Gen İfade Etkileyen Sinyal İletimi Pathways tanımak Tavuk Embriyo uzuvlar Geliştirme içine Boncuk eklenme

Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan tavuk embriyo uzuvlarının gen ekspresyonunda büyüme faktörlerinin ve inhibitörlerin etkilerinin nasıl belirleneceğini göstermektir. Bu yöntem, sinyal moleküllerinin in vivo olarak hücrelerin büyümesini ve farklılaşmasını nasıl etkilediği gibi gelişim biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bu faktörleri doğrudan embriyoda test etmek için bir yöntem sağlamasıdır.

Bu yöntem uzuv gelişimi hakkında fikir verebilse de, nöral doku, somitler veya gastrulasyon gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Rebeea Mohammed olacak. Başlamak için, orijinal stok çözeltisinden bir mililitre boncukları yeni bir tüpe aktarın.

Boncukların çökmesine izin verin, ardından sıvıyı çıkarın ve bir mililitre PBS ile değiştirin. Bu adımı beş kez tekrarlayın ve yıkanmış boncukları PBS'de bir bulamaç olarak dört santigrat derecede saklayın. Aşılama için boncukları, 20 mikrolitrelik bir pipet kullanarak yıkanmış stok solüsyonundan çıkararak seçin ve bir mililitre PBS'ye yerleştirin.

Bir stereoskop kullanarak, çapı yaklaşık 100 mikron olan boncukları seçin. Seçilen boncukları iki mikro litre sıvı içinde 20 mililitrelik bir PBS damlası içeren yeni bir Petri kabına aktarın Ardından, PBS'yi boncuklardan çıkarın. Önce 20 mikro litrelik pipetle ve ardından ince bir saatçinin forsepslerini kullanarak kılcal hareketle kalan sıvıyı çıkarın.

Boncuklara eklendiğinde büyüme faktörünün seyreltilmemesi için mümkün olduğunca fazla sıvının çıkarılması önemlidir. Büyüme faktörünü doğrudan boncukların üzerine pipetleyin. FGF18 için, 0,5 mikro litre rekombinant FGF18 ekleyin, sulandırılmış, yüzde 0,1 BSA ile PBS'de mililitre başına 0,5 miligram ekleyin.

Ardından, sıvının buharlaşmasını önlemek için tabağın kenarlarına birkaç damla su damlatın. Hazır olduğunda, boncukları oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, bir Pasteur pipeti ile tabaktan su damlalarını alın ve tabağı buzun üzerine yerleştirin.

Boncukları 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarmak için önce bir spatula kullanarak boncukları türevlendirin. Daha sonra, bir mililitre 0.2 normal formik asit ekleyin ve asitteki boncukları bir saat boyunca çalkalanan bir platformda inkübe edin. Daha sonra, boncukların çökmesine izin verin, formik asidi çıkarın ve bir mililitre su ile değiştirin.

Boncukları çalkalama platformunda bir saat boyunca yıkayın ve kalan formik asidi çıkarmak için yıkamayı altı kez tekrarlayın. Son yıkamanın ardından kalan sıvıyı çıkarın ve boncukları dört santigrat derecede saklayın. Stoktan yaklaşık beş ila on mikro litre hacminde küçük bir boncuk paletini çıkarmak için bir spatula kullanın ve boncukları 30 mililitrelik bir Petri kabına yerleştirin.

Ardından, bir mililitre DMSO ekleyin. Daha sonra, çapı yaklaşık 100 mikron olan boncukları başka bir 30 mililitrelik Petri kabındaki 20 mikro litrelik bir çözücü damlasına aktarmak için iki mikro litreye ayarlanmış bir P2 pipeti kullanın. Çözücünün büyük kısmını 20 mikro litrelik bir pipetle ve kalan çözücüyü iki mikro litrelik bir pipetle çıkarın.

Daha sonra, boncukları DMSO'da çözülmüş, uygulanacak ilacın 20 mikro litresi ile örtün. Boncukları ilaç çözeltisinde bir saat inkübe edin. Boncukları ışıktan koruyun, çünkü birçok ilaç molekülü ışığa duyarlıdır.

Boncukları görselleştirmeye yardımcı olmak için, iki mikro litre sıvı içinde dört ila beş boncuğu, suda çözünmüş 20 mikro litre yüzde iki fenol kırmızısına aktarın. İnce saatçi forsepsleri ile tek bir boncuğu çıkarın ve boncuğu PBS'de durulayın. Boncukları durulamadan önce fenol kırmızısı solüsyonunda 15 dakikadan fazla bırakmayın, çünkü bu aktivite kaybına neden olabilir.

İnce tungsten telini üç ila dört santimetre uzunluklarda kesin Ardından, telin bir parçasını bir cam Pasteur pipetinin ucuna yerleştirin ve yerine sabitlemek için bir Bunsen brülöründe eritin. Hasar görmeleri durumunda yedek parça olduğundan emin olmak için 10 adede kadar iğne hazırlayın. Daha sonra, telin ucunu bir kaynak makinesi alevine yerleştirin ve tungsten beyaz parlayana ve ucu keskin olana kadar orada tutun.

Bu yaklaşık iki ila üç dakika sürer. Mililitre başına 100 miligram Penisilin ve 0.1 miligram Streptomisin içeren 15 mililitre PBS'ye beş ila altı damla sanatçı Hindistan mürekkebi ekleyin. Tavuk embriyolarını hazırlamak için, yumurtaları, tipik olarak üç ila beş gün olan çoğu uzuv tomurcuğu manipülasyonu için istenen aşamaya ulaşana kadar kör uçla kuluçkaya yatırın.

İstenilen zaman noktasına ulaşıldığında, yumurtanın kör ucuna vurmak ve kabuğu kırmak için künt forseps kullanın. Ardından, kabuğu çıkarmak ve embriyoyu ortaya çıkarmak için forseps kullanın. Yumurta hücresi zarının da çıkarıldığından emin olun.

Embriyoyu görselleştirmek için, bir mililitrelik bir şırınga ve 21 gauge iğne ile embriyonun altına birkaç damla sanatçı Hindistan mürekkebi ile takviye edilmiş PBS enjekte edin. Embriyonun üzerindeki vitellin zarı daha sonra ince forsepslerle çıkarılabilir. Daha sonra, embriyonun susuz kalmamasını sağlamak için yumurtaya yüzde bir fetal buzağı serumu, mililitre başına 100 birim Penisilin ve mililitre başına 0.1 miligram Streptomisin ile takviye edilmiş bir PBS'den iki ila üç mililitre ekleyin.

Keskinleştirilmiş saatçi forsepslerini kullanarak, gelişmekte olan uzuv tomurcukları üzerinde amniyon açın. Bu aşamalarda, embriyo tipik olarak dönecektir, böylece sağ taraf en üstte olacaktır. İhtiyaç duyulduğunda takviye edilmiş PBS çözeltisinden daha fazla ekleyerek embriyonun kurumamasını sağlayın.

Embriyoyu çevreleyen amniyon, gelişmekte olan uzvu ortaya çıkarmak için ince bir tungsten iğnesi kullanılarak açılabilir. Ardından, boncuğun implante edileceği uzuv tomurcuğuna bir kesi yapmak için keskinleştirilmiş tungsten teli kullanın. Mümkünse uzuv tomurcuğunu tamamen kesmekten kaçının.

Daha genç aşamalarda olmasına rağmen, bu zordur. Ekstra ince, saatçi forsepsleri kullanarak büyüme faktörü veya ilaçla kaplanmış bir boncuk alın. Boncuk DMSO veya fenol kırmızısına batırılmışsa, embriyoya uygulamadan önce PBS ile durulandığından emin olun.

Forseps kullanarak boncuğu embriyoya aktarın ve ardından boncuğu insizyon yerine yerleştirmek için keskinleştirilmiş tungsten teli kullanın. Embriyonun nemli kalmasını sağlamak için yumurtaya bir ila iki mililitre ek PBS çözeltisi ekleyin. Solüsyonu doğrudan embriyonun üzerine uygulamaktan kaçının, çünkü bu embriyoya zarar verebilir ve boncuğun yerinden çıkmasına neden olabilir.

Daha sonra, embriyonun yumurtayı kapatmak için kullanılan bantla temas etmemesini sağlamak için yalnızca gerektiği kadar albümini çıkarmak için 19 gauge iğne ile donatılmış on mililitrelik bir şırınga kullanın. İğneyi kabuğun içinden aşağı kaydırarak yumurta sarısına zarar vermediğinden emin olun. Son olarak, yumurtayı bantla kapatın ve kuluçka makinesine geri koyun.

FGF18'in ERK'yi fosforile etmek için MEK yoluyla hareket edebildiğini doğrulamak için, embriyolar boncuk aşılamasından bir saat sonra toplandı ve sağdaki resimde aşılanmış boncuğu çevrelediği görülebilen fosforile ERK varlığı için immün boyandı. HH evre 21'de, MyoD gelişmekte olan ekstremite miyoblastlarında eksprese edilmez. Her ne kadar gelişmekte olan somitlerin miytomunda lekelenme görülebilir.

FGF18 boncuk greftinden altı saat sonra, MyoD'nin boncuka yakın miyoblastta indüklendiği görülebilir. Kontralateral uzuvda herhangi bir ifade yokken. Bu ekspresyon, U0126 gibi bir MEK inhibitörü ile kaplanmış bir boncuğun birlikte aşılanmasıyla inhibe edilebilir.

Benzer şekilde, HH Evre 21'de bir U0126 boncuğunun aşılanması, tedavi edilmemiş kontralateral ekstremite ile karşılaştırıldığında, 24 saat sonra MyoD'nin endojen ekspresyonunu azaltır. Ekstremite tomurcuklarında, HH evre 19'da, FGF18 MyoD'yi indüklemez. Bununla birlikte, FGF18'e batırılmış boncukların ve bir retinoik asit antagonistinin birlikte aşılanması bunun üstesinden gelebilir ve ektopik MyoD tespit edilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa üç ila dört dakika içinde yapılabilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, gelişim biyolojisi alanındaki araştırmacıların embriyo gelişiminde sinyal veren büyüme faktörlerini keşfetmelerine izin verdi. Bu tekniği denerken, embriyonun kurumasına izin vermemeyi unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, büyüme faktörleri sinyalinin gelişimi nasıl etkilediğini belirlemek için boncukların gelişmekte olan embriyolara nasıl aşılanacağını iyi anlamış olmalısınız.