Embriyonik Kök Hücre Kültürü ve Farklılaşması
Embriyonik kök hücreler veya ES hücreleri, onları normal yetişkin hücrelerden ayıran bir dizi benzersiz özelliğe sahiptir. Bu nedenle, bilim adamları bu özellikleri korumak veya bunlardan yararlanmak için özel kültür teknikleri geliştirdiler. Düzgün bir şekilde kültürlendiğinde, ES hücreleri kendilerinden daha fazlasını yapmak için süresiz olarak bölünebilir. Aynı zamanda, kültür koşullarını değiştirerek, ES hücreleri vücudumuzda bulunan hemen hemen her hücre tipine farklılaşacak şekilde yönlendirilebilir; ES hücrelerinin bu yeteneğine "pluripotentlik" denir.
Bu videoda, ES hücrelerinin benzersiz özelliklerini koruyacak şekilde nasıl kültürleneceğini ve geçirileceğini, belirli hücre tipleri oluşturmak için ES hücrelerinde farklılaşmanın nasıl indükleneceğini ve ES hücre kültürü ve farklılaşma tekniklerinin günümüzde araştırmacılar tarafından nasıl kullanıldığını ve rafine edildiğini öğreneceksiniz.
ES hücre bakımı prosedürlerinin ayrıntılarına girmeden önce, ES hücre farklılaşmasını neyin önlediğini veya yönlendirdiğini anlamak önemlidir. ES hücrelerinin benzersiz pluripotentlik ve kendini yenileme özelliklerini koruyabilmeleri için, büyüme ortamlarında spontan farklılaşmayı baskılayan spesifik faktörlerle kültürlenmeleri gerekir.
Bu en yaygın olarak, ES hücrelerinin bir "besleyiciler" tabakası, genellikle fare embriyonik fibroblastları veya MEF'ler üzerinde kültürlenmesiyle yapılır. Besleyici hücreler, ES hücrelerini, ES hücrelerinin farklılaşmamış durumlarında kalmasına yardımcı olan aktivin A gibi belirli faktörleri "besler".
Son zamanlarda, bilim adamları, ES hücrelerinin tanımlanmış bir tarifte gerekli faktörlerin eklendiği ortamda büyütüldüğü besleyici içermeyen kültür yöntemleri de geliştirdiler. Bu yaklaşım, değişkenliği azaltır ve klinik uygulamalar için bir ön koşul olan ES hücre kültürlerinden insan olmayan bileşeni çıkarır.
ES hücrelerinin bir başka özelliği de, doğal olarak kümeler veya koloniler halinde büyümeleri ve tek hücrelere, özellikle de insan ES hücrelerine ayrıştıklarında düşük hayatta kalma oranına sahip olma eğiliminde olmalarıdır. Sonuç olarak, insan ES hücrelerinin geçmesi, genellikle onları mekanik "toplama" yoluyla sağlam kümeler halinde tutmayı gerektirir.
ES hücreleri yapışık olmayan koşullarda büyütüldüğünde, ES hücrelerinin tüm farklı hücre tiplerine farklılaşacağı embriyoid cisimleri veya EB'ler olarak bilinen 3D agregalar oluştururlar. Bilim adamları, ortama spesifik büyüme faktörlerinin eklenmesi gibi farklılaşma koşullarını değiştirerek, ES hücre farklılaşmasını belirli hücre tiplerine yönlendirmek için yöntemler geliştiriyorlar.
Artık ES hücre bakımı ve farklılaşmasının arkasındaki ilkeleri anladığınıza göre, ES hücrelerinin MEF besleyicilerde nasıl kültürleneceğine ve geçirileceğine bakalım.
MEF'ler erken evre fare embriyolarından elde edilir ve daha sonra daha fazla bölünmelerini önlemek için kimyasallar veya radyasyon ile etkisiz hale getirilir. İnaktive edilmiş MEF'ler, ES hücrelerini kültürlemeye başlamadan en az bir gün önce jelatinleştirilmiş doku kültürü kapları üzerine kaplanmalıdır. Besleyiciler tamamen yerleştiğinde, ES hücreleri çözülür ve plakalara tohumlanır.
Önümüzdeki birkaç gün içinde, ES hücreleri büyük koloniler halinde büyüyecek. Koloniler dokunmaya ve kaynaşmaya başlamadan önce, ES kültürüne geçilmelidir. Farklılaşma belirtileri gösterip göstermediklerini görmek için ES hücrelerinin morfolojisi gözlemlenmelidir. Farklılaşmamış ES kolonileri genellikle iyi tanımlanmış ve homojen görünürken, farklılaşmış hücreler donuk, düzensiz şekilli "parke taşları" gibi görünür.
Koloniler %70 veya daha fazla farklılaşma gösteriyorsa veya seyrekse, farklılaşmamış kolonileri mekanik olarak kesin ve yeni bir besleme plakasına aktarın. Aksi takdirde, farklılaşmış alanları veya kolonileri çıkarın ve geçişe devam edin.
Farklılaşmış koloniler temizlendikten sonra, hücreleri uygun süre boyunca 37 ° C'de inkübasyon ile plakadan kaldırmak için kollajenaz gibi proteolitik enzimler eklenir. Daha sonra enzimatik reaksiyonları durdurmak için taze ES ortamı eklenir. Koloniler mekanik olarak plakadan çıkarılır ve bir santrifüj tüpüne aktarılır, burada nazik pipetleme ile istenen boyutlara ayrılırlar. ES hücreleri santrifüjleme ile toplanır, ES ortamında yeniden süspanse edilir ve hazırlanan besleyici plakalara kaplanır.
ES hücrelerinin nasıl geçirileceğini öğrendikten sonra, ES hücrelerini embriyoid cisimlere ayırmak için kullanılan en yaygın tekniklerden biri olan asılı damla yöntemine bakalım.
Başlangıç olarak, ES hücreleri kollajenaz gibi proteolitik enzimlerin yardımıyla ayrılır ve soya özgü farklılaşma faktörleri içeren ortamlarda istenen konsantrasyona seyreltilir. ES hücre süspansiyonu daha sonra bir bakteri petri kabının kapağına damlalar halinde bırakılır. Kapak hızlı bir şekilde ters çevrilir ve tabağın üzerine yerleştirilir, böylece ortam damlaları baş aşağı asılır ve embriyoid cisimlerin gelişmesine izin verir.
Yaklaşık iki gün sonra, EB'li damlalar toplanabilir ve daha fazla kültür için yapışmayan plakalara kaplanabilir. İstenen hücre soyu için uygun zaman noktasında, embriyoid cisimleri, daha fazla farklılaşma için jelatinleştirilmiş yapışkan doku kültürü kaplarına geri kaplanır.
Artık ES hücrelerini kültürlemenin ve ayırt etmenin temel tekniklerini ele aldığımıza göre, bunların belirli deneysel ihtiyaçlar için nasıl uyarlandığına bakalım.
Daha önce de belirtildiği gibi, ES hücreleri, farklı kültür koşulları altında belirli hücre tiplerine farklılaşmaya yönlendirilebilir. Bu deneyde, bilim adamları insan ES hücrelerinden motor nöronlar üretti. Bu, önce onları nöral soylarına yönlendiren farklılaşan embriyoid cisimlere faktörler eklenerek, ardından bu hücreleri özellikle motor nöronlara dönüştüren kimyasallar ve kaplama koşulları eklenerek yapıldı. Benzer yaklaşımları kullanarak, araştırmacılar ES hücrelerini ritmik olarak atan kalp kası hücrelerine ayırmada başarılı oldular.
Farklılaşan ES hücreleri, embriyolar doğal olarak gelişirken meydana gelen olayları taklit ettiğinden, bunları erken embriyonik gelişimin biyolojisini araştırmak için de kullanabiliriz. İncelenen fenomenlerden biri, bir dişi memelinin her hücresinde iki X kromozomundan birinin susturulduğu çok önemli bir süreç olan X kromozomu inaktivasyonu veya XCI'dir. Bilim adamları, gelişmekte olan EB'lerde spesifik RNA'ların ve proteinlerin dağılımını görselleştirerek, XCI'nin biyolojisi hakkında değerli bilgiler edindiler.
Son olarak, ES hücre deneyinin tutarlılığını ve verimliliğini artırmak için, bilim adamları sürekli olarak ES hücrelerini kültürlemek için daha iyi teknikler geliştirmeye çalışıyorlar. Bir yaklaşım, ES hücrelerini koloni dışı tip tek katmanlı kültürleme veya NCM adı verilen tek bir katmanda büyütmektir.
İnsan ES hücrelerinin, 3D agregalar olarak büyümediklerinde mutsuz olma eğiliminde olduklarını hatırlıyor musunuz? Bilim adamları, ROCK inhibitörleri olarak bilinen kimyasalların, ayrışmış ES hücrelerinin hayatta kalmasını artırdığını, bu da onların tek hücreli süspansiyonlar olarak geçmelerine ve yüksek yoğunlukta kaplanmalarına izin verdiğini göstermiştir. NCM tekniğinin avantajı, her hücrenin ortamdaki büyüme faktörlerine ve besin maddelerine daha eşit şekilde maruz kalması, kültür içindeki heterojenliği azaltırken ES hücrelerinin çok sayıda büyümesini kolaylaştırmasıdır.
JoVE'nin embriyonik kök hücrelerin nasıl kültürleneceği ve ayırt edileceği hakkındaki videosunu izlediniz. Artık ES hücrelerini farklılaşmamış durumda tutmak için hangi faktörlerin önemli olduğunu ve bir tabakta belirli hücre tipleri oluşturmak için ES hücre pluripotensinden nasıl yararlanabileceğimizi bilmelisiniz. İleriye dönük olarak, bilim adamları, rejeneratif tıp uygulamalarında kullanılabilecek özel hücre türleri üretmek için daha verimli ve iyi tanımlanmış kültürleme ve farklılaşma koşulları geliştirmek için çalışacaklar. İzlediğiniz için teşekkürler!
Embriyonik kök (ES) hücrelerin kültürlenmesi, kendini yenileme ve pluripotentlik kapasitelerini korumak için bu hücreleri farklılaşmamış bir durumda t…
Embriyonik kök hücreler veya ES hücreleri, onları normal yetişkin hücrelerden ayıran bir dizi benzersiz özelliğe sahiptir. Bu nedenle, bilim adamları bu özellikleri korumak veya bunlardan yararlanmak için özel kültür teknikleri geliştirdiler. Düzgün bir şekilde kültürlendiğinde, ES hücreleri kendilerinden daha fazlasını yapmak için süresiz olarak bölünebilir. Aynı zamanda, kültür koşullarını değiştirerek, ES hücreleri vücudumuzda bulunan hemen hemen her hücre tipine farklılaşacak şekilde yönlendirilebilir; ES hücrelerinin bu yeteneğine "pluripotentlik" denir.
Bu videoda, ES hücrelerinin benzersiz özelliklerini koruyacak şekilde nasıl kültürleneceğini ve geçirileceğini, belirli hücre tipleri oluşturmak için ES hücrelerinde farklılaşmanın nasıl indükleneceğini ve ES hücre kültürü ve farklılaşma tekniklerinin günümüzde araştırmacılar tarafından nasıl kullanıldığını ve rafine edildiğini öğreneceksiniz.
ES hücre bakımı prosedürlerinin ayrıntılarına girmeden önce, ES hücre farklılaşmasını neyin önlediğini veya yönlendirdiğini anlamak önemlidir. ES hücrelerinin benzersiz pluripotentlik ve kendini yenileme özelliklerini koruyabilmeleri için, büyüme ortamlarında spontan farklılaşmayı baskılayan spesifik faktörlerle kültürlenmeleri gerekir.
Bu en yaygın olarak, ES hücrelerinin bir "besleyiciler" tabakası, genellikle fare embriyonik fibroblastları veya MEF'ler üzerinde kültürlenmesiyle yapılır. Besleyici hücreler, ES hücrelerini, ES hücrelerinin farklılaşmamış durumlarında kalmasına yardımcı olan aktivin A gibi belirli faktörleri "besler".
Son zamanlarda, bilim adamları, ES hücrelerinin tanımlanmış bir tarifte gerekli faktörlerin eklendiği ortamda büyütüldüğü besleyici içermeyen kültür yöntemleri de geliştirdiler. Bu yaklaşım, değişkenliği azaltır ve klinik uygulamalar için bir ön koşul olan ES hücre kültürlerinden insan olmayan bileşeni çıkarır.
ES hücrelerinin bir başka özelliği de, doğal olarak kümeler veya koloniler halinde büyümeleri ve tek hücrelere, özellikle de insan ES hücrelerine ayrıştıklarında düşük hayatta kalma oranına sahip olma eğiliminde olmalarıdır. Sonuç olarak, insan ES hücrelerinin geçmesi, genellikle onları mekanik "toplama" yoluyla sağlam kümeler halinde tutmayı gerektirir.
ES hücreleri yapışık olmayan koşullarda büyütüldüğünde, ES hücrelerinin tüm farklı hücre tiplerine farklılaşacağı embriyoid cisimleri veya EB'ler olarak bilinen 3D agregalar oluştururlar. Bilim adamları, ortama spesifik büyüme faktörlerinin eklenmesi gibi farklılaşma koşullarını değiştirerek, ES hücre farklılaşmasını belirli hücre tiplerine yönlendirmek için yöntemler geliştiriyorlar.
Artık ES hücre bakımı ve farklılaşmasının arkasındaki ilkeleri anladığınıza göre, ES hücrelerinin MEF besleyicilerde nasıl kültürleneceğine ve geçirileceğine bakalım.
MEF'ler erken evre fare embriyolarından elde edilir ve daha sonra daha fazla bölünmelerini önlemek için kimyasallar veya radyasyon ile etkisiz hale getirilir. İnaktive edilmiş MEF'ler, ES hücrelerini kültürlemeye başlamadan en az bir gün önce jelatinleştirilmiş doku kültürü kapları üzerine kaplanmalıdır. Besleyiciler tamamen yerleştiğinde, ES hücreleri çözülür ve plakalara tohumlanır.
Önümüzdeki birkaç gün içinde, ES hücreleri büyük koloniler halinde büyüyecek. Koloniler dokunmaya ve kaynaşmaya başlamadan önce, ES kültürüne geçilmelidir. Farklılaşma belirtileri gösterip göstermediklerini görmek için ES hücrelerinin morfolojisi gözlemlenmelidir. Farklılaşmamış ES kolonileri genellikle iyi tanımlanmış ve homojen görünürken, farklılaşmış hücreler donuk, düzensiz şekilli "parke taşları" gibi görünür.
Koloniler %70 veya daha fazla farklılaşma gösteriyorsa veya seyrekse, farklılaşmamış kolonileri mekanik olarak kesin ve yeni bir besleme plakasına aktarın. Aksi takdirde, farklılaşmış alanları veya kolonileri çıkarın ve geçişe devam edin.
Farklılaşmış koloniler temizlendikten sonra, hücreleri uygun süre boyunca 37 ° C'de inkübasyon ile plakadan kaldırmak için kollajenaz gibi proteolitik enzimler eklenir. Daha sonra enzimatik reaksiyonları durdurmak için taze ES ortamı eklenir. Koloniler mekanik olarak plakadan çıkarılır ve bir santrifüj tüpüne aktarılır, burada nazik pipetleme ile istenen boyutlara ayrılırlar. ES hücreleri santrifüjleme ile toplanır, ES ortamında yeniden süspanse edilir ve hazırlanan besleyici plakalara kaplanır.
ES hücrelerinin nasıl geçirileceğini öğrendikten sonra, ES hücrelerini embriyoid cisimlere ayırmak için kullanılan en yaygın tekniklerden biri olan asılı damla yöntemine bakalım.
Başlangıç olarak, ES hücreleri kollajenaz gibi proteolitik enzimlerin yardımıyla ayrılır ve soya özgü farklılaşma faktörleri içeren ortamlarda istenen konsantrasyona seyreltilir. ES hücre süspansiyonu daha sonra bir bakteri petri kabının kapağına damlalar halinde bırakılır. Kapak hızlı bir şekilde ters çevrilir ve tabağın üzerine yerleştirilir, böylece ortam damlaları baş aşağı asılır ve embriyoid cisimlerin gelişmesine izin verir.
Yaklaşık iki gün sonra, EB'li damlalar toplanabilir ve daha fazla kültür için yapışmayan plakalara kaplanabilir. İstenen hücre soyu için uygun zaman noktasında, embriyoid cisimleri, daha fazla farklılaşma için jelatinleştirilmiş yapışkan doku kültürü kaplarına geri kaplanır.
Artık ES hücrelerini kültürlemenin ve ayırt etmenin temel tekniklerini ele aldığımıza göre, bunların belirli deneysel ihtiyaçlar için nasıl uyarlandığına bakalım.
Daha önce de belirtildiği gibi, ES hücreleri, farklı kültür koşulları altında belirli hücre tiplerine farklılaşmaya yönlendirilebilir. Bu deneyde, bilim adamları insan ES hücrelerinden motor nöronlar üretti. Bu, önce onları nöral soylarına yönlendiren farklılaşan embriyoid cisimlere faktörler eklenerek, ardından bu hücreleri özellikle motor nöronlara dönüştüren kimyasallar ve kaplama koşulları eklenerek yapıldı. Benzer yaklaşımları kullanarak, araştırmacılar ES hücrelerini ritmik olarak atan kalp kası hücrelerine ayırmada başarılı oldular.
Farklılaşan ES hücreleri, embriyolar doğal olarak gelişirken meydana gelen olayları taklit ettiğinden, bunları erken embriyonik gelişimin biyolojisini araştırmak için de kullanabiliriz. İncelenen fenomenlerden biri, bir dişi memelinin her hücresinde iki X kromozomundan birinin susturulduğu çok önemli bir süreç olan X kromozomu inaktivasyonu veya XCI'dir. Bilim adamları, gelişmekte olan EB'lerde spesifik RNA'ların ve proteinlerin dağılımını görselleştirerek, XCI'nin biyolojisi hakkında değerli bilgiler edindiler.
Son olarak, ES hücre deneyinin tutarlılığını ve verimliliğini artırmak için, bilim adamları sürekli olarak ES hücrelerini kültürlemek için daha iyi teknikler geliştirmeye çalışıyorlar. Bir yaklaşım, ES hücrelerini koloni dışı tip tek katmanlı kültürleme veya NCM adı verilen tek bir katmanda büyütmektir.
İnsan ES hücrelerinin, 3D agregalar olarak büyümediklerinde mutsuz olma eğiliminde olduklarını hatırlıyor musunuz? Bilim adamları, ROCK inhibitörleri olarak bilinen kimyasalların, ayrışmış ES hücrelerinin hayatta kalmasını artırdığını, bu da onların tek hücreli süspansiyonlar olarak geçmelerine ve yüksek yoğunlukta kaplanmalarına izin verdiğini göstermiştir. NCM tekniğinin avantajı, her hücrenin ortamdaki büyüme faktörlerine ve besin maddelerine daha eşit şekilde maruz kalması, kültür içindeki heterojenliği azaltırken ES hücrelerinin çok sayıda büyümesini kolaylaştırmasıdır.
JoVE'nin embriyonik kök hücrelerin nasıl kültürleneceği ve ayırt edileceği hakkındaki videosunu izlediniz. Artık ES hücrelerini farklılaşmamış durumda tutmak için hangi faktörlerin önemli olduğunu ve bir tabakta belirli hücre tipleri oluşturmak için ES hücre pluripotensinden nasıl yararlanabileceğimizi bilmelisiniz. İleriye dönük olarak, bilim adamları, rejeneratif tıp uygulamalarında kullanılabilecek özel hücre türleri üretmek için daha verimli ve iyi tanımlanmış kültürleme ve farklılaşma koşulları geliştirmek için çalışacaklar. İzlediğiniz için teşekkürler!
Embriyonik kök hücreler veya ES hücreleri, onları normal yetişkin hücrelerden ayıran bir dizi benzersiz özelliğe sahiptir. Bu nedenle, bilim adamları bu özellikleri korumak veya bunlardan yararlanmak için özel kültür teknikleri geliştirdiler. Düzgün bir şekilde kültürlendiğinde, ES hücreleri kendilerinden daha fazlasını yapmak için süresiz olarak bölünebilir. Aynı zamanda, kültür koşullarını değiştirerek, ES hücreleri vücudumuzda bulunan hemen hemen her hücre tipine farklılaşacak şekilde yönlendirilebilir; ES hücrelerinin bu yeteneğine "pluripotentlik" denir.
Bu videoda, ES hücrelerinin benzersiz özelliklerini koruyacak şekilde nasıl kültürleneceğini ve geçirileceğini, belirli hücre tipleri oluşturmak için ES hücrelerinde farklılaşmanın nasıl indükleneceğini ve ES hücre kültürü ve farklılaşma tekniklerinin günümüzde araştırmacılar tarafından nasıl kullanıldığını ve rafine edildiğini öğreneceksiniz.
ES hücre bakımı prosedürlerinin ayrıntılarına girmeden önce, ES hücre farklılaşmasını neyin önlediğini veya yönlendirdiğini anlamak önemlidir. ES hücrelerinin benzersiz pluripotentlik ve kendini yenileme özelliklerini koruyabilmeleri için, büyüme ortamlarında spontan farklılaşmayı baskılayan spesifik faktörlerle kültürlenmeleri gerekir.
Bu en yaygın olarak, ES hücrelerinin bir "besleyiciler" tabakası, genellikle fare embriyonik fibroblastları veya MEF'ler üzerinde kültürlenmesiyle yapılır. Besleyici hücreler, ES hücrelerini, ES hücrelerinin farklılaşmamış durumlarında kalmasına yardımcı olan aktivin A gibi belirli faktörleri "besler".
Son zamanlarda, bilim adamları, ES hücrelerinin tanımlanmış bir tarifte gerekli faktörlerin eklendiği ortamda büyütüldüğü besleyici içermeyen kültür yöntemleri de geliştirdiler. Bu yaklaşım, değişkenliği azaltır ve klinik uygulamalar için bir ön koşul olan ES hücre kültürlerinden insan olmayan bileşeni çıkarır.
ES hücrelerinin bir başka özelliği de, doğal olarak kümeler veya koloniler halinde büyümeleri ve tek hücrelere, özellikle de insan ES hücrelerine ayrıştıklarında düşük hayatta kalma oranına sahip olma eğiliminde olmalarıdır. Sonuç olarak, insan ES hücrelerinin geçmesi, genellikle onları mekanik "toplama" yoluyla sağlam kümeler halinde tutmayı gerektirir.
ES hücreleri yapışık olmayan koşullarda büyütüldüğünde, ES hücrelerinin tüm farklı hücre tiplerine farklılaşacağı embriyoid cisimleri veya EB'ler olarak bilinen 3D agregalar oluştururlar. Bilim adamları, ortama spesifik büyüme faktörlerinin eklenmesi gibi farklılaşma koşullarını değiştirerek, ES hücre farklılaşmasını belirli hücre tiplerine yönlendirmek için yöntemler geliştiriyorlar.
Artık ES hücre bakımı ve farklılaşmasının arkasındaki ilkeleri anladığınıza göre, ES hücrelerinin MEF besleyicilerde nasıl kültürleneceğine ve geçirileceğine bakalım.
MEF'ler erken evre fare embriyolarından elde edilir ve daha sonra daha fazla bölünmelerini önlemek için kimyasallar veya radyasyon ile etkisiz hale getirilir. İnaktive edilmiş MEF'ler, ES hücrelerini kültürlemeye başlamadan en az bir gün önce jelatinleştirilmiş doku kültürü kapları üzerine kaplanmalıdır. Besleyiciler tamamen yerleştiğinde, ES hücreleri çözülür ve plakalara tohumlanır.
Önümüzdeki birkaç gün içinde, ES hücreleri büyük koloniler halinde büyüyecek. Koloniler dokunmaya ve kaynaşmaya başlamadan önce, ES kültürüne geçilmelidir. Farklılaşma belirtileri gösterip göstermediklerini görmek için ES hücrelerinin morfolojisi gözlemlenmelidir. Farklılaşmamış ES kolonileri genellikle iyi tanımlanmış ve homojen görünürken, farklılaşmış hücreler donuk, düzensiz şekilli "parke taşları" gibi görünür.
Koloniler %70 veya daha fazla farklılaşma gösteriyorsa veya seyrekse, farklılaşmamış kolonileri mekanik olarak kesin ve yeni bir besleme plakasına aktarın. Aksi takdirde, farklılaşmış alanları veya kolonileri çıkarın ve geçişe devam edin.
Farklılaşmış koloniler temizlendikten sonra, hücreleri uygun süre boyunca 37 ° C'de inkübasyon ile plakadan kaldırmak için kollajenaz gibi proteolitik enzimler eklenir. Daha sonra enzimatik reaksiyonları durdurmak için taze ES ortamı eklenir. Koloniler mekanik olarak plakadan çıkarılır ve bir santrifüj tüpüne aktarılır, burada nazik pipetleme ile istenen boyutlara ayrılırlar. ES hücreleri santrifüjleme ile toplanır, ES ortamında yeniden süspanse edilir ve hazırlanan besleyici plakalara kaplanır.
ES hücrelerinin nasıl geçirileceğini öğrendikten sonra, ES hücrelerini embriyoid cisimlere ayırmak için kullanılan en yaygın tekniklerden biri olan asılı damla yöntemine bakalım.
Başlangıç olarak, ES hücreleri kollajenaz gibi proteolitik enzimlerin yardımıyla ayrılır ve soya özgü farklılaşma faktörleri içeren ortamlarda istenen konsantrasyona seyreltilir. ES hücre süspansiyonu daha sonra bir bakteri petri kabının kapağına damlalar halinde bırakılır. Kapak hızlı bir şekilde ters çevrilir ve tabağın üzerine yerleştirilir, böylece ortam damlaları baş aşağı asılır ve embriyoid cisimlerin gelişmesine izin verir.
Yaklaşık iki gün sonra, EB'li damlalar toplanabilir ve daha fazla kültür için yapışmayan plakalara kaplanabilir. İstenen hücre soyu için uygun zaman noktasında, embriyoid cisimleri, daha fazla farklılaşma için jelatinleştirilmiş yapışkan doku kültürü kaplarına geri kaplanır.
Artık ES hücrelerini kültürlemenin ve ayırt etmenin temel tekniklerini ele aldığımıza göre, bunların belirli deneysel ihtiyaçlar için nasıl uyarlandığına bakalım.
Daha önce de belirtildiği gibi, ES hücreleri, farklı kültür koşulları altında belirli hücre tiplerine farklılaşmaya yönlendirilebilir. Bu deneyde, bilim adamları insan ES hücrelerinden motor nöronlar üretti. Bu, önce onları nöral soylarına yönlendiren farklılaşan embriyoid cisimlere faktörler eklenerek, ardından bu hücreleri özellikle motor nöronlara dönüştüren kimyasallar ve kaplama koşulları eklenerek yapıldı. Benzer yaklaşımları kullanarak, araştırmacılar ES hücrelerini ritmik olarak atan kalp kası hücrelerine ayırmada başarılı oldular.
Farklılaşan ES hücreleri, embriyolar doğal olarak gelişirken meydana gelen olayları taklit ettiğinden, bunları erken embriyonik gelişimin biyolojisini araştırmak için de kullanabiliriz. İncelenen fenomenlerden biri, bir dişi memelinin her hücresinde iki X kromozomundan birinin susturulduğu çok önemli bir süreç olan X kromozomu inaktivasyonu veya XCI'dir. Bilim adamları, gelişmekte olan EB'lerde spesifik RNA'ların ve proteinlerin dağılımını görselleştirerek, XCI'nin biyolojisi hakkında değerli bilgiler edindiler.
Son olarak, ES hücre deneyinin tutarlılığını ve verimliliğini artırmak için, bilim adamları sürekli olarak ES hücrelerini kültürlemek için daha iyi teknikler geliştirmeye çalışıyorlar. Bir yaklaşım, ES hücrelerini koloni dışı tip tek katmanlı kültürleme veya NCM adı verilen tek bir katmanda büyütmektir.
İnsan ES hücrelerinin, 3D agregalar olarak büyümediklerinde mutsuz olma eğiliminde olduklarını hatırlıyor musunuz? Bilim adamları, ROCK inhibitörleri olarak bilinen kimyasalların, ayrışmış ES hücrelerinin hayatta kalmasını artırdığını, bu da onların tek hücreli süspansiyonlar olarak geçmelerine ve yüksek yoğunlukta kaplanmalarına izin verdiğini göstermiştir. NCM tekniğinin avantajı, her hücrenin ortamdaki büyüme faktörlerine ve besin maddelerine daha eşit şekilde maruz kalması, kültür içindeki heterojenliği azaltırken ES hücrelerinin çok sayıda büyümesini kolaylaştırmasıdır.
JoVE'nin embriyonik kök hücrelerin nasıl kültürleneceği ve ayırt edileceği hakkındaki videosunu izlediniz. Artık ES hücrelerini farklılaşmamış durumda tutmak için hangi faktörlerin önemli olduğunu ve bir tabakta belirli hücre tipleri oluşturmak için ES hücre pluripotensinden nasıl yararlanabileceğimizi bilmelisiniz. İleriye dönük olarak, bilim adamları, rejeneratif tıp uygulamalarında kullanılabilecek özel hücre türleri üretmek için daha verimli ve iyi tanımlanmış kültürleme ve farklılaşma koşulları geliştirmek için çalışacaklar. İzlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What factors maintain embryonic stem cells in an undifferentiated state?
Embryonic stem cells require specific factors in their growth medium to suppress spontaneous differentiation and retain pluripotency. Feeder cells, typically mouse embryonic fibroblasts (MEFs), provide factors like activin A that maintain ES cells undifferentiated. Alternatively, feeder-free methods use defined media recipes with necessary factors added directly, reducing variability and enabling clinical applications.
Q2: Why do human embryonic stem cells require mechanical picking during passaging?
Human ES cells naturally grow in clusters and have low survival rates when dissociated into single cells. Mechanical picking preserves intact cell clumps, maintaining viability during passaging. This approach contrasts with feeder-free methods using ROCK inhibitors, which allow single-cell suspension passaging at high density while improving cell survival and reducing culture heterogeneity.
Q3: What is the hanging drop method used for in embryonic stem cell differentiation?
The hanging drop method directs ES cell differentiation into specific cell types by forming embryoid bodies (EBs). ES cells are suspended in media containing lineage-specific differentiation factors and deposited as drops on inverted petri dish lids. After two days, EBs are collected and plated onto non-adherent plates, then transferred to adherent dishes at appropriate timepoints for further differentiation.
Q4: How can embryonic stem cells be directed to differentiate into specific cell types?
Scientists direct ES cell differentiation by varying culturing conditions and adding specific growth factors to the medium. For example, motor neurons are produced by first adding factors that direct embryoid bodies toward the neural lineage, followed by chemicals and plating conditions that specify motor neuron identity. Similar approaches have successfully generated rhythmically beating heart muscle cells.
Q5: What are embryoid bodies and how do they form?
Embryoid bodies (EBs) are three-dimensional aggregates that form when ES cells grow in non-adherent conditions. Within EBs, ES cells differentiate into multiple cell types, mimicking early embryonic development. By controlling differentiation conditions and growth factors, researchers can direct EB development toward specific cell lineages for regenerative medicine applications.
Q6: What is pluripotency and why is it important for embryonic stem cell research?
Pluripotency is the ability of ES cells to differentiate into almost any cell type found in the body. This unique property allows researchers to generate specialized cells for studying embryonic development and developing treatments for degenerative diseases. Maintaining pluripotency requires culturing ES cells with specific factors that suppress spontaneous differentiation.
Q7: How do scientists study early embryonic development using differentiated embryonic stem cells?
Because differentiating ES cells mimic events occurring during natural embryonic development, researchers use them to investigate developmental biology. For instance, scientists study X-chromosome inactivation (XCI) by visualizing specific RNAs and proteins in developing embryoid bodies. This approach provides valuable insights into crucial developmental processes without requiring intact embryos.
Bu videodaki bölümler
0:00
Overview
1:07
Principles of ES Cell Culturing and Differentiation
3:13
Growing and Passaging ES Cells on MEFs
5:26
ES Differentiation by the Hanging Drop Method
6:32
Applications
9:08
Summary