2.9: İndüklenmiş Pluripotentens

İndüklenmiş pluripotent kök hücreler, insan embriyonik kök hücreleri gibi, vücuttaki hemen hemen her hücreye farklılaşabilir ve bu nedenle rejeneratif tıp alanında büyük umut vaat eder.

İnsan embriyonik kök hücreleri veya hESC'ler, implantasyon öncesi embriyolardan elde edilirken, tamamen farklılaşmış somatik hücreler, iPSC'ler olarak da adlandırılan indüklenmiş pluripotent kök hücreleri üretmek için kullanılır.

Bu videoda, iPSC'lerin oluşturulmasının ardındaki temel ilkeler, farklılaşmış hücrelerde pluripotentliği indüklemek için adım adım bir protokol ve bu protokolün birçok alt uygulaması ve modifikasyonu hakkında bilgi edineceksiniz.

Somatik hücre tiplerinden iPSC'lerin üretilmesinin ardındaki ilkeleri tartışarak başlayalım.

Deri hücreleri veya nöronlar gibi farklılaşmış hücreler, kaderine karar verilen hücrelerdir. Belirli bir işlevi yerine getirmeyi taahhüt ederler. Öte yandan, pluripotent kök hücreler, kaderi kararlaştırılmamış olanlardır ve herhangi bir hücre tipine farklılaşabilirler.

Zaten farklılaşmış bir hücrenin kimliğini pluripotent bir duruma değiştirme sürecine hücresel yeniden programlama denir. Bu, hücredeki gen ekspresyon modelinin değiştirilmesini içerir, çünkü bir hücre tarafından üretilen proteinlerin sayısı ve türleri, bir hücrenin kimliğini tanımlamada önemli bir rol oynar.

Hücresel yeniden programlamayı indüklemenin yollarından biri, belirli transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunu indüklemektir. Transkripsiyon faktörleri, bir gen içindeki düzenleyici dizilere bağlanan proteinlerdir. Bu dizilerin bazılarına "promotörler" denir ve bu nedenle bir genin transkripsiyonunu teşvik eder. Birkaç transkripsiyon faktörü, hücre kimliği üzerinde büyük bir etkiye sahip olan çok sayıda genin ekspresyonunu etkileyebilir.

Pluripotentliği indüklediği gösterilen dört klasik transkripsiyon faktörü Oct4, Sox2, cMyc ve Klf4'tür. Bu faktörler, yeniden programlama etkilerini keşfeden araştırmacıdan sonra Yamanaka faktörleri olarak da bilinir.

Bu transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunu indüklemek için birden fazla yöntem kullanılabilir. En yaygın ve etkili yöntem, transkripsiyon faktörü genlerini genoma entegre olacakları çekirdeğe iletmek için modifiye edilmiş bir virüsün kullanılmasıdır.

Bu yöntemde, dört Yamanaka faktörünü kodlayan genler, farklı retrovirüslere ayrı ayrı paketlenir ve farklılaşmış hücrelere eklenir. Hücreler modifiye edilmiş virüslere maruz kaldığında, farklılaşmış hücrelerin küçük bir kısmı dört transkripsiyon faktörü taşıyan virüsün tümü ile enfekte olur. Büyük küresel pluripotent kök hücre kümeleri oluşana kadar farklılaşmaya başlarlar. Küme oluşumu, iPSC'lerin in vivo kök hücrelere benzer bir mikro ortam oluşturmasına yardımcı olur ve bu nedenle pluripotentliklerini korumalarına yardımcı olur.

Artık iPSC'lerin üretilmesinin arkasındaki temel ilkeleri anladığınıza göre, bir viral transdüksiyon sistemi kullanarak fare embriyonik fibroblastlarında veya MEF'lerde pluripotentliği indüklemek için genel bir protokol gözden geçirelim.

Bu prosedüre başlamadan önce, virüslerin vücudunuzdaki hücreleri enfekte edebileceğini unutmayın, bu nedenle güvenlik yönergelerine uymak son derece önemlidir.

Transfeksiyon işlemine başlamak için, kültür ortamı yüksek yoğunluklu MEF içeren bir plakadan çıkarılır ve hücreler tampon çözeltisi ile yıkanır. Daha sonra, hücreleri yemeğin dibinden kaldırmak için tripsin gibi protein parçalayıcı bir enzim içeren bir çözelti eklenir. Kültür ortamı daha sonra plakaya eklenir ve ayrılan hücreler bir santrifüj tüpüne aktarılır.

Santrifüjlemeyi takiben, pelet kültür ortamında yeniden süspanse edilir. Daha sonra, hücreler sayılır ve konsantrasyon, ertesi gün optimal sayıda hücrenin virüsle enfekte olabilmesi için ayarlanır. Hücreleri gece boyunca inkübe edin.

Hücreler yeni yemeklerine yerleştikten sonra, eski ortamlar taze ortamlarla değiştirilir ve istenen transkripsiyon faktörlerini içeren mühendislik virüsleri plakaya eklenir. Hücreler daha sonra enfeksiyonun gerçekleşmesine izin vermek için yeterli süre boyunca virüslerle birlikte inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, serbest virüsleri içeren besiyeri çıkarılır ve taze embriyonik kök hücre besiyeri ile değiştirilir.

Transformasyonu takip eden 2-3 hafta boyunca, hücreler bir inkübatörde 37 ° C'de büyütülmeli ve kültür ortamı günlük olarak değiştirilmelidir.

Bu süreden sonra, embriyonik kök hücre kolonilerine benzeyen iPSC kolonileri, toplanabilecek kadar büyük hale gelmelidir. Koloniler, uygun büyüme faktörlerine sahip besiyeri içeren taze bir plakaya aktarılabilir ve daha da büyümesine izin verilebilir. Pluripotentliği doğrulamak için, hücre popülasyonunun bir kısmı pluripotents belirteçleri ile boyanır.

Artık farklılaşmış hücrelerden iPSC'lerin nasıl oluşturulacağını gördüğünüze göre, bu son derece kullanışlı yöntemin bazı aşağı akış uygulamalarına ve modifikasyonlarına bakalım.

iPSC'lerin önemli bir özelliği, vücuttaki hemen hemen her hücreyi üretmek için kullanılabilmeleridir. Bu örnek, iPSC'lerden kardiyomiyosit adı verilen kalp kası hücrelerinin oluşumunu göstermektedir. Bunu yapmak için, iPSC'ler, pluripotent kök hücrelerin agregaları olan embriyoid cisimler oluşturmalarına izin veren yapışmayan plakalara aktarılır. Embriyoid cisimler, kardiyak farklılaşmayı artıran serum ve askorbik asit içeren özel ortamda kültürlenir. Başarılı farklılaşma, bazı hücreler atmaya başladığında kolayca gözlemlenebilir.

iPSC'ler potansiyel olarak herhangi bir hücre tipine farklılaşabildiğinden, bir fare gibi bütün bir organizmayı da oluşturabilirler. Bu, tetraploid tamamlama adı verilen bir test kullanılarak yapılabilir. İlk olarak, dört set kromozom içeren bir embriyo olan bir tetraploid embriyo, erken bir embriyonun iki hücresinin bir elektrik alanı kullanılarak birbirine kaynaştırılmasıyla oluşturulur. Tetraploid embriyonun blastosist aşamasına kadar gelişmesine izin verilir. iPSC'ler daha sonra blastosiste enjekte edilir ve daha sonra gebelik için bir alıcı dişiye nakledilir. Tetraploid hücreler sadece plasenta gibi ekstraembriyonik yapılar oluşturabilir, bu nedenle bu yöntemden kaynaklanan hayvanlar tamamen iPSC'lerden türetilir.

Bazı araştırmacılar, başarıyla yeniden programlanmış hücreleri tanımlama sürecini daha verimli hale getirmek için yeniden programlama prosedürünü değiştirir. Örneğin, bu deneyde, Oct4 promotörün etkisi altında yeşil floresan proteini eksprese etme yeteneğine sahip MEF'ler, araştırmacıların pluripotentlik kazanmış hücreleri kolayca tanımlamalarına yardımcı oldu.

Az önce JoVE'nin indüklenmiş pluripotent kök hücreler üretme hakkındaki videosunu izlediniz. Bu videoda, bu prosedürün arkasındaki ilkeler ve farklılaşmış hücrelerden iPSC'ler oluşturmak için adım adım bir protokol gözden geçirildi. Ayrıca bu yöntemin laboratuvar içi deneyler için nasıl uygulanabileceğini veya değiştirilebileceğini de gözden geçirdik.

iPSC'lerin keşfi, dejeneratif bozuklukları tedavi etmek için kullanılabilecek tedaviler geliştirmek için muazzam bir potansiyele sahip olduğundan, kök hücre biyolojisi alanında büyük bir etkiye sahip olmuştur. iPSC'lerle çok ilerleme kaydedilmiş olmasına rağmen, hala aşılması gereken engel ilişkili kanser riskidir. Mevcut yeniden programlama prosedürleri, kanserle sonuçlanabilecek düzensiz hücre büyümesine neden olma potansiyeline sahiptir. Bu nedenle, iPSC'leri klinik olarak kullanmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!