Name: Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile fare meme tümör modellerinde akciğer metastazı Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Öğrenin, fare meme tümör modellerinde akciğer metastazını kantitatif gerçek zamanlı PCR ile değerlendirme yöntemini. Bu teknik, tümör hücrelerine özgü mRNA'yı hassas bir şekilde tespit ederek metastaz düzeyini nicel olarak ölçer ve kanser ilerlemesinin anlaşılmasına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yeh laboratuvar, bir Amerikan Kanser Derneği Kurumsal Araştırma Bursu (IRG-97-219-14) Bir Savunma Bakanlığı hibe araştırma fonları tarafından, musc at Hollings Kanser Merkezi&#39;nde verilen (W81XWH-11-2- araştırma fonları tarafından desteklenen 0229) musc at ve endişe (Esy kadar) Vakıf bir ödül ile.

Protokol kurallarına ve South Carolina (MUSC) ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Tıp Üniversitesi (IACUC) hayvan bakım standartlarını izler. 1. Akciğer Diseksiyon <ol><li> Meme tümör diseksiyonu (opsiyonel çalışma hedeflerine ve primer tümör analiz veya kuyruk ven enjeksiyon yapıldı mı bağlı). <ol><li> IACUC ve üniversite yönetmeliğine göre izofluran anestezisi bir öldürücü doz kullanarak fare Euthanize. Cerrahi dislokasyon euthanization onaylayın. </li><li> Köpük tahta, bacaklarda yayılması ile sırtında fare koyarak diseksiyon iğneleri ile pim üzerinde. </li><li> % 70 etanol ile fare püskürtün. </li><li> Forseps kullanarak, merkezde hayvan alt kısmını kavramak. </li><li> Makas kullanarak, fare periton boşluğuna delmek için dikkatli olmak, deri yoluyla boyun doğru yukarı kesti. </li><li> Tümör dokusu ortaya çıkarmak için bacaklarda cildi kesin. </li><li> Tümör dokusu ve pr parçalara ayırDaha fazla analiz için (değil bu protokolde ayrıca tartışılacaktır), bu tür donma veya fiksasyonu gibi, tercih edilen yöntem ile eserve. </li></ol></li><li> Akciğer doku diseksiyonu. <ol><li> Yukarıda açıklandığı gibi tümör dokusu hasat ise, herhangi bir aşırı cilt aşağı pin. </li><li> Forseps kullanarak, hayvanın alt ucunda periton kavramak ve boyun tabanına doğru yukarı kesme başlar. </li><li> Dikkatle göğüs boşluğuna kanama olabilir herhangi bir kan damarlarını kesmekle önlemek için dikkatli olmak kaburga kafesinin sağ ve sol kenarlarında kesilmiş. Sol ve sağ kaburga kafesinin diyafram ve üst kısımları keserek kaburga kemikleri çıkarın. </li><li> Forseps kullanarak fare trakea kavramak ve ileri çekin. </li><li> Diseksiyon makas ile trakea Sever ve fare akciğerleri kaldırmak. Not: Kalp akciğer takılı kalabilir. Bu durum ortaya çıkarsa, dikkatli beş lobları toplamak için dikkatli olmak akciğerlere uzak kalbini incelemek (bakınız Şekil 1 </strong&gt;). </li><li> Aşırı kan çıkarmak için PBS ile hafifçe yıkayın. </li></ol></li><li> Akciğer dokusunda Brüt değerlendirilmesi. <ol><li> Seçenek 1: In vivo görüntüleme. <ol><li> Lusiferaz görüntüleme için, ~ 10 dakika önce görüntüleme, hayvanlara intraperitonal (ip) enjeksiyonu ile luciferase bir 150 mg / kg doz vermek. Anestezi altındaki hayvanlarda veya diseksiyon (Şekil 2) 5 sonra kaldırılması üzerine in vivo Görüntü akciğerler. </li></ol></li><li> Seçenek 2: Brüt değerlendirme. <ol><li> Tümör nodüller görselleştirmek için stereo mikroskop altında akciğerleri inceleyin. Not: hücreler, etiketli GFP ise, GFP tespit etmek için (470/510 nm civarındaki gibi) uygun bir uyarım / emisyon maksimum ile ışık küp ihtiva eden bir floresan yeteneğine stereomikroskop işleme öncesinde floresan stereoskopik akciğerlere incelemek için kullanılabilir. </li></ol></li><li> Akciğerler derhal analiz edilecek ise, &#39;RNA izolasyonu&#39; bölümüne geçin. Aksi takdirde, Sıvı sabun kullanılarak dondurularak doku ekid azot veya kuru buz. -80 ° C saklayın. </li></ol></li></ol> 2. RNA İzolasyon Not: Örnek analizinde, RNA, bir RNA izolasyon kiti (Malzeme listesi) kullanılarak izole edilmiştir. Geçerli analiz belirli bir üreticinin ürettiği kullanırken, izolasyon kitleri çeşitli birçok saygın satıcılardan temin edilebilir. Ayrıca, sigara kit tabanlı santrifüj yöntemleri de bir seçenek vardır. cDNA, standart eğrisi analizi için bir hücre hattı veya plazmid olarak, bir pozitif kontrol RNA numunesinden hazırlanmalıdır. Alternatif olarak, primer prob seti için belirli bir pozitif kontrol satın alınabilir (Malzeme Listesi&#39;ne bakın). <ol><li> Önceden dondurulmuş doku kullanıyorsanız, kuru buz dondurulmuş doku toplamak. </li><li> Örneğin aşağıdaki yöntemlerden biri kullanılarak doku homojenize: havan ve tokmak doku sıvı nitrojen içerisinde dondurulduktan sonra, kuru buz üzerine el ile yapılan öğütme; Doku homojenizatörü veya mekanik ayrışma cihazıÜreticinin öneri başına; sonikasyon veya diğer tercih edilen yöntem. Not: temsilci analizi için homojenizasyon tercih edilen yöntemdir sonikasyonudur. <ol><li> Şekil 3 sunulan analizi için, bir oranda parçalama (RNA izolasyon kiti sağlanan) tampon ve 2-merkaptoetanol hazırlanması 20 ul 2-merkaptoetanol lisis tamponu, her 1 ml. Süspanse dokusu 300 ul liziz tamponu içinde% 30 genlik ayarlanmış sonikatör 10 sn için doku ve sonikasyon, her 30 g 2-merkaptoetanol ile takviye edilmiştir. </li><li> Öğütme sonrası 300 ul liziz tamponu içinde tekrar süspansiyon temel doku, harç ve havan tokmağı kullanılarak edin. </li></ol></li><li> 590 ul TE tampon maddesi (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0) 10 ul proteinaz K ilave. Doku (yani her 30 mg) her 300 ul 600 ul proteinaz K çözüm ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Not: Sindirim süresi değişebilir. </li><li> ≥1 örnekleri Santrifüj10 dakika boyunca 3000 gr enkaz kaldırmak için. </li><li> Yeni tüplere süpernatant aktarın. </li><li> RNA çöktürmek için süpernatan, her 900 ul için 450 ul etanol (% 96 -100%) ekleyin. </li><li> Kolona lizat / etanol karışımı 700 ul aktarın. </li><li> 1 dakika boyunca ≥13,000 g&#39;de santrifüjleyin örnekleri kolona RNA bağlama. </li><li> Sıvı atık atın ve sütun kalan süpernatant ekleyin ve tekrar döndürün. </li><li> Tüm lisatı kolonu boyunca bükülmüş bir kez, 30 saniye süre ile ≥13,000 g kolonu ve santrifüj örnekleri üst kısmına Yıkama Tamponu 1 350 ul ilave edin. </li><li> Sütundan sıvıyı atın ve üst kısmı değiştirin. </li><li> Ben 10x DNaz 5 ul ve numune başına DNaz / RNaz ücretsiz su 40 ul (50 ul / numune toplam hacim) ile enzim DNaz 5 birim karıştırılarak DNaz hazırlayın. </li><li> DNase 50 ul, her sütun için karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe ekleyin. </li><li> Kolon ve santrifüj sam ile Yıkama Tamponu 1 350 ul ekleyinples 30 sn için ≥13,000 g. </li><li> Sütundan sıvıyı atın ve üst kısmı değiştirin. </li><li> Kolonuna Yıkama Tamponu 2 600 ul ilave edin ve ≥13,000 g&#39;de 30 saniye dönerler. </li><li> Sütundan sıvıyı atın ve üst kısmı değiştirin. </li><li> ≥13,000 g&#39;de 2 dakika süre ile 250 Yıkama Tamponu 2 ul ve santrifüj ekleyin. </li><li> Yeni koleksiyon tüpüne sütunun kısmını koyun ve eski toplama tüpü atın. </li><li> Sütuna RNaz / DNaz serbest su 50-100 ul ilave edin ve 1 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> ≥13,000 g 1 dakika boyunca dönerler. </li><li> Yeniden çalıştırın RNA verimi artırmak için kolon boyunca toplanan eluatın. </li><li> Acil kullanım için, buz üzerinde örnekleri tutmak ve kantitatif geçin. Daha sonra kullanmak için, kuru buz veya sıvı azot üzerinde dondurma ek. -80 ° C derin dondurucuda saklayın de ihtiyaç kadar. </li></ol> 3. içine First Strand Synthesis Not: temsilci analizi için, ters transkriptaz (RT) reaksiyonu, bir F gerçekleştirildi(Malzeme Listesi&#39;ne bakınız) QRT-PCR için tasarlanmış irst Strand cDNA sentez kiti. <ol><li> Numuneler daha önceden toplanmış olsaydı, buz üzerinde tüpler çözülme. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak RNA miktarını ölçün. </li><li> Toplam RNA&#39;nın 0,5-2 ug kullanılarak cDNA stokunun oluşturulması için ters transkriptaz kullanılarak birinci sarmal sentezi gerçekleştirmek. <ol><li> Steril, RNaz / DNaz içermeyen PCR tüpleri / levha, reaksiyon karışımı (Tablo 1) hazırlanması. Yavaşça ve santrifüj karıştırın. Standart bir PCR makinesi (Tablo 2) programlayın. </li></ol></li><li> Steril nükleaz içermeyen su kullanılarak istenen hacme (genellikle 50-100 ul) bitmiş reaksiyonu sulandırmak. </li></ol> 4. Real-time PCR Not: temsilci analizi için, SYBR yeşil kullanılmıştır. Ancak, herhangi bir tercih edilen yöntem, kullanıcının takdirine bağlı olarak ikame edilebilir. <ol><li> Bir pozitif kontrol cDNA kullanılarak, her bir primer grubu için bir standart eğri ayarlayın. <ol><li> Analiz i gösterilen İçinn Şekil 3, pozitif kontrol cDNA tavsiye üreticisi kullanarak insan HER2 için standart eğri hazırlamak (Malzeme Listesi&#39;ne bakın). Fare GAPDH için, bir standart eğri oluşturmak için negatif kontrol akciğer cDNA&#39;nın kullanılmasıdır. 5 standartları üretmek için 4: her bir prob için, seri cDNA 1 seyreltin. </li></ol></li><li> Standart eğri ve deneysel örnekleri içermelidir toplam örnek sayısını, hesaplayın. Not: Analiz burada açıklanan için numune başına 2-3 deneysel çoğaltır analiz edildi. Standart eğri analizi son normalleştirilmiş miktarını hesaplamak için, numune başına göre HER2 miktarı ve GAPDH belirlemek için uygulanabilecek bir basit doğrusal regresyon modeli oluşturmak için gerçekleştirilmiştir. Bu analiz aynı zamanda astar verimliliği eldeki analiz için yeterli olmasını sağlayacaktır. </li><li> Steril, RNaz / DNaz ücretsiz tüp içinde, ana karışımı (Tablo 3) hazırlar. <ol><li> Ana karışımı Amoun hesaplayınNumune başına t. Birden fazla örnek için büyütmek. Çevrede oluşturduğu her bir deney geni, hem de GAPDH gibi bir iç kontrol için bir ana karışımı kullanın. 200 nM&#39;lik bir nihai konsantrasyonda GAPDH için primerler kullanarak. Not: İnsan ve fare hücre kökenli ayırt çalışırken iç kontrol özellikle yararlıdır. Not: HER2 için primer konsantrasyonu optimize edilmiş ve üretici tarafından belirlenmiştir. </li></ol></li><li> Her standart veya numune deney tekabül eden 1 ul cDNA&#39;lan ihtiva eden test plakası hazırlanır. Her bir primer prob için en az 1 cDNA örnek / ayırın. Her primer prob için kuyu başına ana karışımı 19 ul ekleyin. Not: Şekil 3 temsili veriler için, alınan cDNA, her bir primer prob için iki kopya halinde analiz edilmiştir ve iki numune ortalaması olarak grafik haline. </li><li> QRT-PCR makinesinde çalıştırın reaksiyon tavsiye veya önceden PCR protokolü test kullanarak. Tablo 4 görün </sŞekil 3 ve Şekil 4&#39;te temsili veriler için kullanılan PCR protokolü için trong&gt;. </li></ol>

<ol><li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metastasis%3A+building+a+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li>
<li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metastasis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li>
<li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li>
<li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li>
<li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li>
<li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today+Dis+Models%22%5BJournal%5D)">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li>
<li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li>
<li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+living+subjects%3A+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li>
<li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li>
<li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li>
<li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li>
</ol>

Esy ve MAA FirstString Araştırma A.Ş. tarafından istihdam edilmeyen ve şirketin herhangi bir finansal çıkarı tutmayın. FirstString Research Inc. Bu yazıda sunuldu lusiferaz görüntüleme verileri sağlamıştır. GSG FirstString Araştırma başkanı ve CEO&#39;su. CLG FirstString Araştırma bir çalışanıdır. GSG ve CLG FirstString Research tarafından yayınlanan hisse senedi opsiyonları vardır.

Bu protokol, ksenograft fare modeli kullanarak, akciğer, meme tümör hücresi metastazının değerlendirmek için QRT-PCR kullanımını tarif etmektedir. Bu bioluminescent görüntüleme dahil olmak üzere diğer teknikler mevcuttur ve ayrıca kendi değerlerini ve sınırlamalar olmasına rağmen metastaz saptanması için etkili olduğu kabul edilmektedir. Sunulan veriler QRT-PCR Toplam metastaz ölçülmesi için, akciğer dokusu içindeki tümör kaynaklı mRNA tespit etkili bir ölçüsü temin ettiğine işaret etmektedir. Bu QRT-PCR analizi tamamla...

QRT-PCR analizi, tümör metastazı değerlendirmek için bir yöntem olarak önerilmektedir. Bu yöntem metastazı değerlendirilmesinde ilgilenen ancak in vivo görüntüleme ekipmanı ya da bir floresan yetenekli Stereoskop gibi belirli ekipmana erişimi olmayan kullanıcılar için bir alternatif olarak önerilmiştir. Yaygın olarak kullanılan yöntemlerin bir tartışma QRT-PCR analizi, ayrı olarak ya da metastaz değerlendirmek için eşlik eden bir yöntem olarak da kullanılabilir nasıl bir gösteri ardından sunulmuştur. Bu prosedür metastatik yükünün kantitatif analiz sağlama potansiyeline sahiptir. Bir stereomikroskop altında akciğerlerin görüntülenmesi yanı sıra hematoksilen ve eozin ardından seri kesit olmak üzere brüt analiz standart yöntemler, akciğer dokusunun (H &amp; E) boyama, ölçülebilir ancak 2-5 sayılması için kullanıcı tanımlı parametrelere dayanmaktadır. Stereomikroskopta kullanarak tüm akciğerleri değerlendirirken, sadece geniş yüzey metastazları visi vardırble ve analiz metastatik lezyon neyin belirlemek için akciğer anatomik yapının makul bilgiye sahip araştırmacı gerektirir. GFP ve ilgili uyarım / emisyon maksimumları (GFP örneğin yakınındaki 470/510 nm) ile bir ışık küp içeren bir stereomikroskop kullanımı gibi, bir işaretleyici ile tümör hücrelerinin floresan etiketleme bu işlemde yardımcı ancak yüzey tümör nodülleri saptanabilir . Buna ek olarak, GFP ile aynı parametreleri altında görünür kan kontaminasyonu, floresan, mümkün olan metastatik yanlış tanımlanmasına yol açabilir. Akciğer metastazı görselleştirmek için H &amp; E boyama ile takip akciğerin Kesit mikrometastazları ve bağışıklık hücre infiltrasyonu dahil olmak üzere diğer mikroskobik süreçleri değerlendirmek için yararlı bir yöntemdir ancak genellikle parafine, kesit ve boyama işlemleri için tüm akciğer dokusunun kullanılmasını gerektirir. Bu nedenle, mansap işlemleri bu metho aşağıdaki ideal değildird. Ölçülebilir, ancak bu işlem analizi akciğer tüm 3D yapısı oluşturan sağlamak için hayvan başına lekeli akciğer bölümlerinin büyük sayısını değerlendirmek için araştırmacı gerektirir. Sonuç olarak, bu tür muayeneler hatasını sayma yol açabilir, zaman tüketen ve analiz araştırmacı takdirine dayanır. (MR, PET, SPECT gibi) şu anda gerçekleştirmek veya deneysel kemirgen modellerinde 8 biyolojik süreçleri test etmek için kullanılan in vivo görüntüleme teknikleri Çeşitli. In vivo bioluminescent görüntüleme metastazı 9 brüt görünüm elde etmek için kullanılan yaygın bir yöntemdir. Bu teknik genellikle nedeniyle tümör hücresi implantasyonundan sonra meme bezi ve spontan metastaz sırasında akciğer gibi belirli organların ikamet bir lusiferaz cevap veren bir eleman ihtiva edecek şekilde tümör hücreleri, birikimine lusiferaz raportör etkinliği varlığını değerlendirmek uygulanır 1Lusiferaz raportör etkinliği 0. Görselleştirme lusiferin substratının (D-lusiferin) mevcudiyetinde tarafından indüklenir. Lusiferaz biyolüminesans üreten oksilusiferin D-luciferase oksidatif dekarboksilasyonunu katalize eder. Bilgilendirici olmakla birlikte, bu yöntem, alt-tabaka stabilite (örneğin, kısa yarı-ömür), deney hayvanlarına verilir bağlıdır alt-tabakanın yeterli bir dağılımı ve algılama 9 düşük hassasiyeti de dahil olmak üzere birçok faktör tarafından sınırlanır. Bu tekniğe Bir ana hak o, non-invaziv bir canlı hayvan üzerinde yapılabilir ve normalde diseksiyon 9,10 hasat edilmemiş olabilir birden organlarda tümör hücre metastazı saptanması yol açabilir olmasıdır. In vivo görüntüleme tekniklerinden biri olumlu yönü akciğer dokusu parafine gibi ikincil işlemler için izin dönülmelidir ya da burada sunulan, QRT-PCR analizi olmasıdır. Bununla birlikte, QRT-PCR Teorik olduğully tespiti daha hassas bir ölçümü, brüt değerlendirme akciğer tümör hücrelerinin mevcut düşük sayıda görülmemelidir. Yararlı ise, yukarıda tarif edilen görüntüleme teknikleri yer değiştirmiş olabilir veya şu anda tarif QRT-PCR yöntemi ile takviye edilmiştir. QRT-PCR akciğer içinde tümör kaynaklı mRNA duyarlı bir ölçüsünü sağlamak için potansiyele sahiptir.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Fisher</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet RNA İzolasyon Kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0732</td><td></td></tr><tr><td>iScript Ters Transkripsiyon Supermix, QRT-PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5121&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR SYBR Yeşil Testi: ERBB2, İnsan&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25636&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Yeşil Testi için PrimePCR Şablonu: ERBB2, İnsan&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25716&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>gapdh Primer Dizisi</td><td></td><td></td><td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGG</td></tr></tbody></table>

kantitatif gerçek zamanlı pcr ile fare meme tümör modellerinde akciğer metastazı değerlendirilmesi

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatik hastalık uzak organ primer kanser sitesinden habis tümör hücrelerinin yayılması ve kanserle ilişkili ölüm 1 birincil nedenidir. Metastatik yayılım Ortak siteleri akciğer, lenf nodu, beyin ve kemik 2 sayılabilir. Metastazı sürücü mekanizmalar kanser araştırmaları yoğun alanlardır. Metastaz uzak siteler kanser araştırmaları için enstrümantal şunlardır Sonuç olarak, tahliller metastatik yükünü ölçmek için. Meme tümörü modellerinde akciğer metastazlarının değerlendirilmesi, genel olarak, aşağıdaki akciğer dokusunun diseksiyon brüt niteliksel gözlem ile gerçekleştirilir. Metastazı değerlendirilmesinde nicel yöntemler şu anda ex vivo ve kullanıcı tanımlı parametre gerektiren vivo görüntüleme bazlı teknikler sınırlıdır. Bu tekniklerin çoğu oldukça hücresel düzeyde 3-6 den bütün organizma düzeyinde bulunmaktadır. Çoklu foton mikroskopi kullanılarak yeni görüntüleme yöntemleri metalar değerlendirebilecektir rağmenhücresel düzeyde 7&#39;de tasis, bu son derece zarif prosedürleri yayılma mekanizmaları yerine metastatik yükünün kantitatif değerlendirmesini değerlendirmek için daha uygundur. Burada, kantitatif metastaz değerlendirmek için basit bir in vitro yöntem sunulmaktadır. Kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanılarak (QRT-PCR), tümör hücresi spesifik mRNA fare akciğer dokusu içinde tespit edilebilir.

Zaman ötesinde deneysel hayvana ve gerekirse, tümör hücrelerinin ilk aşılama gerçekleştirmek için gereken performans, in vivo tümör analizi, doku hasat, RNA izolasyonu ve QRT-PCR analizi birincil bir 1-2 günlük bir işlemdir (Şekil 1) . Brüt analizinin bir örneği, akciğer dokusu içindeki tümör hücrelerini değerlendirmek için bir biyoışıldama görüntülemedir. Burada, bir meme tümör oluşumu deney...

Bu protokol fare akciğer dokusu içindeki metastazı temsil tümör hücre spesifik mRNA tespit etmek için kantitatif gerçek zamanlı PCR (QRT-PCR) nasıl kullanılacağı açıklanır.

Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile fare meme tümör modellerinde akciğer metastazı Değerlendirilmesi

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Bu prosedürün genel amacı, metastazı analiz etmenin bir yöntemi olarak, akciğerdeki tümör hücrelerinden belirli bir MRNA miktarını tespit etmektir. Bu tekniğin temel avantajı, metastazın kantitatif bir ölçümü olmasıdır. Akciğer tümörü diseksiyonunu gerçekleştirmek için, metin protokolüne uygun olarak letal dozda isofluorine ile bir fareyi ötanize ettikten sonra, fareyi uzuvları açık şekilde sırt üstü bir köpük tahtaya yerleştirin ve fareyi tahtaya sabitlemek için diseksiyon iğneleri kullanın.Fareye etanol püskürtüldükten sonra, bir pens yardımıyla hayvanın alt kısmını merkezden kavrayın ve makasla, farenin periton boşluğunu delmemeye dikkat ederek, deri üzerinden boyuna doğru yukarıya doğru kesin. Şimdi, hayvanın alt ucundaki peritonu kavrayın ve boyun tabanına doğru yukarıya doğru kesmeye başlayın. Torasik boşluğa kanama yapabilecek herhangi bir kan damarını kesmemeye özen göstererek, göğüs kafesinin sol ve sağ yanları boyunca dikkatlice kesin.Diyafram ve göğüs kafesinin üst kısımlarından geçerek sola ve sağa doğru kesim yaparak kaburga kemiklerini çıkarın. Ardından, bir pens yardımıyla farenin trakesini kavrayıp öne doğru çekin ve akciğerleri fareden çıkarmadan önce trakesi ayırmak için disseksiyon makası kullanın. Akciğer dokusunu nazikçe yıkamak için PBS kullanın.Ardından, metin protokolüne göre akciğer dokusunun makroskobik değerlendirmesi yapıldıktan sonra, akciğerler hemen analiz edilecekse RNA izolasyonuna geçiniz. Dokudan RNA izole etmek için, metin protokolünde listelenen yöntemlerden birini kullanarak dokuyu homojenize ederek başlayınız. Bir RNA izolasyon kitinden liziz tamponu hazırlayınız ve her 1 mililitre liziz tamponuna 20 µL tumor captoethanol ekleyiniz.Her 30 gram dokuyu 300 µl lizis tamponu içinde yeniden süspande edin ve %30 genliğe ayarlanmış bir sonikatör ile dokuyu 10 saniye boyunca sonikasyona tabi tutun. 590 µl TE tamponuna 10 µl proteinaz K ekleyin ve bu tampondan 600 µl'yi 300 µl sonike edilmiş dokuya ilave edin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.Ardından, kalıntıları uzaklaştırmak için örnekleri 10 dakika boyunca 13.000 ×g veya daha yüksek hızda santrifüjleyin. Daha sonra süpernatantı yeni tüplere aktarın. RNA'yı çöktürmek için her 900 µL süpernatanta 450 µL etanol ekleyin.Ardından, lizat etanol karışımının 700 µL'sini bir RNA kolonuna aktarın. RNA'nın kolona bağlanması için tekrar ≥ 13,000 ×g hızında bir dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra sıvı atığı dökün, geri kalan süpernatantı kolona ekleyin ve tekrar santrifüjleyin.Ardından, kolonun üst kısmına 350 µL yıkama tamponu bir ekleyin ve örnekleri 30 saniye boyunca santrifüjleyin. Sıvı atığı boşaltın ve kolonu tüpe geri yerleştirin. Her bir örnek için beş ünite DNase bir enzimi, beş µL 10X DNase tamponu ve 40 µL DNase RNase içermeyen suyu karıştırarak DNase hazırlayın.Her bir kolona 50 µL DNase karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Ardından kolonlara 350 µL yıkama tamponu bir ekleyin ve örnekleri 30 saniye boyunca santrifüjleyin. Atık solüsyonu döktükten sonra 600 µL yıkama tamponu iki ekleyin ve 30 saniye daha döndürün.250 µL yıkama tamponu iki eklemeden önce sıvıyı atın ve ardından iki dakika boyunca santrifüjleyin. Kolonu yeni bir toplama tüpüne aktarın ve kolona 50 ila 100 µL RNaz DNaz içermeyen su ekleyin. Bir dakika inkübasyondan sonra, bir dakika boyunca santrifüjleyin.RNA verimini artırmak için toplanan elüatı kolondan tekrar geçirin. Hemen kullanacaksanız, numuneleri buz üzerinde tutun. Daha sonra kullanmak için kuru buz veya sıvı azot ile hızlıca dondurun ve ihtiyaç duyulana kadar -80 °C'de saklayın.Bir spektrofotometre kullanarak RNA miktarını belirleyin. Ardından, steril RNaz ve DNaz içermeyen PCR tüplerinde veya plakalarında, bu tabloda gösterildiği gibi, ilk transentez için reaksiyon karışımını hazırlamak amacıyla 0,5 ila 2 mikrogram toplam RNA kullanın. Karıştırın, hafifçe santrifüjleyin ve standart bir PCR cihazını burada gösterilen programı kullanarak programlayın.Reaksiyon tamamlandığında, bitmiş reaksiyonu istenen hacme seyreltmek için steril, nükleaz içermeyen su kullanın. Gerçek zamanlı PCR gerçekleştirmek için, cDNA'nın beş standart oluşturacak şekilde bir ila dört seri dilüsyonunu hazırlayarak her primer seti için bir standart eğrisi kurmak amacıyla insan HER2 gibi bir pozitif kontrol cDNA kullanın. Ardından, standart eğrisi ve deneysel örnekleri içermesi gereken toplam örnek sayısını hesaplayın.Ardından, steril RNase ve DNase içermeyen tüplerde, her bir ilgilenilen deneysel genin yanı sıra gapdh gibi bir iç kontrol için bir master mix hazırlayın. Her bir standart veya deneysel örnek için bir mikrolitre cDNA içeren bir test plakası hazırlayın. Her bir primer probu için kuyu başına en az bir cDNA örneği yerleştirin.Her primer prob için kuyucuk başına 19 µL mastermix ekleyin. Bu biyolüminesans deneyi, gap junction proteini Connexin 43'ü hedefleyen ACT1 ile tedavi edilen fare akciğerlerinin lüsiferaz aktivitesi açısından negatif göründüğünü ve bunun dokuda tümör hücrelerinin bulunmadığını düşündürdüğünü kanıtlamaktadır. Ancak, akciğer dokusunun H&E kesitlerinin analizi, lüsiferaz tarafından aydınlatılmamış mikrometastazlar olduğunu göstermekte; bu da lüsiferaz görüntülemenin düşük sayıdaki tümör hücrelerini tespit etmek için yeterince hassas olmadığını ortaya koymaktadır.Burada, başlangıçta fare bellek yağ pedine nakledilen hücrelerden gelen akciğer dokusundaki insan HER2 pozitif JIMT1 tümör hücrelerini tespit etmek için HER2'ye özgü bir prob kullanılarak gerçekleştirilen bir qRT-PCR deneyinin sonuçları gösterilmiştir. Akciğerlerin hiçbirinde makroskobik olarak görünür metastaz gözlemlenmemesine rağmen, 11 örneğin ikisinde qRT-PCR ile metastaz tespit edilmiştir. Bu şekilde, bir hücre sayısı serisinde fare akciğer gapdh değerine göre normalize edilmiş bağıl HER2 seviyelerini belirlemek için bir standart eğri analizi hazırlanmıştır.Sonuçlar, HER2 probu kullanılarak gerçekleştirilen qRT-PCR'ın, 10 hücre kadar az sayıda hücredeki HER2 seviyelerini tespit edebilecek kadar hassas olduğunu göstermektedir. Son olarak, bu regresyon analizi, pozitif ve negatif kontroller dahil olmak üzere her bir akciğer örneğindeki göreceli hücre sayısını göstermektedir. Bu teknik, yeterince deneyim kazanıldıktan sonra, uygun şekilde uygulandığında altı ila sekiz saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, RNA izolasyonu ve ters transkriptaz reaksiyonu sırasında RNA bütünlüğünü korumak için önlem almayı hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, tüm akciğer dokusunda metastazın kantitatif gerçek zamanlı PCR ile nasıl tespit edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

evaluation-lung-metastasis-mouse-mammary-tumor-models-quantitative

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Insan prostat kanser ortotopik bir model akciğer tümör hücreleri ve farklı metastaz oluşumu dolaşan tümör boyutu ölçümü sağlar. Hücreler birincil organı kaçmak gerekir gibi, kan dolaşımına girerek, ve bir ikincil site içine implant, bu modeli etkin insanlarda senaryo tartışıldı.

İnsan Prostat Kanser metastaz Ortotopik fare modeli

Bu protokolün amacı meme tümörigenezini incelemektir. Bu teknikle, fare meme tümörleri çıkarılır ve tümörlerden birincil hücreler hazırlanır. Akciğer metastazını incelemek için bir akciğer ekstraksiyon protokolü dahildir. Ayrıca, fare embriyosundan fare embriyonik fibroblastlarını analiz etmek için başka bir protokol dahil edilmiştir.

Primer Tümör ve Akciğer Metastazı Eğitim için MEF Hücre İzolasyonu

Burada, kanser metastazında pulmoner alveoler makrofajların fonksiyonlarını incelemek için model ve yaklaşımı açıklıyoruz. Bu hücrelerin metastazdaki rolünü göstermek için, alveolar makrofajın klodronat lipozomlarla tükenmesi ile birlikte meme kanserinin sinjenik (4T1) modeli kullanıldı.

Meme Kanseri Metastaz alveoler makrofajlar Rolü incelenmesi

Meme kanseri metastazını hedef alan adjuvan tedaviyi değerlendiren klinik öncesi modeller eksiktir. Buna değinmek için, de novo pulmoner meme adenokarsinom metastazına ait bir fare modeli geliştirdik, burada adjuvan ortamında (primer tümörlerin cerrahi sonrası rezeksiyonu) uygulanan terapiler önceden tohumlanmış pulmoner metastazları etkilemek için etkinlik açısından değerlendirilebilir.

Klinik Öncesi Bir Murin Modeli İçin Cerrahi Prosedürler ve Metodoloji<emDe Novo</emMeme Kanseri Metastazı

Bu makalede, pulmoner metastaz tahlil (PuMA) Protokolü'nün ayrıntılı bir açıklama sağlamak için hedeftir. Bu model araştırmacılar metastatik osteosarkom (OS) hücre büyümesini widefield floresan veya confocal mikroskop lazer tarama kullanarak akciğer dokusunda çalışmaya izin verir.

Metastatik akciğer kolonizasyon pulmoner metastaz tahlil kullanarak osteosarkom içinde eğitim pratik düşünceler

Biz bir fare orthotopic meme kanseri modeli ve radikal mastektomi modeli insan meme kanseri ilerleme taklit etmek için tümör yükünü ölçmek için bioluminescence teknolojisi ile tanıtmak.

Fare Orthotopic metastatik meme kanseri Model oluşturma ve fare radikal mastektomi gerçekleştirme

Bu çalışma, yeşil floresan protein ve biyolüminesans sinyallerinin yanı sıra kantitatif moleküler algılama tekniğinin entegrasyonu ile tümör yüklemesini doğru bir şekilde değerlendirmek için gelişmiş bir protokol hazırlaştır.

Ortotopik Meme Kanseri Modeli Kullanarak Üçlü Negatif Meme Kanseri Eğitimi

Açıklanan yaklaşım, akciğerlerdeki metastaz sayısı ve boyutunun ölçülmesine ek olarak meme kanseri metastazı oluşumunun ve büyümesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak sağlamak için deneysel kuyruk ven metastazı tahlillerini in vivo canlı hayvan görüntülemeile birleştirir.

Kuyruk Ven Metastaz Tahlilleri ve Gerçek Zamanlı Vivo Görüntüleme Kombine Kullanımı Meme Kanseri Metastatik Kolonizasyon ve Yük Akciğerlerde Quantify için

Kanser hücrelerinin intravenöz enjeksiyonu genellikle metastaz araştırmalarında kullanılır, ancak metastatik tümör yükünü analiz etmek zor olabilir. Burada, metastazın kuyruk damarı enjeksiyon modelini gösteriyoruz ve ortaya çıkan metastatik akciğer tümörü yükünü analiz etmek için yeni bir yaklaşım içeriyoruz.

Tümör Hücrelerinin Lateral Kuyruk-Damar Enjeksiyonu Sonrasında Akciğer Metastazının Patolojik Analizi

Biz Fiji-ImageJ kullanarak 4T1 meme kanseri modelinde akciğer metastazı ölçmek için daha tutarlı ve hızlı bir yöntem açıklar.

4T1 Meme Kanseri Modelinde Akciğer Metastazının Nicelleştirilmesini Geliştirmek Için Bilgisayar Tabanlı Görüntü Analizinin Kullanılması

El yazması, ortotopik olarak enjekte edilen meme tümörlerinden spontan akciğer metastazının kurulması ve uzunlamasına büyüme izlemesi için metastatik kaskadının tüm aşamalarında müdahaleye uygun bir metodolojiyi açıklamaktadır.

In vivo (İn canlı) Ortotopik Olarak Enjekte Edilen Meme Tümörü Hücrelerinin Spontan Akciğer Metastazını Ölçmek için Görüntüleme

Öğrenin, fare meme tümör modellerinde akciğer metastazını kantitatif gerçek zamanlı PCR ile değerlendirme yöntemini. Bu teknik, tümör hücrelerine özgü mRNA'yı hassas bir şekilde tespit ederek metastaz düzeyini nicel olarak ölçer ve kanser ilerlemesinin anlaşılmasına katkı sağlar.

Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile fare meme tümör modellerinde akciğer metastazı Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet