Subselüler Ca Floresans ve Biyoparlaklık Görüntüleme ²⁺ Yaşlı Hipokampal Nöronlar

Bu prosedürün genel amacı, nöronal yaşlanmanın bir modeli olarak kabul edilen frat hipokampal nöronların uzun süreli kültürlerinde sitozolik ve mitokondriyal kalsiyumun floresan ve biyolüminesans görüntülemesini kullanarak yaşlanan beyinde kalsiyum yeniden şekillenmesini araştırmaktır. Bu yöntem, hücre içi kalsiyumun yeniden şekillenmesinin, her ikisi de kalsiyum aşırı yüklenmesi ile ilgili olan eksitotoksisiteye ve nöron hasarına nasıl katkıda bulunduğu gibi yaşlanma alanındaki temel soruların anlaşılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en önemli avantajı, bu ajanla ilişkili hastalıklarda aşırı kalsiyum yükü ile ilgili değişken yeni bir hedef olduğu için, bu tekniğin aynı örnekten in vitro olarak farklı DYS'de kültürler kullanılarak kalsiyum yeniden şekillenmesini yakından takip etmenin mümkün olmasıdır.

Bu videoyu izledikten sonra, İsa, sıçan hipokampal nöronlarının kısa ve uzun vadeli kültürlerinde sitozolik ve mitokondriyal kalsiyumun floresan ve anımsatma görüntülemesinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anladı. Bu işleme başlamak için, kapak fişlerini bir Petri kabındaki bir paraform şeridine dağıtın. Daha sonra her bir kapak fişine mililitre başına bir miligramda 200 mikrolitre poli D lizin uygulayın ve gece boyunca tedavi edin.

Ertesi gün örtü kapaklarını steril şartlarda 90 dakika boyunca her 15 dakikada bir çift distile steril su ile yıkayınız. Kapak fişlerini çoklu içine yerleştirin ve kullanıma kadar 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde tutun. Hipokampal nöronları izole etmek için, yeni doğan sıçan yavrularının kafatasını steril makasla açın, beyni bir spatula ile çıkarın ve jambonun F 12 ortamında hızlı bir şekilde yıkayın.

Daha sonra her yarım kürede neşter ile çapraz bir kesim yapın ve mikroskop altında jambon F 12 ortamı içeren Petri kabına aktarın. Meninksleri atın. Hipokampusu korteks üzerinde karakteristik bir içbükey konumda dikkatlice tanımlayın.

Daha sonra hipokampusu dikkatlice çekerek ve göz makası kullanarak çıkararak korteksten ayırın. Daha sonra, hipokampal parçaları 1.8 mililitre önceden filtrelenmiş pepan çözeltisi içeren bir şişeye aktarın. Onları 37 santigrat derecede inkübe edin ve ara sıra 15 dakika hafifçe sallayın.

Sonra 90 mikrolitre DNA'nın bir çözeltisini ekleyin. Mililitre başına 50 mikrogram ekleyin ve 15 dakika daha inkübe edin. Bundan sonra, dokuyu 10 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve parçaları taze nöro bazal kültür ortamı ile yıkayın.

Doku parçalarını beş mililitrelik plastik bir pipetten geçirerek bir hücre süspansiyonu elde edin. Daha sonra, hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 160 G'de santrifüjleyin. Daha sonra, plastik steril bir mera pipeti kullanarak supinatı çıkarın ve peleti bir mililitrelik otomatik pipet ile bir mililitre nöro bazal kültür ortamında dikkatlice askıya alın.

Daha sonra, bir neubauer sayma odası kullanarak hücre yoğunluğunu ölçün. 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve mikroskop altında hücre sayısını sayın. Ardından, yaklaşık 30.000 hücre içeren 40 ila 80 mikrolitre hücre süspansiyonu elde etmek için ilgili hesaplamaları yapın.

500 mikrolitre nöro bazal ortam içeren dört oyuklu plakada, her biri cam kapak fişleri içeren her kuyuya yaklaşık 30.000 hücre oynanır. Genç nöronlar için in vitro olarak iki ila beş gün veya yaşlı nöronlar için in vitro olarak 15 günden fazla inkübatörde tutun. Bu prosedürde, hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 60 dakika boyunca 02:00 daha az inkübe edin.

Daha sonra kapak fişlerini bolluk odasına aktarın. Bundan sonra, füzyon odasını, kapak kayması ile birlikte ters çevrilmiş mikroskop üzerindeki tutucuya yerleştirin. Mikroskobik alanı seçin ve hücreleri ön ısıtma HBS ile sürekli olarak perfüze edin.

Daha sonra, epi hücreleri 340 ve 380 nanometrede aydınlatır. Alternatif olarak, her beş ila 10 saniyede bir 520 nanometrede yayılan ışığı, bir fira iki diic ayna tarafından filtrelenen bir floresan kamera ile kaydedin. Kaydedilen floresan görüntüleri analiz etmek için öncelikle Aqua Cosmos yazılımını kullanarak deney dosyasını açın, orana tıklayın ve istediğiniz oran aralığını seçin.

Bir dizi oran görüntüsü elde etmek için ortaya çıkan görüntülerde piksel piksel oranını hesaplayın. Ardından, arka plan eleme düğmesini ayarlayarak arka planı çıkarın. Bundan sonra hesaplamayı başlat'a basın.

Ardından, tüm zamanların sırası düğmesine basın ve tek tek hücrelerin kantitatif analizi için eski ROI'leri silin. Yeni ROI'ler veya tek tek nöronlara karşılık gelen ROI'ler oluşturun. Tek tek kayıtların grafiğini çıkarmak için, grafiğe tıklayarak her bir ROI'ye karşılık gelen oran floresan değerlerini Origin laboratuvar programına aktarın.

Ardından hesapla'ya tıklayın ve TXT dosyasını kaydedin. Bundan sonra, MIT mutant plazmidi ile kültürlenmiş nöronları transfekte etmek için her bir stimülasyona yanıt olarak floresan oranındaki artışın boyutunu tahmin etmek için ilgili hesaplamayı yapın. İlk olarak, bir şişede transfeksiyon reaktifi içeren 50 mikrolitre çözelti A hazırlayın.

Daha sonra, bir şişede MIT ute plazmid içeren 50 mikrolitre B çözeltisi hazırlayın. Çözelti A'ya çözelti B'yi ekleyin ve 20 dakika inkübe edin. Bundan sonra, hipokampal nöronları içeren kapak fişlerini 200 mikrolitre taze nöro bazal TF içeren yeni çoklu tabaklara aktarın. Daha sonra 100 mikrolitre A ve B çözeltisini, her bir örtü kızağının üzerine damla damla ekleyin ve 30 dakika inkübe edin.

30 dakika sonra ortamı çıkarın. Hücreleri taze nöro bazal tf ile yıkayın. Bir kez geri döndükten sonra, kapak orijinal nöro bazal kültür ortamına geçer ve probun verimli bir şekilde ifade edilmesini ve hedeflenmesini sağlamak için transfeksiyondan sonra 24 saat boyunca hücreleri kültürleyin.

Daha sonra, dört mikromolar nihai konsantrasyon elde etmek için 200 mikrolitre HBS'ye dört mikrolitre sızdırmazlık maddesi TEREZIN N ekleyin. Yavaşça karıştırın ve karanlıkta oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. İki saat sonra, kapak perfüzyon odasına kayar ve ön ısıtma HBS çözeltisi ile sürekli olarak inceleyin.

Mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonunun biyolüminesans görüntülerini kaydetmek için, floresan emisyonu ile gösterildiği gibi APO corin eksprese eden hücreleri içeren mikroskobik alanı seçin. Ardından, mikroskop ışığını kapatın. Işık yolunda bulunan dikroik içeren kutuyu çıkarın.

Ardından uyarma ışığını kapatın ve tamamen karanlık için karanlık kutuyu kapatın. Hücreleri, 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış test solüsyonları olsun veya olmasın, HBS ortamı ile perfüze edin. Ardından, bir görüntü işlemcisi ile kullanılan bir foton sayma kamerasıyla her 10 saniyede bir fotonik emisyon görüntülerini yakalayın.

Ardından, kalan tüm fotonları serbest bırakmak için dig toin ekleyin Mitokondriyal kalsiyumu yansıtan biyolüminesan görüntüleri analiz etmek için. GFP floresan görüntüsünü açın. Kesilen hücrelerin etrafını çizerek tek tek ROI'leri seçin.

Ardından, aynı ROI'leri kopyalayıp dizinin her görüntüsüne yapıştırın. Ekran görüntüleri. Bundan sonra, her bir ROI için fotonik emisyon değerlerini, tıklama grafiğini hesaplamak için belirli bir yazılıma aktarın.

Her bir ROI'nin değerlerini hesaplamak için toplam değeri seçin ve tüm görüntüler için mevcut ROI'yi kullanın. Ardından, hesapla düğmesine basın, metin dosyasını kaydedin ve verileri dışa aktarın. Daha sonra, gösterilen her uyarana yanıt olarak mitokondriyal kalsiyumdaki artışların boyutunu tahmin etmek için ilgili hesaplamaları yapın.

İşte 100 mikromolar ve MDA ile stimülasyondan önce ve sonra hipokampal nöronların kısa ve uzun süreli kültürlerinin temsili parlak alan ve sahte renkli görüntüleri, daha sıcak renkler yüksek sitozolik kalsiyum konsantrasyonunu yansıtır. Bu izler, hipokampal nöronların kısa ve uzun süreli kültürlerinde 100 mikromolar ve MDA'ya yanıt olarak sitozolik kalsiyum konsantrasyonunun temsili tek hücreli kayıtlarını göstermektedir. Sitozolik kalsiyum konsantrasyonu artışlarının uzun vadede kısa süreli kültürlenmiş nöronlara göre çok daha büyük olduğunu unutmayın.

Bu deneyde, kültürlenmiş hipokampal nöronlar, dört mikromolar örtücü terezin ile inkübe edilen GFP'ye kaynaşmış düşük afiniteli mitokondri hedefli korin ile transfekte edildi ve mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonunun biyolüminesans görüntülemesine tabi tutuldu. Burada, kısa ve uzun süreli kültürlenmiş hipokampal nöronlarda mitokondriyal kalsiyumu yansıtan foto emisyonların salınımını gösteren kayıtlar. Bir MDA 100 mikromolar, yaşlı nöronlarda mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonunu arttırdı, ancak bu prosedürü takiben genç kültürlenmiş hipokampal nöronlarda değil.

Adil sol değerlendirme gibi diğer yöntemler, nöron hücresine duyarlılık, yaşlanma nörodejenerasyonu ve iskemi ile ilişkili kurşun gibi ek soruları yanıtlamak için aynı hücrelerde floresan ve biyolüminesans görüntüleme ile birleştirilebilir.