Name: Subselüler Ca Floresans ve Biyoparlaklık Görüntüleme 2+ Yaşlı Hipokampal Nöronlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: Keşfedin yaşlanan beyinde kalsiyum yeniden yapılanmasını, sitozolik ve mitokondriyal Ca²⁺ görüntüleme ile sıçan hipokampal nöronlarında. Bu yöntem eksitotoksisite ve nöron hasarı mekanizmalarını anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ministerio de Economìa y competitividad (BFU2012-37146) ve Junta de Castilla y Leòn (BIO103/VA45/11, VA145U13 ve BIO/VA33/13), İspanya tarafından desteklenmiştir. MCR, Junta de Castilla y Leòn (İspanya) ve Avrupa Sosyal Fonu tarafından desteklendi. Merhum Dr. Philippe Brûlet'e (1947-2013) mitokondriyal GFP Aequorin plazmidi için teşekkür ederiz.

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürler Avrupa Sözleşmesi 123 / Avrupa Konseyi ve Direktifi 86/609 / EEC sayılı ile anlaşarak Valladolid Üniversitesi hayvan barınağı tesisi tarafından onaylanan protokoller çerçevesinde ele alınmıştır. Sıçan Hipokampal Nöronlar 1. Kısa ve Uzun Vadeli Kültürü <ol><li> Poli-D-lisin hazırlanması, 12 mm cam lamelleri kaplama. <ol><li> En az 24 saat süre ile etanol içinde 12 mm çapında bir cam lamelleri sterilize edin. Bunları steril koşullar altında kurumaya bırakın. </li><li> Petri kabındaki parafilm şeridi lamelleri dağıtın. 1 mg / ml poli-D-lisin 200 ul her bir lamel yüzeyi kapatılır. O / N tedavi izin verin. </li><li> Ertesi gün, steril koşullar altında 90 dakika boyunca iki kez damıtılmış, steril su ile her 15 dakikada bir lamelleri yıkayın. </li><li> Neurobasal Kültür Ortamı 500 ul ile dört sıra çok kaplı plaka Dolgu ile sabitleştirilir. Neurobasal Kültür Ortamı ile takviye edilmelidir% 10 fetal bovin serumu,% 2 B27, 1 ug / ml gentamisin ve 2 mM L-glutamin. </li><li> Çok kaplı plaka lamelleri yerleştirin. Kullanılana kadar nemlendirilmiş 37 ° C ve% 5 CO2 inkübatör koruyun. </li></ol></li><li> Yenidoğan sıçanlarda hipokampal nöronlar izolasyonu. <ol><li> Steril koşullar altında, bir şişeye (20 ul / ml) içinde 1,8 ml papain çözeltisi (şirketinden satın alınmış) hazırlayın: 20 ul&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek için / 1.8 mi Hank artı% 0.6 BSA içinde 40 ul papain ilave ml (ul hesaplanmalıdır ) satıcılar koşullarına bağlı olarak değişebilir. Hank% 0.6 BSA% 4 sığır serumu albümini 15 ml HBSS ortamı 85 ml karıştırılması ile hazırlanır (BSA, 100 mi HBSS içinde BSA 4 g çözme hazırlanır). Steril bir kaput içinde hazırlayın. </li><li> Kullanımdan önce 37 ° C &#39;de 30 dakika boyunca Hank artı% 0.6 BSA içinde papain inkübe edin. Kullanım öncesi 0,22 um filtre kullanılarak çözelti filtre. </li><li> Dulbecco&#39;nun ekleyerek Ham F-12 ortamı hazırlamakIki kez damıtılmış steril su içinde 900 ml Eagle Ortamı tozu (L başına 13.5 g) modifiye edilmiştir. Sonra 6 gr HEPES ve 336 mg NaHCO 3 ekleyebilir ve NaOH 4 N. 1 L çözelti elde ve 0.20 mikron polietersülfon kullanarak filtrelemek için steril su ekleyin kullanarak 7.42 pH ayarlamak (PES) üst filtreyi şişe. Bir steril bir muhafaza içinde bu işlemi uygulayın. Sonunda Kullanmadan önce steril koşullar altında CO 2 ile çözüm doyurabilecek. Mağaza çözümleri 4 ºC de ve onları soğutulmuş kullanın. </li><li> Dekapitasyon yenidoğan (P0) fare yavrular Euthanize ve steril HBS orta kafa yıkayın. Steril makas yardımı ile kafatası açın. Bir spatula ile beyin ekstrakte edin ve Ham F-12 ortamı içinde hızlı bir şekilde yıkayın. </li><li> Her yarımkürede (Şekil 1B) bir neşter yardımıyla bir çapraz kesim yapın ve Ham F-12 orta içeren Petri taşımak. </li><li> Diseksiyon forseps yardımıyla ve büyüteç altında dikkatlice atın meninksler. </li> &lt;li&gt; büyüteç kullanarak korteks üzerinde karakteristik bir içbükey konumda hipokampus tanımlayın. Sonra bir sınır dikkatlice çekerek ve göz makas kullanarak konumundan kaldırarak korteksten hipokampus ayırın. </li><li> Steril Hank ortamında Ca + 2 ve Mg yoksun 2+ artı% 0.6 BSA ile doldurulmuş bir 4-iyi levhaya hipokampal doku transferi ve hipokampal doku yıkayın. Çıkarmadan medya aynı göz makas kullanarak küçük parçalar halinde doku (2 x 2 civarında mm) kesti. </li><li> 1,8 ml önceden süzüldü papain çözeltisi ihtiva eden bir şişeye hipokampal parçaları aktarın. Sonra sıra, hafifçe çalkalanarak 37 ºC&#39;de inkübe. 15 dakika sonra, (nihai 50 ng / ml), DNase I çözeltisinin 90 ul ve 15 dk daha inkübe edilir. </li><li> 10 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne doku aktarın ve taze Neurobasal Kültür Ortamı ile fragmanları yıkayın. 5 ml&#39;lik plastik pip ile doku parçaları geçirerek hücre süspansiyonu eldeette. </li><li> 5 dakika boyunca 160 x g&#39;de santrifüjleyin hücre süspansiyonu. Bir plastik steril Pasteur pipeti kullanarak Süpernatantı ve Neurobasal Kültür Orta 1 ml pipet otomatik bir 1 ml dikkatlice pelet askıya. </li><li> Bir Neubauer sayım odasını kullanarak hücre yoğunluğu ölçün. Neubauer odasına üzerine cam lamel koyun. Hücre süspansiyonu 10 ul ekle. Hücre süspansiyonu homojen ve hiçbir kabarcıklar yapma odasına girer emin olun. Mikroskop altında hücrelerin sayısını ve 30 x 10 3 hücre içeren 40-80 ul uygun bir damla elde etmek için gelen hesaplamaları gerçekleştirmek. Toplam hücre sayısı, kullanılan hayvanların sayısına bağlı olacaktır. </li></ol></li><li> Kısa ve sıçan hipokampal nöronlarının uzun dönemli kültür. <ol><li> Her bir ila yaklaşık 50 ul arasında bir damla yaklaşık 30 x 10 3 hücreleri Neurobasal Kültür Ortamı 500 ul ihtiva eden dört oyuklu çok kaplı plaka üzerinde önce hazırlanan ve inkübatör plaka muhafazade bir poli-D-lizin kaplı 12 mm çapında bir cam lamel ihtiva eden çok kaplı plaka. </li><li> Kültür değiştirmeden deneylerde önce in vitro 2-5 gün (DIV, kısa vadeli, genç kültürler) ya da&gt; 15 DIV (Uzun vadeli, yaşlı kültürler) için nemlendirilmiş 37 ºC ve% 5 CO2 inkübatör primer hipokampal hücreleri korumak Ortam. </li></ol></li></ol> Sitosolik Ca 2. Floresans Görüntüleme 2+ Konsantrasyon <ol><li> Floresan görüntüleme test çözümleri hazırlanması. <ol><li> NaCl 145, KCI 5, MgCl2 1, CaCl2 1, glükoz 10, sodyum HEPES, 10 (pH 7.42): mM ihtiva eden bir dış HEPES-tamponlu tuzlu su (HBA) çözeltisi hazırlayın. </li><li> NaCl 146, KCI 5, glükoz CaCl 2 1, 10 ve 10 HEPES (pH 7.42): mM ihtiva eden bir dış, Mg2 + içermeyen, HEPES-tamponlu tuzlu su (HBA) çözeltisi hazırlayın. </li><li> Bir Fina NMDA Mg2 +, -ücretsiz olarak, HEPES-tamponlu salin (HBA) çözme100 mcM l konsantrasyonu ve 10 mcM glisin ile tamamlar. </li><li> (MM olarak) çözerek yerine NaCl KCI ihtiva eden bir HBS çözeltisi hazırlayın: KCI 145, MgCl2 1, CaCl2 1, 10 ve 10 HEPES (pH 7.42) glikoz. </li></ol></li><li> Floresan kalsiyum prob fura2 / AM ile hipokampal hücre yükleme. <ol><li> Inkübatör kapalı lamelleri içeren hücre kültürü alın ve 500 HBS ul başına iyi içeren yeni bir dört iyi çok kaplı plaka aktararak RT&#39;de HBS ortamı ile yıkayın. </li><li> Fura2 kuluçkaya bırakılır / karanlık bir yerde, oda sıcaklığında (25 ° C) sıcaklıkta 60 dakika boyunca (aynı HBA ortam içinde hazırlandı) AM 4 uM. </li><li> 60 dakika sonra, taze HBS orta lamelleri yıkayın. </li></ol></li><li> Sitozolik kaydedilmesi floresan görüntüleri [Ca 2 +] kültürlü hücrelerde. <ol><li> Lamba, mikroskop, perfüzyon sistemi, floresan kamera ve bilgisayarı açın. </li><li> Bir termostatlı bir platformda lamelleriters mikroskop sahnede açık 12 mm cam lamelleri ve 40X objektif (1.3 yağ, NA) kullanarak mikroskobik alanı seçin. Ya da yokluğunda test maddelerinin mevcudiyetinde (37 ° C) önceden ısıtılmış HBS ortamı ile sürekli hücreleri serpmek. / Dakika yaklaşık 5-10 ml bir oranda akış muhafaza edin. Not: canlı hücreler için hücre perfüzyon Sistem, açık 12 mm cam lamelleri için termostatlı bir platform içine monte edilir. Bir valf kontrol cihazı ile donatılmış 8 hatları yerçekimi ile çalışan bir perfüzyon sistemi çözümleri serpmek için kullanılır. Bir vakum pompası herhangi bir aşırı yayıcıyı çıkarmak için sorumludur. Solutions içinde boru ısıtma sistemi kullanılarak ısıtılır. </li><li> Deklanşör hem uyarma dalga boylarında kapalı bir arka plan görüntüsü yakalama. </li><li> 340 ve 380 nm dönüşümlü hücreler Epi-aydınlatır. Tutanak ışığı 520 nm bir fura-2 dikroik ayna tarafından süzülür bir floresan kamera, her 5-10 sn yayılan. </li><li> Kayıt süresi bittiğinde, tam sekans o saklamakf görüntüleri daha fazla analiz için bilgisayara 520 nm&#39;de yayılan. </li></ol></li><li> Kaydedilen floresan görüntü analizi. <ol><li> Deney dosyasını açın. AQUACOSMOS yazılımı kullanarak, &#39;Oranı&#39; üzerine tıklayın ve istediğiniz oran aralığını seçin. Oranı görüntü bir dizi elde etmek için elde edilen görüntüler olarak piksel oranı piksel hesaplayın. </li><li> &#39;Arka plan eleme&#39; ayarlayarak arka plan çıkarın. Basın &#39;başlangıç ​​hesabı&#39;. </li><li> Basın &#39;her zaman dizisi&#39; düğmesi ve ilgi antik bölgeleri silmek (ROI). Tek tek hücrelerin kantitatif analiz için, bireysel nöronlar karşılık gelen faiz veya İB&#39;nin yeni bölgeleri kurmak. Her ROI ve her görüntüye karşılık gelen her bir piksel ortalama tüm oran değerleri, bireysel ROI (hücreler) için bu oran floresan değerleri bir kayıt elde etmek. </li><li> Bir grafik progr her ROI karşılık gelen oran floresan değerlerini ihraç bireysel kayıtları grafiğini içinduyuyorum. </li><li> Uygun bir veri analizi kullanılarak her bir uyarıya cevap olarak oran floresanın artışların büyüklüğü tahmin edilmesi ve yazılımı grafik için ilgili hesaplamalar sağlayın. </li></ol></li></ol> Mitokondriyal Ca 3. Biyoparlaklık Görüntüleme 2+ Konsantrasyon <ol><li> MitGAmut plazmid ile kültürlenmiş hipokampal nöronlar transfeksiyonu. NOT: Hücreler ilk olarak mitokondri hedefli sekans ve yeşil flüoresan proteini (GFP) kaynaşmış bir Ca2 + bağlama sahası eksik mutasyona uğramış Aequorini içeren mitGAmut plazmid ile transfekte edilir. Bu yapı, mitokondriyal Ca 2 + alımı büyük artışlar algılar ve GFP floresan ile transfekte edilmiş hücrelerin tanımlanmasına izin verir. Plazmid geliştirilmiş ve nazik P. brulet ve birlikte çalışanlar 18 (CNRS, Paris, Fransa) tarafından temin edildi. <ol><li> Cenin sığır serumu eksik Neurobasal kültür vasatı içeren, Neurobasal TF Hazırlama, B27, gentamicve 2 mM L-glutamin. </li><li> Neurobasal TF 50 ul artı bir viyal (Çözelti A) 2.5 ul transfeksiyon reaktifi hazırlayın. 50 Neurobasal TF ul artı 4 ug bir şişe içinde mitGAmut plazmid (Çözelti B) hazırlayın. Sallayarak olmadan 20 dakika boyunca karıştırma izin çözüm A. üzerinde hafifçe çözüm B ekleyin. </li><li> Taze Neurobasal TF 200 ul içeren yeni çok kaplı plakalara hipokampal nöron içeren lamelleri aktarın. </li><li> Her lamel üzerinde damla çözüm A + B 100 ul damla ekleyin. 30 dakika boyunca çalkalayarak kuluçkalayın. Orta çıkarın. Taze Neurobasal TF hücrelerin bir kez yıkayın. Orijinal Neurobasal Kültür Orta lamelleri dönün. </li><li> 37 ° C ve% 5 transfeksiyonundan sonra CO2 seviyesinde ilave bir 24 saat boyunca kültür nöronları etkin ekspresyonu ve probun hedef izin vermek. </li></ol></li><li> Biyoparlaklık görüntüleme için deney çözeltilerinin hazırlanması. <ol><li> Olarak NMDA 100 uM ya da 145 mM KCI içeren HBS çözümler hazırlayınYukarıda (2.1 Adım). 10 mM Ca içeren 2+ artı 100 mcM digitonin HBS çözeltisi hazırlayın. </li></ol></li><li> Coelenterazine n mitokondri hedefli aequorin Sulandırma. <ol><li> HBS 200 ul ihtiva eden bir dört plaka transfekte hipokampal nöronlar içeren transfer lamelleri. </li><li> 4 uM&#39;lik bir son konsantrasyon elde boyunca HBS&#39;de 200 ul coelenterazine n (200 uM) 4 ul ekleyin ve yavaşça karıştırın. RT (25 ° C), 2 saat boyunca karanlıkta inkübe edin. </li></ol></li><li> Mitokondriyal kaydedilmesi biyolüminesans görüntüleri [Ca 2 +]. <ol><li> Mikroskop, lamba, perfüzyon sistemi, biyolüminesans kamera ve bilgisayarı açın. </li><li> Termostatlı bir (37 ° C) perfüzyon odasına yeniden lamelleri aktarın ve 5-10 ml / dk&#39;lık bir oranda önceden ısıtılmış HBS çözeltisi ile sürekli olarak serpmek. </li><li> 40X objektif (yağ, NA: 1.3) kullanılarak, a ifade hücreleri içeren mikroskobik alan seçinFITC filtreleri kullanarak yeşil flüoresan proteini (GFP) ekspresyonu ile bağlantılı bir floresan emisyonu ile gösterildiği gibi poaequorins. Tipik bir alanı 1-2 transfekte edilmiş hücreleri içerebilir. Bir CCD kamera kullanarak, GFP floresan görüntü yakalamak. </li><li> Mikroskop ışığı kapatın. Işık yolunda bulunan dichroic içeren kutu çıkarın. Uyarma ışık kapatın ve tam karanlık koyu-kutusunu kapatın. </li><li> Ya da test solüsyonları 37 ° C&#39;de önceden ısıtılmış olmayan HBS ortamı ile 5-10 ml / dakika hücreleri serpmek. </li><li> Fotonik emisyon görüntüleri bir görüntü işlemcisi ile ele bir foton sayma makinesi ile her 10 saniyede yakalayın. </li><li> Her bir deneyin sonunda, kalan tüm foton emisyon serbest bırakmak için HBS&#39;de 10 mM digitonin 0.1 mM CaCl2 ile hücreleri geçirgenliği. Not: Bu fotonik emisyonlar toplam fotonik emisyonları, Ca 2 + konsantrasyonlarda kalibrasyon için gerekli bir değerini tahmin etmek için yukarı eklenmelidir &lt;./ li&gt; <li> GFP ilişkili floresan görüntü ile bilgisayarda saklayın biyolüminesans görüntüleri foton sayma görüntüleme önce ele geçirdi. </li></ol></li><li> Mitokondriyal [Ca2 +] yansıtan biyoışıldama görüntülerin analizi. <ol><li> Özel bir yazılım kullanılarak fotonik emisyonları ölçmek. Fotonik emisyon mitokondriyal serbest Ca dönüştürülebilir 2 + konsantrasyonu ([Ca2 +] mit) Brini ve ark., 15 tarafından tarif edilen algoritmasını kullanarak yapar. </li><li> Deney ve GFP floresan görüntüyü açın. Deneyin başında çekilen floresan görüntülerine göre transfekte hücrelerin şekli çizerek özel yazılım yardımı ile ilgi (ROI) Seç bölgeleri. </li><li> Her görüntü aynı ROI yapıştırın. Her ROI toplam fotonik emisyonları zaman içinde her noktada her hücre için parlaklık emisyon değeri (L) elde etmek için özel bir yazılım ile hesaplanır. </li><li> Tüm fotonik emiss ekleyinTüm fotonik emisyonları içeren bir biyoışıldama görüntü elde etmek, özel bir yazılım kullanarak, permeabilization digitonin sonra elde edilenler dahil biyoışıldama görüntüleri, iyonlar. </li><li> Hesaplamalar için belirli bir yazılıma ilgi her bölge için fotonik emisyonların ihracat değerleri. Bunu yapmak için, her zaman her ROI için biyoparlaklık değerlerini hesaplamak için &#39;Grafik&#39; üzerine tıklayın. &#39;Toplam değeri&#39; seçin ve &#39;tüm görüntüleri mevcut yatırım getirisini kullanın. Basın &#39;hesapla&#39;. Bir çalışma sayfasına &#39;txt.file&#39; ve ihracat verileri kaydetmek. Her ROI için, [Ca 2 +] mit aşağıdaki algoritmayı kullanılarak hesaplanır: [Ca2 +] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)]; burada, R = [L / (L toplam λ)] 1 / n L ilgi her bölgede ölçüm zamanında yayılan lüminesan olup. L toplamıdırÇevrede her bir bölgesi için ölçüm zamanında o anda dokusunda mevcut sayım eklenmesinden sonra kalan toplam lüminesans. λ, K TR K R ve n, değerleri aequorin kombinasyonuna bağlıdır (doğal tipte veya mutasyona uğramış) ile coelenterazin kullanılan (vahşi tip veya n tipi) sabitler yanı sıra kayıt sıcaklığı 16 bulunmaktadır. Burada kullanılan kombinasyon için 37 ºC&#39;de, (AEQ ve coelenterzine n mutasyona uğramış), aşağıdaki değerleri kullanılır: K R = 8.47 x 10 7, K TR = 165,6 x 10 3, n 1204 ve λ = 0.138 =. </li></ol></li><li> Uygun bir veri analizi kullanılarak her uyarıcıya yanıt olarak biyolüminesans artışların boyutunu tahmin ve yazılım grafik için ilgili hesaplamalar yapmak. </li></ol>

<ol><li>Sattler, R., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+glutamate+receptor-mediated+excitotoxic+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of glutamate receptor-mediated excitotoxic neuronal cell death.</a> Molecular Neurobiology. 24 (1-3), 107-129 (2001).</li>
<li>MacDermott, A. B., Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Smith, S. J., Barker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA-receptor+activation+increases+cytoplasmic+calcium+concentration+in+cultured+spinal+cord+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NMDA-receptor activation increases cytoplasmic calcium concentration in cultured spinal cord neurones.</a> Nature. 321 (6069), 519-522 (1986).</li>
<li>Choi, D. W., Maulucci-Gedde, M., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+neurotoxicity+in+cortical+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (2), 357-368 (1987).</li>
<li>Kure, S., Tominaga, T., Yoshimoto, T., Tada, K., Narisawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+triggers+internucleosomal+DNA+cleavage+in+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Glutamate triggers internucleosomal DNA cleavage in neuronal cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 39-45 (1991).</li>
<li>Calvo, M., Sanz-Blasco, S., Caballero, E., Villalobos, C., Nunez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+to+excitotoxicity+in+aged+hippocampal+cultures+and+neuroprotection+by+non-steroidal+anti-inflammatory+drugs%3A+role+of+mitochondrial+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Susceptibility to excitotoxicity in aged hippocampal cultures and neuroprotection by non-steroidal anti-inflammatory drugs: role of mitochondrial calcium.</a> Journal of Neurochemistry. 132 (4), 403-417 (2015).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+subunits+have+differential+roles+in+mediating+excitotoxic+neuronal+death+both+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor subunits have differential roles in mediating excitotoxic neuronal death both in vitro and in vivo.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (11), 2846-2857 (2007).</li>
<li>Zhou, M., Baudry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+NMDA+neurotoxicity+reflect+developmental+changes+in+subunit+composition+of+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in NMDA neurotoxicity reflect developmental changes in subunit composition of NMDA receptors.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2956-2963 (2006).</li>
<li>Brewer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+vulnerability+of+hippocampal+neurons+with+age+in+culture%3A+temporal+association+with+increases+in+NMDA+receptor+current%2C+NR2A+subunit+expression+and+recruitment+of+L-type+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Increased vulnerability of hippocampal neurons with age in culture: temporal association with increases in NMDA receptor current, NR2A subunit expression and recruitment of L-type calcium channels.</a> Brain Research. 1151, 20-31 (2007).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+remodelling+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling remodelling and disease.</a> Biochemical Society Transactions. 40 (2), 297-309 (2012).</li>
<li>Stout, A. K., Raphael, H. M., Kanterewicz, B. I., Klann, E., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-induced+neuron+death+requires+mitochondrial+calcium+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glutamate-induced neuron death requires mitochondrial calcium uptake.</a> Nature Neuroscience. 1 (5), 366-373 (1998).</li>
<li>Pivovarova, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+calcium+overload+in+a+subpopulation+of+mitochondria+triggers+delayed+death+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (24), 5611-5622 (2004).</li>
<li>Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Place+navigation+impaired+in+rats+with+hippocampal+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions.</a> Nature. 297 (5868), 681-683 (1982).</li>
<li>Geinisman, Y., Detoledo-Morrell, L., Morrell, F., Heller, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+markers+of+age-related+memory+dysfunction%3A+behavioral%2C+electrophysiological+and+morphological+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Hippocampal markers of age-related memory dysfunction: behavioral, electrophysiological and morphological perspectives.</a> Progress in Neurobiology. 45 (3), 223-252 (1995).</li>
<li>Sodero, A. O., Weissmann, C., Ledesma, M. D., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+stress+from+excitatory+neurotransmission+contributes+to+cholesterol+loss+in+hippocampal+neurons+aging+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Cellular stress from excitatory neurotransmission contributes to cholesterol loss in hippocampal neurons aging in vitro.</a> Neurobiology of Aging. 32 (6), 1043-1053 (2011).</li>
<li>Brini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfected+aequorin+in+the+measurement+of+cytosolic+Ca2%2B+concentration+%28%5BCa2%2B%5Dc%29.+A+critical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transfected aequorin in the measurement of cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]c). A critical evaluation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (17), 9896-9903 (1995).</li>
<li>Villalobos, C., Alonso, M. T., Garcìa-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+calcium+oscillations+inside+intracellular+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of calcium oscillations inside intracellular organelles.</a> Methods in Molecular Biology. 574, 203-214 (2009).</li>
<li>Villalobos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redistribution+of+Ca2%2B+among+cytosol+and+organella+during+stimulation+of+bovine+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells.</a> FASEB Journal. 16, 343-353 (2002).</li>
<li>Rogers, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+local+Ca2%2B+dynamics+with+genetically+encoded+bioluminescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters.</a> The European Journal of Neuroscience. 21 (3), 597-610 (2005).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), 1067(2009).</li>
</ol>

Yazarların hiçbirinin çatışan çıkarları veya çatışan çıkarları yoktur.

Yaşlanan beyinde hücre içi Ca 2+ yeniden şekillenmesi homeostasis bilişsel kaybı ile ilgili olmuştur, iskemik hasar, eksitotoksisite ve nörodejenerasyon yatkınlık artmıştır. In vitro bu hipotezi araştırmak için Ca 2+ görüntüleme prosedürleri mevcuttur. Ne yazık ki, eski hipokampal nöronlar uygulanabilir kültürleri güvenilir değildir. Son zamanlarda, bu gözlenmiştir olduğu sıçan hipokampal nöronlarının ROS birikimi lipofusin granüller, heterokromatik odaklar oluşumu, aktivasyon pJNK ve p53 ...

Eksitotoksisite NOS&#39;nin, iskemi gibi nörolojik akıntılar nöronal hasar ve hücre ölümüne neden olan en önemli mekanizmalardan biri olduğu ve Alzheimer hastalığı 1 gibi nörodejeneratif hastalıklarda. Nörotoksisite Bu tip ağırlıklı Ca glutamat oyunculuk aracılık 2+ -geçirgen, İyonotropik NMDA reseptörleri (NMDAR) 2. Glutamata kültürlenmiş nöronların nöronal apoptoz 4 neden eksitotoksisite 3, yol açabilir. Biz ve diğerleri daha önce NMDA kaynaklı apoptosise nöronal açığı in vitro gelişimi ve 5-8 yaşlanma değişebilir bildirmişlerdir. Bu yaygın sitosolik içermeyen Ca2 + konsantrasyonu ([Ca2 +] cyt) &#39;de bir artış hücrelerin aktivasyonuna yol açtığı kabul edilmektedir. Bu artış çok yüksek ve / veya yeterince sürekli olduğu, ancak hücre ölümünü 9 tetikleyebilir. Ayrıca, önerilmiştirbu eksitotoksisite mitokondriyal Ca2 + alımı 10, glutamat ile indüklenen hücre ölümü 11 karşı mitokondriyal uncoupler korunan nöronlarla nöronları tedavi yana gerektirir. Mitokondri Ca 2 + çok fazla alırsan, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözenek açılması sitokrom c ve diğer pro-apoptotik faktörlerin ve uyaran apoptoz serbest lider oluşabilir. Son zamanlarda bu mitokondriyal Ca 2 + alımı doğrudan doğruya tek bir hipokampal nöronlar 5 NMDA ile indüklenen Ca2 + mitokondriyal alımını bu makalede rapor bir yöntemi ölçülerek, nörotoksitisi yaşa bağlı duyarlılık ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Böyle öğrenme, hafıza ve diğer bilişsel süreçler 12 gibi fizyolojik süreçlerde yer hipokampus, yaşlanma ve nörodejeneratif hastalıkların 13 derece hassastır. Bu, in vitro olarak birkaç hafta sonra, ileri sürülmektedir, kültürlenmişhipokampal nöronlar yaşlı nöronlar 14 tipik özelliklerinden bir sayısını göstermektedir. Buna göre, uzun vadeli kültürlü hipokampal nöronlar yaşlanma gelişmiş eksitotoksisitenin Ca 2 + aracılı mekanizmalar araştırmak için kapsamlı bir model sağlayabilir. Sunulan yöntemin genel amacı, bu nedenle, uzun vadeli kültürlü hipokampal nöronlarda NMDA reseptör agonistleri tarafından ortaya çıkarılan diferansiyel Ca 2+ yanıtları da dahil olmak üzere yaşlanan beyinde hücre içi Ca 2 + homeostazı veya Ca 2+ yeniden önemli değişiklikleri araştırmak amacıyla, bir . Yöntem sırasıyla, sıçan hipokampal nöronların kültürü ayrıntılı bir açıklamasını ve bireysel nöronlar floresan ve biyolüminesans görüntüleme Sitozolik ve mitokondrial Ca 2 + konsantrasyonları izleme içerir. Kültürlü nöronlar sitozolik Ca 2 + floresan görüntüleme standart bir prosedürdür. Bununla birlikte, bu yöntem, alt için daha az güvenilirdirHücresel Ca mitokondriyal Ca 2 + 2 + olmak üzere ölçümleri. Bu nedenleri bile mM düzeyinde düşük mcM seviyesinden mitokondri değişebilir Ca 2 + konsantrasyonları için sentetik probların uygun hedefleme ve uygunsuz afinite eksikliği sayılabilir. Örneğin aequorin gibi proteinlere göre Ca 2 + prob kullanımı, hücre içi organellere hedef ve spesifik Ca 2+ bağlama siteleri 15 eksik farklı coelenterazines veya mutasyona uğramış problar kullanılarak farklı türevleri Ca 2 + eğilimleri kullanımına izin verdi. Bu şekilde, mitokondri hedefli Aequorini eksprese eden hücrelerin biyoışıldama görüntüleme bireysel nöronlar mitokondriyal Ca 2 + konsantrasyonlarının izlenmesini izin verebilir. Ancak, bu işlem biyoparlaklık görüntüleme 16-18 için foton sayma kameraları ya da ultrasensitif CCD kamera kullanımını gerektirebilir. Daha fazla establ teyit edilmelidir yeni sonuçlar doğurabilir Bu yöntemÖrneğin olarak ished beyin yaşlanması modelleri, eski hayvanlardan beyin dilimleri.

<table><tbody><tr><td>Nörobazal Kültür Ortamı</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>HBSS ortamı</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Jambon F-12 ortamı</td><td>Gibco</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (sığır pankreasından)</td> <td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bobin Serumu</td><td>Lonza</td><td>DE14-801E</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-032</td><td></td></tr><tr><td>12 mm cam lameller</td><td>Labolan</td><td>0111520/20012</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LS003127</td><td></td></tr><tr><td>4 kuyulu çok tabaklı plaklar</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Petry tabakları</td><td>JD Catalan sl</td><td>2120044T</td><td></td></tr><tr><td>Steril pipetler</td><td>Fisher Scientific</td><td>431030</td><td></td></tr><tr><td>Fura2-</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazine n</td><td>Biotium</td><td>BT-10115-2250 uG</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>NMDA</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert S100 TV mikroskobu</td><td>Carl Zeiss Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xcite aydınlatma sistemi</td><td>EXFO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA ER floresan kamera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VIM foton sayma CCD kamera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VC-8 valf kontrolörü</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SH-27B ısıtma sistemi&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aquacosmos Yazılımı</td><td>Hamamatsu Fotonik</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

subselüler ca floresans ve biyoparlaklık görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; yaşlı hipokampal nöronlar

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Nörodejenerasyon ve iskemi ilişkili nöron hücre ölümüne Duyarlılık fazlasıyla yaşlı beyinde artmış, ancak sorumlu mekanizmalar kötü bilinmektedir. Eksitotoksisite, her iki saldırılar ile uyarılan nöron hasarına katkıda bulunduğuna inanılan bir yöntem, Ca2 + akışını ve mitokondriyal Ca 2 + aşırı teşvik glutamat reseptörlerinin aktivasyonu aracılık eder. Hücre içi Ca 2 + homeostazı hücre içi Ca 2 + homeostasis veya yeniden yapılanmasında önemli bir değişiklik eski nöronlar nöron hasarı lehine olabilir. Yaşlanma Ca 2 + yeniden modellemenin araştınlması için in vivo nöronlar arası bazı yönleri benzer sıçan hipokampal nöronlarının uzun dönemli kültürlerde canlı hücre görüntüleme kullandık. Bu amaç için, hipokampal hücreleri ilk etapta, taze yeni doğmuş sıçan Hipokampuslardan gelen dağınık ve poli-D-lizin kaplı cam lamelleri kaplama vardır. Sonra kültürler birkaç gün boyunca kontrollü bir ortam içinde muhafaza veya W birçok edilirsırasıyla, genç ve yaşlı nöronların araştırılması için eeks. İkinci olarak, kültürlenmiş nöronlar fura2 ile yüklenir ve dijital fluoresan oranı görüntüleme kullanarak sitosolik Ca2 + konsantrasyonu ölçümlerine tabi tutulur. Üçüncü olarak, kültürlenmiş nöronlar mitokondri hedeflenen düşük meyil aequorin ve GFP bir tandem ifade eden plasmidler ile transfekte edilir. 24 saat sonra, hücre içinde aequorin koelenterazin ile yeniden ve nöronlar mitokondriyal Ca2 + konsantrasyonunun izlenmesi için biyolüminesans görüntüleme tabi tutulur. Bu üç adım prosedür, örneğin glutamat reseptör agonisti NMDA ve bu ve diğer cevaplar yaşlanma etkilenir olmadığı karşılaştırma gibi ilgili uyaranlara sitosolik ve mitokondriyal Ca 2 + tepkilerinin izlenmesine olanak sağlar. Bu prosedür nasıl etki sitozolik ve mitokondriyal Ca 2+ seçilen uyaranlara yanıtları yanı sıra nöron hücresi önlemeyi amaçlayan seçilen ilaçların test yaşlanma gibi yeni anlayışlar verebiliryaşla ilişkili hastalıklarda ölüme.

Burada Ca 2 + biçimlenme ve sitozolik ve mitokondriyal üzerindeki NMDA etkilerini değerlendirmek için basit bir yöntem tarif [Ca 2 +] yaşlı nöronlarda. Şekil 1 izole ve neonatal sıçanların hipokampal nöronlar kültürü için prosedürün şemasını göstermektedir. Başlamadan önce, steril, poli-D-lizin kaplı cam lamelleri hazırlamak ve 4-iyi bir çanak onları bulmak gerekir. Ardından, yenidoğan sıçanlar öldürüldü ve beyin kaldırılır. Hipokampus izole sonra, doku dikkatle papain ile disperse...

Yaşlanmada hücre içi Ca2+ yeniden şekillenmesi, Ca2+ aşırı yükünün aracılık ettiği süreçler olan eksitotoksisiteye ve nöron hasarına katkıda bulunabilir. Bu çalışmada, bir nöronal yaşlanma modeli olan sıçan hipokampal nöronlarının uzun süreli kültürlerinde sitozolik ve mitokondriyal Ca2+'nın floresan ve biyolüminesans görüntülemesi kullanılarak yaşlanan beyinde Ca2+ yeniden şekillenmesini araştırmayı amaçladık.

Subselüler Ca Floresans ve Biyoparlaklık Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Yaşlı Hipokampal Nöronlar

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Bu prosedürün genel amacı, nöronal yaşlanma modeli olarak kabul edilen frat hipokampal nöronlarının uzun süreli kültürlerindele, sitozolik ve mitokondriyal kalsiyumun floresan ve biyolüminesans görüntülemesini kullanarak yaşlanan beyindeki kalsiyum yeniden şekillenmesini incelemektir. Bu yöntem, her ikisi de kalsiyum aşırı yüklenmesiyle ilişkili olan hücre içi kalsiyum yeniden şekillenmesinin eksitotoksisiteye ve nöron hasarına nasıl katkıda bulunduğu gibi yaşlanma alanındaki temel soruların anlaşılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, aynı örnekten elde edilen farklı DYS'lerdeki in vitro kültürleri kullanarak tekil nöronlardaki kalsiyum yeniden şekillenmesini yakından takip etmenin mümkün olmasıdır; bu tekniğin tekrarlanması, inme veya hücre ölümle ilişkili hastalıkların tedavisi için kalsiyum aşırı yüklenmesiyle ilgili değişken ve yeni hedefler sunabilir.Bu videoyu izledikten sonra, sıçan hipokampal nöronlarının kısa ve uzun süreli kültürlerindele sitozolik ve mitokondriyal kalsiyumun floresan ve reminisans görüntülemesinin nasıl yapılacağı hakkında iyi bir anlayış kazanmış olacaksınız. Bu prosedüre başlamak için, bir Petri kabındaki paraform şeridi üzerine lamelleri yerleştirin. Ardından, her lamelin üzerine 1 mg/mL konsantrasyonda 200 µL poly D lysine uygulayın ve gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, steril koşullar altında lamelleri 90 dakika boyunca her 15 dakikada bir çift distile steril su ile yıkayın. Lamelleri çoklu kuyuya yerleştirin ve kullanıma kadar 37 °C ve %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde muhafaza edin. Hipokampal nöronları izole etmek için, yeni doğmuş sıçan yavrularının kafatasını steril makasla açın, beyni bir spatula ile çıkarın ve hızla Ham's F 12 medyumunda yıkayın.Ardından, her bir hemisferde skalpel ile diyagonal bir kesi yapın ve dokuyu mikroskop altında hams F 12 ortamı içeren Petri kabına aktarın. Meningesleri atın. Korteks üzerindeki karakteristik konkav konumdaki hipokampusu dikkatlice belirleyin.Ardından, hipokampusu dikkatlice çekerek korteksten ayırın ve göz makası kullanarak çıkarın. Daha sonra, hipokampus parçalarını 1,8 mililitre ön filtrelenmiş pepane çözeltisi içeren bir viyale aktarın. Parçaları 37 °C'de, ara ara hafifçe çalkalayarak 15 dakika boyunca inkübe edin.Ardından 90 µL DNA'nın bir çözeltisini ekleyin. mL başına 50 µg ekleyin ve bunları 15 dakika daha inkübe edin. Bundan sonra dokuyu 10 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve fragmanları taze nörobazal kültür medyumu ile yıkayın.Doku fragmanlarını beş mililitrelik plastik bir pipetten geçirerek hücre süspansiyonu elde edin. Ardından, hücre süspansiyonunu 160 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Sonrasında, üst fazı plastik steril bir pastör pipetiyle uzaklaştırın ve peleti bir mililitrelik otomatik pipet kullanarak bir mililitre nörobazal kültür ortamında dikkatlice süspande edin.Ardından, bir neubauer sayım odası kullanarak hücre yoğunluğunu ölçün. 10 µL hücre süspansiyonu ekleyin ve mikroskop altında hücre sayısını belirleyin. Daha sonra, yaklaşık 30.000 hücre içeren 40 ila 80 µL hücre süspansiyonu elde etmek için ilgili hesaplamaları yapın.500 µL nörobazal ortam içeren dört kuyucuklu plakada, cam lamellerin bulunduğu her bir kuyucuğa yaklaşık 30.000 hücre ekin. Hücreleri inkübatörde, genç nöronlar için in vitro 2-5 gün, yaşlı nöronlar için ise in vitro 15 günden fazla tutun. Bu prosedürde, hücreleri 2:00 AM ile birlikte oda sıcaklığında, karanlıkta 60 dakika boyunca inkübe edin.Ardından lamelleri perfüzyon odasına aktarın. Sonrasında, lamelli perfüzyon odasını evirtmiş mikroskoptaki tutucuya yerleştirin. Mikroskobik alanı seçin ve hücreleri önceden ısıtılmış HBS ile sürekli olarak perfüze edin.Ardından, hücreler 340 ve 380 nanometre dalga boylarında epi-aydınlatmaya tabi tutulur. Sırasıyla, bir fira iki diic aynası ile filtrelenen floresan kamera kullanılarak her beş ila 10 saniyede bir 520 nanometrede yayılan ışık kaydedilir. Kaydedilen floresan görüntüleri analiz etmek için önce Aqua Cosmos yazılımını kullanarak deney dosyasını açın, ratio seçeneğine tıklayın ve istenen oran aralığını seçin.Bir dizi oran görüntüsü elde etmek için sonuç görüntülerindeki piksel bazlı oranı hesaplayın. Ardından, arka plan silme butonunu ayarlayarak arka planı çıkarın. Sonrasında hesaplamayı başlat düğmesine basın.Ardından, tüm zaman dizisi (all time sequence) düğmesine basın ve tekil hücrelerin kantitatif analizi için eski ROI'leri silin. Yeni ROI'ler veya tekil nöronlara karşılık gelen ROI'ler belirleyin. Tekil kayıtları grafiğe dökmek için, grafik (graph) seçeneğine tıklayarak her bir ROI'ye karşılık gelen oran floresans değerlerini Origin laboratuvar programına aktarın.Ardından hesapla (calculate) düğmesine tıklayın ve TXT dosyasını kaydedin. Bundan sonra, MIT mutant plazmidi ile transfekte edilmiş kültür nöronlarında her bir stimülasyona yanıt olarak floresan oranındaki artış miktarını tahmin etmek için ilgili hesaplamayı yapın. İlk olarak, bir flakon içerisinde transfeksiyon reaktifi içeren 50 µL çözelti A hazırlayın.Ardından, bir tüp içerisinde MIT ute plazmidi içeren 50 µL çözelti B hazırlayın. Çözelti B'yi çözelti A'ya ekleyin ve 20 dakika inkübe edin. Bundan sonra, hipokampal nöronlar içeren lamelleri, 200 µL taze neuro basal TF içeren yeni çoklu kaplara aktarın. Ardından, her bir lamelin üzerine 100 µL çözelti A ve B'yi damla damla ekleyin ve 30 dakika inkübe edin.30 dakika sonra medyumu uzaklaştırın. Hücreleri taze neuro basal tf ile yıkayın. Ardından lamelleri orijinal neuro basal kültür medyuma geri yerleştirin ve probun etkili bir şekilde ekspresyonu ve hedeflenmesi için hücreleri transfeksiyondan sonra 24 saat boyunca kültüre edin.Ardından, nihai konsantrasyon dört mikromolar olacak şekilde 200 mikrolitre HBS'ye dört mikrolitre TEREZIN N sızdırmazlık maddesi ekleyin. Nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında, karanlıkta iki saat boyunca inkübe edin. İki saat sonra, lamelleri perfüzyon odasına aktarın ve önceden ısıtılmış HBS çözeltisi ile sürekli olarak perfüze edin.Mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonunun biyolüminesans görüntülerini kaydetmek için, floresan emisyonu ile gösterilen APO corin eksprese eden hücreleri içeren mikroskobik alanı seçin. Ardından, mikroskop ışığını kapatın. Işık yolunda bulunan dikroik içeren kutuyu çıkarın.Ardından uyarım ışığını kapatın ve tam karanlık sağlamak için karanlık kutuyu kapatın. Hücreleri, 37 °C'ye önceden ısıtılmış olan test çözeltileriyle veya çözeltisiz olarak HBS medium ile perfüze edin. Daha sonra, bir görüntü işlemci ile kontrol edilen bir foton sayma kamerasıyla her 10 saniyede bir fotonik emisyon görüntülerini yakalayın.Ardından, geri kalan tüm fotonları serbest bırakmak için digiton ekleyin. Mitokondriyal kalsiyumu yansıtan biyolüminesans görüntülerini analiz etmek için GFP floresan görüntüsünü açın. Transfekte edilmiş hücrelerin etrafını çizerek bireysel ROI'leri seçin.Ardından aynı ROI'leri dizideki her görüntüye kopyalayıp yapıştırın. Ekran görüntüleri. Bundan sonra, her bir ROI için fotonik emisyon değerlerini hesaplama yapmak üzere ilgili yazılıma dışa aktarın, grafik seçeneğine tıklayın.Her bir ROI için değerleri hesaplamak amacıyla önce toplam değeri seçin ve mevcut ROI'yi tüm görüntülere uygulayın. Ardından, hesapla (calculate) düğmesine basın, metin dosyasını kaydedin ve verileri dışa aktarın. Sonra, gösterilen her bir stimülüse yanıt olarak mitokondriyal kalsiyum artışlarının boyutunu tahmin etmek için ilgili hesaplamaları yapın.Aşağıda, 100 µM MDA ile uyarılmadan önceki ve sonraki hipokampal nöronların kısa süreli ve uzun süreli kültürlerine ait temsilci parlak alan ve yalancı renk görüntüleri yer almaktadır; daha sıcak renkler, yükselmiş sitozolik kalsiyum konsantrasyonunu yansıtmaktadır. Bu izler, hipokampal nöronların kısa süreli ve uzun süreli kültürlerinde 100 µM MDA'ya yanıt olarak sitozolik kalsiyum konsantrasyonunun temsilci tek hücre kayıtlarını göstermektedir. Sitozolik kalsiyum konsantrasyonundaki artışların, uzun süreli kültürlenen nöronlarda kısa süreli olanlara göre çok daha büyük olduğuna dikkat edin.Bu deneyde, kültürlenmiş hipokampal nöronlar, dört mikromolar sızdırmazlık terezin ile inkübe edilmiş, düşük afiniteli mitokondri hedefli GFP ile füzyonlanmış korin ile transfekte edilmiş ve mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonunun biyolüminesans görüntülemesine tabi tutulmuştur. Burada, kısa ve uzun süreli kültürlenmiş hipokampal nöronlarda mitokondriyal kalsiyumu yansıtan foto emisyon salınımını gösteren kayıtlar yer almaktadır. Bu prosedürü takiben, 100 mikromolar MDA yaşlı nöronlarda mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonunu artırmış, ancak genç kültürlenmiş hipokampal nöronlarda artırmamıştır.Nöron hücrelerine duyarlılık, yaşlanmaya bağlı nörodejenerasyon ve iskemi gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, adil sol değerlendirme gibi diğer yöntemler, aynı hücrelerde floresan ve biyolüminesans görüntüleme ile birleştirilebilir.

fluorescence-bioluminescence-imaging-subcellular-ca2-aged-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol, biz görüntüleme Ca son gelişmeleri...

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Kaynak: Ulivi, A. F., et. al. Canlı Farelerde Dorsal Hipokampal CA1'in Uzunlamasına İki Fotonlu Görüntülemesi. J. Vis. Uzm.  (2019) Bu video, canlı bir farede floresan olarak işaretlenmiş piramidal nöronların uzunlamasına iki fotonlu görüntülemesini göstermektedir.  hipokampal CA1 bölgesindeki nöronal yapıyı incelemek için dendritlerin ve dendritik dikenlerin hazırlanmasını, kanül hizalamasını ve görüntülenmesini sergilemek.

Canlı Fare Hipokampusunda Floresan Olarak İşaretlenmiş Nöronların Uzunlamasına İki Fotonlu Görüntülenmesi 

Kaynak: Calvo-Rodríguez,  et al. Yaşlı hipokampal nöronlarda hücre altı Ca2+. J. Vis. Uzm. (2015).  Bu video, kısa ve uzun süreli sıçan hipokampal kültürlerinde sitozolik kalsiyum seviyelerini ölçmek için floresan görüntülemenin kullanımını göstermektedir. Genç ve yaşlı nöronları karşılaştırarak, yaşlı nöronlarda artan L tipi voltaj kapılı kalsiyum kanal yoğunluğunun ve uzun süreli aktivasyonun, nöronal yaşlanmanın ayırt edici bir özelliği olan kalsiyum aşırı yüklenmesine nasıl yol açtığını...

Kısa Süreli ve Uzun Süreli Sıçan Hipokampal Kültürlerinde İn Vitro Kalsiyum Görüntüleme

Kaynak: Krishnamurthy, K. et al. Amyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum biyosensörünü ifade eden ALS mutant nöronlarındaki sinaptik aktiviteyi izlemek için gerçek zamanlı kalsiyum görüntülemeyi göstermektedir. Nöronal sinaptik aktiviteyi yansıtan hücre içi kalsiyum seviyelerindeki gerçek zamanlı değişiklikleri ölçmek için nöronları görüntüleme, kalsiyum dinamiklerini...

Amyotrofik Lateral Sklerozun İn Vitro Modelinde Sinaptik Kalsiyum Dinamiğinin Floresan Görüntülemesi

Kaynak: Kamei, R., et. al., Fare Hipokampüsündeki Mikroglia'nın İn Vivo Kronik İki Foton Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2022)Video, hipokampal CA1 (Cornu ammonis 1) ve dentat girustaki mikroglial dinamiklerin in vivo iki foton mikroskobu için kurulum ve görüntüleme sürecini göstererek optimum optik hizalama ve yapısal bütünlük değerlendirmesi sağlar.

Fare hipokampüsünde mikroglial dinamiklerin in vivo iki fotonlu görüntülenmesi

Burada bir biyolüminesens muhabir kullanarak yaklaşım -imaging bir roman Ca 2 + sunuyoruz. Bu yaklaşım, Ca2 + bağlanan ve hafif uyarılması için ihtiyacı ortadan kaldırarak, ışık yayan bir kaynaşık konstrukt GFP Aequorini kullanır. Anlamlı bu yöntem derin beyin yapıları ve yüksek temporal çözünürlük uzun sürekli görüntüleme, erişime izin verir.

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Biz bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları ve Ca2 + geçişler akut beyin dilimleri içinde nöronal dendrites kaydetmek için iki fotonlu Imaging birleştiren bir yöntem mevcut.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Bu yöntem, yaşayan farelerin Hippocampus optik erişim sağlayan kronik bir hazırlık açıklar. Bu hazırlık, birkaç hafta boyunca nöronal yapısal plastisite ve aktivite-uyarılmış hücresel plastisite uzunlamasına optik görüntüleme gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Canlı fareler içinde dorsal hipokampal CA1 uzunlamasına Iki foton görüntüleme

Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Bu yazıda, fare hipokampal CA1'deki istirahat mikrogliasının kronik in vivo gözlemi için hassas kontrollü cerrahi ve iki foton mikroskobu kullanılarak bir yöntem açıklanmaktadır.

İn Vivo Fare Hipokampüsünde Mikroglia'nın Kronik İki Foton Görüntülemesi

Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Keşfedin yaşlanan beyinde kalsiyum yeniden yapılanmasını, sitozolik ve mitokondriyal Ca²⁺ görüntüleme ile sıçan hipokampal nöronlarında. Bu yöntem eksitotoksisite ve nöron hasarı mekanizmalarını anlamak için değerlidir.

Subselüler Ca Floresans ve Biyoparlaklık Görüntüleme

Daha fazla video keşfet