Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile fare meme tümör modellerinde akciğer metastazı Değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, metastazı analiz etmek için bir yöntem olarak akciğerdeki tümör hücrelerinden spesifik bir MRNA'nın miktarını tespit etmektir. Bu tekniğin temel avantajı, metastazın kantitatif bir ölçüsü olmasıdır. Bir akciğer tümörü diseksiyonu yapmak için, metin protokolüne göre öldürücü dozda izoflorin kullanarak bir fareye ötenazi yaptıktan sonra, fareyi uzuvları yayılmış olarak sırt üstü bir köpük tahtaya yerleştirin ve tahtaya sabitlemek için diseksiyon pimleri kullanın.

Fareyi püskürtmek için etanol kullandıktan sonra, hayvanın alt kısmını merkezden kavramak için forseps kullanın ve makasla, farenin periton boşluğunu delmemeye dikkat ederek deriden boynuna doğru yukarı doğru kesin. Şimdi, hayvanın alt ucundaki karın zarını kavrayın ve boynun tabanına doğru yukarı doğru kesmeye başlayın. Göğüs kafesinin sol ve sağ taraflarını dikkatlice kesin ve göğüs boşluğuna kanayabilecek kan damarlarını kesmemeye dikkat edin.

Göğüs kafesinin diyaframından ve üst kısımlarından sola ve sağa keserek kaburga kemiklerini çıkarın. Daha sonra, forseps kullanarak, farenin trakeasını kavrayın ve öne doğru çekin ve akciğerleri fareden çıkarmadan önce trakeayı kesmek için diseksiyon makası kullanın. Akciğer dokusunu nazikçe yıkamak için PBS kullanın.

Daha sonra, akciğer dokusunun metin protokolüne göre brüt değerlendirmesinden sonra, akciğerler hemen analiz edilecekse, RNA izolasyonuna geçin. RNA'yı dokudan izole etmek için, metin protokolünde listelenen yöntemlerden birini kullanarak dokuyu homojenize ederek başlayın. Bir RNA izolasyon kitinden lizis tamponu hazırlayın ve her mililitre lizis tamponuna 20 mikrolitre tümör kaptoetanol ekleyin.

300 mikrolitre lizis tamponunda her 30 gram dokuyu yeniden askıya alın ve% 30 genliğe ayarlanmış bir sonikatör ile dokuyu 10 saniye boyunca sonikleştirin. 590 mikrolitre TE tamponuna 10 mikrolitre protinaz K ekleyin ve 300 mikrolitre sonikasyonlu dokuya 600 mikrolitre tampon ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Daha sonra, kalıntıları gidermek için numuneleri 10 dakika boyunca 13.000 kez G'ye eşit veya daha büyük bir sıcaklıkta santrifüjleyin. Ardından süpernatanı yeni tüplere aktarın. RNA'yı çökeltmek için her 900 mikrolitre süpernatanıma 450 mikrolitre etanol ekleyin.

Daha sonra 700 mikrolitre lizat etanol karışımını bir RNA kolonuna aktarın. RNA'yı kolona bağlamak için bir dakika boyunca 13.000 kez G'ye eşit veya daha büyük bir sıcaklıkta tekrar döndürün. Ardından sıvı atığı atın ve kalan süpernatanı sütuna ekleyin ve tekrar döndürün.

Daha sonra, kolonun üst kısmına 350 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve numuneleri 30 saniye santrifüjleyin. Sıvı atıkları atın ve tüpteki sütunu değiştirin. Her numune için beş birim DNase, bir enzimi beş mikrolitre 10X DNaz tamponu ve 40 mikrolitre DNaz RNaz içermeyen su ile karıştırarak DNase hazırlayın.

Her sütuna 50 mikrolitre DNase karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Daha sonra 350 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin, bir tanesini sütunlara yerleştirin ve numuneleri 30 saniye boyunca santrifüjleyin. Atık çözeltiyi attıktan sonra, 600 mikrolitre yıkama tamponu iki ekleyin ve 30 saniye daha döndürün.

250 mikrolitre yıkama tamponu iki eklemeden önce sıvıyı atın ve ardından iki dakika döndürün. Kolonu yeni bir toplama tüpüne aktarın ve kolona 50 ila 100 mikrolitre RNase DNaz içermeyen su ekleyin. Bir dakika kuluçkaya yatırdıktan sonra bir dakika döndürün.

RNA verimini artırmak için toplanan elüatı kolondan yeniden geçirin. Hemen kullanım için numuneleri buz üzerinde tutun. Daha sonra kullanmak için kuru buz veya sıvı nitrojen üzerinde dondurun ve ihtiyaç duyulana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Bir spektrofotometre kullanarak RNA'yı ölçün. Daha sonra, steril RNase DNaz içermeyen PCR tüplerinde veya plakalarında, bu tabloda gösterildiği gibi ilk transsentez için reaksiyon karışımını hazırlamak için 0.5 ila 2 mikrogram toplam RNA kullanın. Burada gösterilen programı kullanarak standart bir PCR makinesini karıştırın ve nazikçe santrifüjleyin ve programlayın.

Reaksiyon tamamlandığında, bitmiş reaksiyonu istenen hacme seyreltmek için steril, nükleaz içermeyen su kullanın. Gerçek zamanlı PCR gerçekleştirmek için, beş standart oluşturmak üzere C DNA'sının bir ila dört seri dilüsyonunu hazırlayarak her primer seti için standart bir eğri oluşturmak üzere insan HER2 gibi pozitif bir kontrol C DNA'sı kullanın. Ardından, standart eğriyi ve deneysel örnekleri içermesi gereken toplam örnek sayısını hesaplayın.

Daha sonra, steril RNase DNaz serbest tüplerde, ilgilenilen her deneysel gen için bir ana karışım ve ayrıca gapdh gibi bir iç kontrol hazırlayın. Her standart veya deneysel numune için bir mikrolitre C DNaz içeren bir test plakası hazırlayın. Her primer probu için oyuk başına en az bir C DNA örneği tahsis edin.

Her astar probu için oyuk başına 19 mikrolitre mastermix ekleyin. Bu biyolüminesans deneyi, boşluk bağlantı proteini Connexin 43'ü hedef alan ACT1 ile tedavi edilen fare akciğerlerinin, dokuda tümör hücrelerinin yokluğunu düşündüren lusiferaz aktivitesi için negatif göründüğünü göstermektedir. Bununla birlikte, akciğer dokusunun H&E bölümlerinin analizi, lusiferaz tarafından aydınlatılmayan mikrometastazları gösterir, bu da lusiferaz görüntülemenin düşük sayıda tümör hücresini tespit etmek için yeterince hassas olmadığını düşündürür.

Burada, orijinal olarak fare hafıza yağ pedine nakledilen hücrelerden akciğer dokusundaki insan HER2 artı JIMT1 tümör hücrelerini tespit etmek için HER2'ye özgü bir prob kullanan bir qRT-PCR deneyinin sonuçları gösterilmektedir. Akciğerlerin hiçbirinde büyük ölçüde görünür metastaz gözlenmemesine rağmen, 11 örneğin ikisinde qRT-PCR metastaz tespit etti. Bu şekilde, bir hücre sayısı serisinde fare akciğer boşluğuna normalize edilen nispi HER2 seviyelerini belirlemek için standart bir eğri analizi hazırlanmıştır.

Sonuçlar, HER2 probunu kullanan qRT-PCR'nin, 10 hücreye kadar HER2 seviyelerini tespit edecek kadar hassas olduğunu göstermektedir. Son olarak, bu regresyon analizi, pozitif ve negatif kontroller dahil olmak üzere her akciğer örneğindeki nispi hücre sayısını gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa altı ila sekiz saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, RNA izolasyonu ve ters transkriptaz reaksiyonu sırasında RNA bütünlüğünü korumak için önlem almayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, kantitatif gerçek zamanlı PCR ile tüm akciğer dokusundaki metastazı nasıl tespit edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.