Lazer güdümlü Nöronal İzleme Beyin Eksplantlarındaki

Bu yöntemin genel amacı, ilgilenilen hedef veya kaynak beyin çekirdeği ile olan bağlantılarını izlemek için nöronları ve aksonal projeksiyonlarını etiketlemektir. Bu yöntem, beynin farklı alanları veya nöronal alt popülasyonları arasındaki bağlantı kalıpları ve bunların belirli bir nöro devre için işlevsel önemi gibi sinirbilimdeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Bu tekniğin ana avantajı, izleyici enjeksiyonları sırasında artan hedef doğruluğudur.

Bu, floresan olarak etiketlenmiş beyin çekirdeklerini görselleştirmek için temel optik ekipman kullanılarak elde edilir. Bu yöntemin bir başka avantajı, nöronal promotörlerin kontrolü altında floresan proteinleri eksprese eden fare poplarının noninvaziv genotiplenmesine izin vermesidir. Genotipleme yaparken, yavrular, uygun uyarma dalga boyuna sahip bir lazer işaretçi kullanarak ilgili floresan belirteçlerin ifadesini kontrol edin.

Aynı zamanda, uyarma dalga boyunu bloke eden, ancak emisyon dalga boyunu geçen filtre gözlükleri takın. Lazeri söz konusu yavrunun başının arkasına veya omuriliğine doğrultun. Lazeri P'nin gözlerine parlatmamaya ve lazer maruziyetini kısa tutmaya dikkat edin.

Uyarılmış floresan belirteçler ciltten görülebilmelidir. Fare yaşlandığında, toplanan dokuların bireysel nöronları tanımlanabilir. Fareyi uyuşturduktan ve refleks olup olmadığını kontrol ettikten sonra, kafatasının üzerindeki cildi çıkarın, cildi başın arkasından kafatasının orta kısmına kadar kesin.

Bir aydan daha yaşlı farelerde bile, floresan hayvanın gözünden gözlemlenebilir. Daha sonra, buz gibi soğuk PBS trans Cardi kullanarak, 30 gauge bir iğne kullanarak işaretleyici pozitif hayvanı perfüze edin, beş ila 10 dakika sonra kanın çoğu alınacaktır. Sonra beyni çıkarın ve ilgilenilen bölgeyi inceleyin.

Burada, beynin ventral bölgesinde belirgin iki ampul olan yamuk cisim, ilgilenilen bölgeyi içerir. Yamuk cisimciklerinin veya VNTB'nin ventral çekirdekleri, ekilen beyin bölgesinin ilgilenilen bir oksijenli diseksiyon çözeltisine aktarılmasıyla başlar. Orada. Explan'ı 30 gauge şırınga iğneleri ile sabitleyin, böylece enjeksiyon alanına üstten erişilebilir.

Enjeksiyon için, üç veya dört çekme döngüsünde üretilen Bo silikat cam çekmeli enjeksiyon pipetleri kullanın. Pipeti aşağıdaki solüsyonla yükleyin. Kolera toksin alt birimi B, esas olarak retrograd taşıma için olan Alexa FLUORA 4 5 55'e konjuge edilmiştir.

Hepsi monte edilmiş ve kullanıma hazır hale getirilmiş lazer işaretçi ve enjeksiyon pipetleri ile, ışının etiketlenmiş beyin bölgesine veya enjekte edilecek hücrelere yönlendirilmesiyle devam edin. Enjeksiyon pipeti ile hangi nöronları hedefleyeceğinizi görmek için bant geçiren filtre gözlüklerinden alanı gözlemleyin. Pipeti ilgilenilen alana yerleştirmek için mikro manipülatörü kullanın.

Ardından, 15 PS'de 50 milisaniyelik darbeler verecek şekilde ayarlanmış bir basınç enjektörü kullanarak, izleyici maddeyi iki ila 10 darbede enjekte ediyorum. Enjekte edilen boyanın yayılabilmesi için darbeler arasında 10 ila 15 saniye geçmesine izin verin. Tetraetil rumin enjekte edilirken, TTL darbeleri veren uyarıcı elektrot ile bölgeyi elektriksel olarak uyarın.

Elektrotun banyo solüsyonunda topraklandığından emin olun. Her biri 50 milisaniye uzunluğunda, 50 milisaniye aralıklarla sekiz voltta sekiz TTL darbesi verin. Birkaç dakika boyunca 10 ila 20 nabız tekrarı ile bölgeyi uyarın.

Beyin çekirdekleri büyüklük, nöronal yoğunluk ve hücre tiplerine göre değişir. Bu, belirli bir beyin bölgesi için en uygun etiketleme sonuçlarını elde etmek için basınç ve/veya elektrik darbelerinin süresinin ve sayısının ayarlanması gerekebileceği anlamına gelir. Lazer ve gözlükleri kullanarak floresan izleyici sinyalini kontrol edin.

Boya hücreler tarafından alınmalı ve enjekte edilen alanın etrafına yayılmalıdır. Enjeksiyondan sonra, beyin bir ila dört saat boyunca oda sıcaklığında oksijenli yapay beyin omurilik sıvısında kök salmaktadır. İnkübasyon sırasında oksijenasyonu koruyun, ardından dokuyu %4 paraform aldehit içinde sabitleyin.

Ertesi gün dört santigrat derecede bir gecede PBS'de, doku dilimlenebilir ve yamuk gövdesinin veya VNTB'nin ventral çekirdeğine bir intergrade enjeksiyon monte edilebilir. Tetraetil Rodin dekstrin kullanılması, VNTB'den gelen çıkıntıların yamuk gövdesinin veya MNTB'nin medial çekirdeğine kadar uzandığını gösterir. Daha sonra MNTB'ye, VNTB'yi retro olarak büyük ölçüde etiketleyen chole toin, alt birim B enjekte edildi.

Daha ayrıntılı olarak, glisenterik VNTB hücrelerinin somatasının daha sonra etiketlendiği ortaya çıktı. MNTB'ye retrograd etiket dekstrin tri enjekte edildi. CTB etiketlemesinin noktalama modelinden farklı olarak, dekstrin trit etiketlemesi yoğundu ve GOGI gibiydi.

Bu videoyu izledikten sonra, nöronları ve süreçlerini daha yüksek doğrulukla nasıl etiketleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Gösterilen teknik, belirli bir nöro devreye katılan beyin alanlarını ve nöronal alt popülasyonları tanımlamanıza yardımcı olur, bir kez ustalaştıktan sonra, enjeksiyon prosedürü uygun şekilde yapılırsa yaklaşık 30 dakika içinde yapılabilir. Bu prosedür, nöronal projeksiyonların ve diğer nöronal yapıların morfolojisi, yönlülüğü veya işlevselliği ile ilgili ek soruları yanıtlamak için immünokimya veya beyin temizleme gibi diğer yöntemlerle kolayca birleştirilebilir.