Lazer güdümlü Nöronal İzleme Beyin Eksplantlarındaki

Bu yöntemin genel amacı, hedef veya kaynak beyin çekirdeklerine olan bağlantılarını izlemek amacıyla nöronları ve aksonal projeksiyonlarını etiketlemektir. Bu yöntem, beynin farklı bölgeleri veya nöronal alt popülasyonları arasındaki bağlantı kalıpları ile bunların belirli bir nöral devre için fonksiyonel önemleri gibi nörobilimdeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajı, izleyici enjeksiyonları sırasında hedef doğruluğunun artırılmış olmasıdır.

Bu işlem, floresan işaretli beyin çekirdeklerini görselleştirmek için temel optik ekipmanlar kullanılarak gerçekleştirilir. Bu yöntemin bir başka avantajı da, nöronal promotörlerin kontrolü altında floresan proteinler eksprese eden fare yavrularının noninvaziv genotyping işleminin yapılmasına olanak tanımasıdır. Yavruların genotyping işlemi sırasında, uygun eksitasyon dalga boyuna sahip bir lazer işaretleyici kullanarak ilgili floresan markerların ekspresyonunu kontrol edin.

Aynı zamanda, eksitasyon dalga boyunu engelleyen ancak emisyon dalga boyunu geçiren filtreli gözlükler takın. Lazeri, ilgili yavrunun başının arkasına veya omuriliğine yöneltin. Lazeri yavrunun gözlerine tutmamaya dikkat edin ve lazer maruziyetini kısa tutun.

Uyarılmış floresan belirteçler deri üzerinden görünür olmalıdır. Fare yaşlandığında, hasat edilen dokulardaki bireysel nöronlar tanımlanabilir. Fareyi anestezi altına alıp refleks yokluğunu kontrol ettikten sonra, kafatası üzerindeki deriyi kaldırın ve deriyi başın arkasından kafatasının orta kısmına kadar kesin.

Bir aydan daha büyük olan daha yaşlı farelerde, floresans hayvanın gözleri üzerinden gözlemlenebilir. Ardından, 30 gauge bir iğne kullanarak, buz soğukluğundaki PBS ile marker pozitif hayvanın trans kardiyak perfüzyonunu gerçekleştirin; beş ila 10 dakika sonra kanın çoğu uzaklaştırılmış olacaktır. Daha sonra beyni çıkarın ve ilgili bölgeyi diseke edin.

Burada, beynin ventral bölgesindeki iki belirgin şişkinlik olan trapezoid gövde, ilgile olunan bölgeyi içerir. Trapezoid gövdelerin ventral çekirdekleri veya VNTB, eksize edilmiş ilgile olunan beyin bölgesinin oksijenlendirilmiş diseksiyon solüsyonu içeren bir kaba aktarılmasıyla başlar. Burada, enjeksiyon alanının üstten erişilebilir olması için eksize edilen dokuyu 30 gauge şırınga iğneleriyle sabitleyin.

Enjeksiyon için, üç veya dört çekme döngüsüyle üretilmiş borosilikat cam çekilmiş enjeksiyon pipetlerini kullanın. Pipete şu çözeltiyi yükleyin: Esas olarak retrograd taşıma için kullanılan, Alexa FLUORA 4 5 55 ile konjuge edilmiş kolera toksini alt birimi B.

Lazer işaretleyici ve enjeksiyon pipetlerinin tamamı monte edilmiş ve kullanıma hazır haldeyken, ışını etiketlenmiş beyin bölgesine veya enjekte edilecek hücrelere doğrultun. Enjeksiyon pipeti ile hangi nöronların hedefleneceğini görmek için alanı bant geçiren filtre gözlüklerle gözlemleyin. Pipeti ilgili alana yerleştirmek için mikro manipülatörü kullanın.

Ardından, 15 PS'de 50 milisaniyelik darbeler verecek şekilde ayarlanan bir basınç enjektörü kullanarak, izleyici maddeyi iki ila 10 darbe halinde enjekte ediyorum. Enjekte edilen boyanın yayılabilmesi için darbeler arasında 10 ila 15 saniye bekleyin. Tetraetil ramin enjekte ederken, TTL darbeleri ileten stimülasyon elektroduyla bölgeyi elektriksel olarak uyarın.

Elektrodun banyo solüsyonunda topraklandığından emin olun. Her biri 50 milisaniye süren ve 50 milisaniyelik aralıklarla uygulanan, sekiz voltluk sekiz TTL darbesi verin. Bölgeyi birkaç dakika boyunca 10 ila 20 darbe tekrarı ile stimüle edin.

Beyin çekirdekleri boyut, nöronal yoğunluk ve hücre tipleri açısından farklılık gösterir. Bu durum, belirli bir beyin bölgesi için optimal işaretleme sonuçları elde etmek amacıyla basınç ve/veya elektriksel darbelerin süresinin ve sayısının ayarlanması gerekebileceği anlamına gelir. Lazer ve koruyucu gözlük kullanarak floresan izleyici sinyalini kontrol edin.

Boya hücreler tarafından alınmalı ve enjekte edilen alanın çevresine yayılmalıdır. Enjeksiyondan sonra beyin saplarını, oda sıcaklığında, oksijenle zenginleştirilmiş yapay serebrospinal sıvıda bir ila dört saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sırasında oksijenasyonu sürdürün, ardından dokuyu %4 paraformaldehit ile fikse edin.

Ertesi gün, dört santigrat derecede gece boyunca PBS içinde bekletilen doku dilimlenebilir ve trapezoid gövdenin ventral çekirdeğine (VNTB) yapılan bir ara enjeksiyonla monte edilebilir. Tetraetil rodin dekstrin kullanımı, VNTB'den gelen projeksiyonların trapezoid gövdenin medial çekirdeğine (MNTB) uzandığını göstermektedir. Ardından MNTB'ye, VNTB'yi retrograd olarak belirginleştiren kolin subunit B enjekte edilmiştir.

Daha ayrıntılı olarak, glik enterik VNTB hücrelerinin somaları daha sonra işaretlenmiş gibi görünmektedir. MNTB'ye retrograd işaretleyici dextrin tri enjekte edilmiştir. CTB işaretlemesinin noktasal paterninin aksine, dextrin trit işaretlemesi yoğun ve GOGI benzeriydi.

Bu videoyu izledikten sonra, nöronları ve uzantılarını artırılmış bir doğrulukla nasıl işaretleyeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Gösterilen teknik, belirli bir nöral devreye katılan beyin bölgelerinin ve nöronal alt popülasyonların tanımlanmasına yardımcı olur; teknik ustalığa erişildiğinde, enjeksiyon prosedürü uygun şekilde yürütülürse yaklaşık 30 dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedür; nöronal projeksiyonların ve diğer nöronal yapıların morfolojisi, yönelimi veya fonksiyonelliğine ilişkin ek soruları yanıtlamak için immünokimya veya beyin berraklaştırma gibi diğer yöntemlerle kolayca birleştirilebilir.