzay-zamansal kontrolüne izin veren yeni bir Cre/Lox tabanlı fare modelini açıklar.

Fare Modeli Doğrulanması Hücre-spesifik şekilde LINC kompleksler bozacak

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Bu deneyin genel amacı, floresan işaretli EGFP cache, two peptidinin in vivo olarak indüklenebilir ve hedeflenmiş ekspresyonuna olanak tanıyan ve bunun sonucunda endojen link komplekslerinin bozulmasını sağlayan transgenik bir fare modelinin kullanışlılığını göstermektir. Bu deneyde, floresan işaretli cache two ekspresyonu serebellar Purkinje hücrelerini hedefleyecektir. Bu genetik yaklaşım, farklı fare dokularında nükleer konumlandırmada link komplekslerinin rolü hakkındaki temel soruları yanıtlayabilir.E-G-F-P-K ikisinin indüklenebilir ve hedeflenmiş ekspresyonunun birkaç avantajı vardır. Birincisi, herhangi bir mevcut cruise suşu ile cay farelerin tek bir yetiştirme şeması gerektirir. İkincisi, bu yaklaşım, link kompleks bileşenlerinin germ hattı mutasyonlarına sahip fare modellerinde gözlemlenen perinatal mortaliteyi aşmayı sağlar.Son olarak, bu yöntem belirli hücreler veya dokular içindeki bağlantı komplekslerinin fizyolojisinin in vivo olarak incelenmesine olanak tanır. Laboratuvar üyelerinden Chloe Potter, serebellar Purkinje hücrelerinde E-G-F-P-K2'yi görüntülemek için gereken farklı adımları size gösterecektir.Önceki yayınlarda açıklandığı şekilde, PCP two CAG C two fareleri üretmek için clac Z farelerini PCP two CRE fareleri ile çiftleştirin. Ortaya çıkan yavrular doğduğunda genotipleme yapın. Daha önce açıklandığı gibi hem EGFP hem de Cree transgenlerini taşıyanları belirlemek için, PBS içinde 50 mL %30'luk sükroz çözeltisi hazırlayın ve uygun yaştaki doku toplama gününe kadar -20 °C'de saklayın; beyin dokusunu diseksiyon için hazırlamak amacıyla, yazılı protokolde açıklandığı şekilde anestezi altındaki farelere transkardiyak perfüzyon uygulayın, diseke edilen beyni 10 mL PBS içeren 10 cm'lik bir doku kültürü plağına yerleştirin ve serebellumu serebrumdan ayırın.Ardından, bir bistüri kullanarak serebellumu sagital düzlemde diseke edin, kesitleri %30'luk sükroz çözeltisine aktarın ve dört derece Celsius'ta gece boyunca saklayın. Kuru buz ve iki metil bütan içeren bir bulamaç hazırlayın. Banyonun sıcaklığının dengelenmesi için beş dakika bekleyin.Ardından, bir kriyokalıbı OCT bileşiği ile doldurun ve diseke edilmiş serebellumun bir yarısını, bir diseksiyon mikroskobu ve bir pens yardımıyla kalıba yerleştirin. Serebellumu, serebellumun orta hattına yakın olan diseke yüzey kalıpta yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Daha sonra, OCT bileşiği doku örneği etrafında katı beyaz bir matriks oluşturana kadar kriyokalıbı beş dakika boyunca kuru göz buzlu karışımına yerleştirin.Gömülü örneği ihtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklayın. Doku kesitlerini toplamak için ön işlemli polilizin lamları etiketleyin ve serebellar doku bloğunu taze OCT ile doku tutucuya monte edin. Blok sıkıca yapıştıktan sonra doku tutucuyu yerleştirin ve dokuya ulaşana kadar fazla OCT'yi temizlemek için 40 µm kalınlığında dilimler kesin.Kalınlığı 15 micrometers olarak ayarlayın ve OCT kesitini lamın polilizin kaplı tarafıyla dikkatlice temas ettirerek kesitleri toplayın. Boyama ve görüntüleme işlemlerine geçene kadar doku kesitlerini -20 °C'de saklayın. Devam etmeye hazır olduğunuzda, floresan proteinlerin solmasını önlemek için serebellar kesitleri karanlıkta çözdürün.Hidrofobik bir bariyer kalemi kullanarak, doku kesitlerinin çevresine bir dikdörtgen çizin. Dokuyu yeniden sabitlemek için kesitlere yaklaşık 500 µL %4 paraformaldehit ekleyip beş dakika bekletin. Ardından, bir pipetle doku kesitlerini yerinden oynatmamaya özellikle dikkat ederek, fiksatif maddeyi vakumla aspire edin.Doku kesitlerini bozmadan slayt üzerine nazikçe PBS uygulayın. Beş dakika sonra, sıvıyı dikkatlice uzaklaştırmak için vakumlu mikro pipet kullanın ve PBS ile durulama işlemini toplam üç kez tekrarlayın. Ardından, slaytlara yaklaşık 500 µL bloklama solüsyonu ekleyin ve 10 dakika boyunca inkübe edin.Bloke edici çözeltiyi uzaklaştırın ve ardından yerine, cal bağlayıcı veya nesin iki antikorlarının 1:300 oranında seyreltildiği aynı çözeltiyi ekleyin. Sonrasında antikor çözeltisini uzaklaştırın ve lamları 3 kez PBS ile yıkayın. Lamları oda sıcaklığında, karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin.Ardından, bloklama çözeltisi içerisinde, cow binding işaretli lamlar için anti-US Alexa floor 5 94 ve Nesprin two işaretli lamlar için anti Alexa Fluor 5 94'ün 1:1000 oranındaki dilüsyonlarını hazırlayın ve çözeltileri ihtiyaç duyulana kadar karanlıkta saklayın. Son PBS durulamasını nazikçe uzaklaştırın ve kesitleri, dilüe edilmiş sekonder antikorlarla bir saat boyunca karanlıkta kapatın. İnkübasyonun ardından, sekonder antikor çözeltisini uzaklaştırın.Ardından, PBS içinde 300 nanomolar DPI gibi bir nükleer boyayı beş dakika boyunca uygulayın. Sonrasında, kesitleri PBS ile iki kez daha durulayın. PBS çözeltisini mümkün olduğunca uzaklaştırın ve doku kesitini bir damla montaj ortamı ile kapatın.Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek doku kesitinin üzerine bir lamella yerleştirin ve oda sıcaklığında, karanlıkta 15 ila 30 dakika bekletin. Ardından, antikor boyamasını ve floresan proteinleri görüntülemek için floresan mikroskobu kullanın. Serebellar kesitler için 20 x veya 40 x objektif kullanın.Burada gösterildiği gibi E-G-F-P-C iki nükleer halkalarını görüntülemek için, E-G-F-P-C iki, serebellar kesitlerde Fitzy kanalında doğrudan görselleştirilebilir. Ayrıca, özellikle Purkinje hücrelerini etiketleyen cow bağlanması ile EGFP'nin kolokalizasyonu, E-G-F-P-C iki ekspresyonunun Purkinje hücreleri içindeki Purkinje hücreleri ile sınırlı olduğunu doğrulamaktadır. EGFP cache iki, çekirdek çevresinde gözlemlenen EGFP pozitif RIM benzeri paternlerin gösterdiği üzere nükleer zarf hedeflemiştir.Bu örnekte, EGFP cache two ekspresyonu, cow bağlanma pozitif Perkin hücrelerinin %70'inden fazlasında tespit edilmiştir. EGFP cache two, mevcut sun domenlerinin doyurulması yoluyla endojen nesprini nükleer zarf üzerinden yerinden eder. Buna bağlı olarak, EGFP cache two eksprese eden Perkin hücrelerinin nükleer zarfından endojen NESIN two yerinden edilir.E-G-F-P-C two eksprese etmeyen Perkin hücreleri, beklendiği üzere endojen nesin two'yu nükleer zar üzerinde tutarken, CRE rekombinaz eksprese etmeyen kontrol hücreleri tüm hücre popülasyonunun nükleer zarında NESIN two sergilemektedir. Böylece dokuların CT blokları elde edilebilir. E-G-F-P-K two yaklaşık dört saat içinde görselleştirilebilir.Bu prosedürü uygularken, PFF fiksasyonunun derecesinin ve/veya gömme koşullarının, epitopunuzun antijenisitesini ciddi şekilde etkileyebileceğini unutmamak önemlidir. Bu nedenle, spesifik epitopunuzu koruyan optimal fiksasyon koşullarını belirlemek oldukça önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, VGFP cashew ekspresyonunu spesifik dokuları hedeflemek için CK iki transgenik fare modelinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

validation-mouse-model-to-disrupt-linc-complexes-cell-specific

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, bir fare modelinde intraperitoneal tamoksifen enjeksiyonunu takiben tamoksifen ile indüklenebilen bir Cre-rekombinaz sistemi kullanılarak hedef gen nakavt prosedürü açıklanmaktadır.

CreER-LoxP Sistem Tabanlı Hedef Gen İnaktivasyonu: Bir Fare Modelinde Hedef Gen Nakavt için Tamoksifen ile İndüklenebilir Cre Rekombinaz Sistemi

Bu video, iki noktalı Lizofosfatidilkolin (LPC) enjeksiyonu kullanılarak bir fokal demiyelinizasyon fare modelinin oluşturulmasını göstermektedir. Anestezi uygulanmış bir farenin kafatası açığa çıkar. Enjeksiyon koordinatları belirlenir ve hedeflenen bölgelerde LPC enjeksiyonlarını mümkün kılmak için bir delik açılır. LPC, inflamasyon yoluyla nöronların fokal demiyelinizasyonunu indüklerken, iki noktalı bir enjeksiyon sürdürülebilirliğini sağlar.

İki noktalı lizofosfatidilkolin enjeksiyonu yoluyla fokal demiyelinizasyon fare modelinin oluşturulması

MicroRNA beyin yapısı ve fonksiyonu önemli rolleri vardır. Burada aşırı ifadesi bir mühendislik miRNA-ifade lentivirüs stereotaktik enjeksiyonu kullanılarak hipokampal miRNA uygulamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, değerlendirmek için nispeten hızlı bir yöntem olarak hizmet...

Bir Stereotaktik Enjeksiyon MicroRNA-ifade Fare Hippocampus CA1 Bölgesi Lentiviruses ve Davranış Sonuç Değerlendirilmesi

Viral vektörler hedefli gen manipülasyonu için izin verir. Bu arka boynuzu içine, bir viral vektör stereotaksik enjeksiyon, birincil somatosensoriyel afferentleri ve merkezi sinir sistemi nöronları arasındaki sinaptik bir temas önemli yer kullanılarak, koşullu gen ekspresyonu ya da fare omurilik ablasyonu için bir yöntem göstermektedir.

Fare Omurilik Koşullu Gen Manipülasyon için bir Viral Vector Stereotaksik Enjeksiyon

Burada LacI transgenik fare modeli kullanılarak arıtılmış, hematopoietik hücrelerin az sayıda için bir in vivo deneyini tarif mutagenez. LacI gen DNA mutantlarının sıklığı, yer ve tip kendiliğinden ortaya çıkan veya Genotoksinlerin maruz kaldıktan sonra belirlemek için izole edilebilir.

Saf Hematopoetik kök / progenitör hücrelerin DNA mutasyonları belirlenmesi

Örneğin çinko parmak nükleazlara (ZFNs) ve transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlara (TALENS) olarak tasarımcı nükleazlar homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ile homolog yeniden birleştirmeye (HR) yolaklar tetikleyerek fare preimplantasyon embriyoların genomunu değiştirmek için kullanılabilir. Bu gelişmeler kesin genetik değişiklikler farelerde hızlı üretimini sağlar.

Tasarımcı nükleazlar kullanılması Fare Genom Mühendisliği

Burada, erişkin ventriküler-subventriküler nörojenik nişteki nöral kök hücrelerin ve/veya bunların bitişik ependimal hücrelerinin uzun vadeli genetik modifikasyonu için lentiviral partiküllerin kullanımına dayanan ve nöral kök hücreler üzerindeki hücre otonom ve otonom olmayan, nişe bağlı etkilerin ayrı ayrı analizine izin veren bir prosedürü açıklıyoruz.

Nöral Analizi Yetişkin Fare V-SVZ&#39;una Hücre istikrarlı ve verimli Genetik Modifikasyon Kök Hücre Özerk ve Non-özerk Etkileri

Gen beyinde hücre-otonom fonksiyonları kaybı inducing tarafından okudu ya da seyrek nüfus hücre işlevinin kazanmak. Burada, rahim içinde elektroporasyon Cre recombinase işlev içinde vivokaybına neden için floxed genler ile kortikal nöronlar geliştirme seyrek nüfus sunmak için açıklamak.

CRE-lox rekombinasyon fare serebral korteks rahim içinde elektroporasyon ile inducing

İnsan hastalığı ile ilişkili genetik varyantların ele haline başladığınızda, sistemler ile tanımlanan bu değişik biyolojik önemi hızla değerlendirileceği geliştirmeye giderek önem kazanmaktadır. Bu iletişim kuralı insan gen işlevi kadın mayoz sırasında ben fare yumurta kullanarak değerlendirilmesi yöntemlerini açıklar.

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Burada, rastgele olmayan X kromozom inactivation ile uygulanabilir bir kadın duvar modeli oluşturmak için bir protokol tarif, yani, maternally miras X kromozom hücrelerde% 100 ' de aktif değildir. Ayrıca, pasif X kromozom in vivo farmakolojik reaktivasyonunun fizibilite, tolerabilite ve güvenliğini test etmek için bir protokol açıklanmaktadır.

Pasif X kromozom üzerinde Mecp2 farmakolojik yeniden aktivasyonu için rasgele olmayan bir fare modeli

Bu protokol, fare yumurtalık kanalında bölgesel olarak kısıtlanmış CRISPR aracılı genom düzenlemesi için mikroenjeksiyon ve in vivo elektroporasyonu tanımlar.

In Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon Kullanan Somatik Genom Mühendisliği Fare Modelleri

Öğrenin, Cre/Lox sistemiyle transgenik fare modelinde hücre-spesifik LINC kompleks bozulmasını inceleyin. Bu yöntem, nükleer pozisyonlama ve hücre biyolojisi araştırmalarında değerli bilgiler sunar.

Fare Modeli Doğrulanması Hücre-spesifik şekilde LINC kompleksler bozacak

Daha fazla video keşfet