Optogenetic Fonksiyonel MRI
19 Nisan 2016
Bu protokol, optogenetik fonksiyonel manyetik rezonans görüntülemeyi (ofMRI) başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için gereken adımları ve veri analizini açıklar. ofMRI, yüksek alanlı fMRI okumasını optogenetik stimülasyonla birleştiren, fonksiyonel nöral devrelerin ve bunların tüm canlı beyindeki dinamiklerinin hücre tipine özgü haritalanmasına izin veren yeni bir tekniktir.
Bu görüntüleme prosedürünün genel amacı, fonksiyonel nöral devrelerin ve bunların tüm canlı beyin boyunca dinamiklerinin hücre tipine özgü haritalanması için f-MRI'ı optogenetik stimülasyonla birleştirmektir. Bu yöntem, belirli beyin devresi elemanlarının küresel beyin aktivitesini yönlendirmedeki rolünün belirlenmesi gibi nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hücre tipine özgü stimülasyona ve küresel beyin aktivitesinin nispeten yüksek uzamsal çözünürlüklü okunmasına olanak tanımasıdır.
Bu prosedürü, laboratuvarımdaki lisansüstü öğrenciler Jia Liu ve Zhongnan Fang uygulamalı olarak gösterecekler. Hayvanı metin protokolünde açıklandığı şekilde anesteziye aldıktan sonra, baş kısmını elektrikli tıraş makinesiyle tıraş edin ve deri üzerinde Betadine ve %70 etanol durulaması kullanarak üçlü cerrahi scrubbing işlemi gerçekleştirin. Ardından, hayvanın kafatasını bir stereotaksik aparat ile sabitleyin.
Kafa derisinde 15 ila 20 milimetrelik orta hat bir insizyon yapmak için bir skalpel kullanın. Periostuma tutturulmuş cerrahi hemostatlar yardımıyla kafa derisini geri çekin. Kafatası üzerindeki Lambda ve Bregma konumlarını belirleyin, ardından matkap ucunu ilgi bölgesinin (ROI) üzerine konumlandırın.
Beyni delmemeye dikkat ederek, bir dental matkapla ROI üzerinden küçük bir kraniyotomi gerçekleştirin. Mikrolitre şırıngaya bağlı bir iğneyi, kraniyotomiden geçerek beyindeki ROI'ye yavaşça yerleştirin. Ardından, mikrosyringe pompa kontrol cihazını kullanarak ROI'ye iki microliters vektör solüsyonu enjekte edin.
Enjeksiyon tamamlandıktan sonra 10 dakika bekleyin, ardından şırıngayı dakikada 0.5 mm hızla yavaşça çıkarın. Enjeksiyon sonrası kafatasının yüzeyini kurulayın. ROI koordinatlarını doğrulayın ve ferrule implantını dakikada 0.5 mm hızla hedef derinliğe yerleştirin.
Son olarak, ferrül implantını dental siman kullanarak kafatasına monte edin. Dental siman katılaştıktan sonra, dental siman kapağının etrafındaki insizyonu sütürlerle kapatın. Fiberoptik ara kabloyu bir lazer ışık kaynağına bağlayarak başlayın ve ara kablo ucundaki çıkışı bir güç ölçer ile ölçün.
Beyin içine implante edilen fiber optik kablonun ucunda istenen çıktıyı elde etmek için uygun güç seviyesini ayarlayın. Hayvanın gözlerini kapatarak implanttan ışık sızmasını önleyin. Ardından, bobini hayvanın başının üzerine yerleştirin.
Fiberoptik kabloyu ferrule implantına sabitlemek için bir ferrule kılıfı kullanın. Hayvanın bulunduğu beşiği tarayıcının boşluğuna yerleştirin. Fizyolojik değerleri uygun sınırlar içerisinde tutmak için yapay ventilatörü ayarlayarak, deney boyunca solunum hızını, tidal CO2 seviyesini ve vücut sıcaklığını izleyin.
MRI tarayıcısının tetikleme portundan fonksiyon jeneratörüne BNC kabloları bağlayın. Bir konumlandırma sekansı seçin ve operasyon penceresindeki scan butonuna tıklayın. Hayvanın baş konumunu görüntülemek için continue butonuna tıklayın.
Beyin izomerkezde değilse, hayvanın baş konumunu ayarlayın ve beyin izomerkeze gelene kadar konumlandırma taramasını tekrarlayın. Beynin genel bütünlüğünü kontrol etmek ve optik fiber implantın konumunu doğrulamak için yüksek çözünürlüklü bir anatomik görüntü edinin. Ardından, T2 ağırlıklı bir sekans seçin.
Kesit sayısını ayarlayın ve ardından T2 ağırlıklı yüksek çözünürlüklü koronal anatomik görüntüleri elde etmek için 'scan'e tıklayın. Son olarak, çok kesitli gradyan yankılı eko-sekansını seçin ve ardından fonksiyonel görüntüyü elde etmek için 'continue'ye tıklayın. Bu protokol, bir hayvan modelinde motor korteksi uyarmak için optogenetik f-MRI kullanmaktadır.
Bu aktivasyon haritası, motor korteks ve talamustaki aktive olmuş vokseli göstererek bu bölgeler arasındaki uzun menzilli sinaptik bağlantılara işaret etmektedir. Burada, motor korteksin optogenetik stimülasyonu sırasında motor korteks ve talamustaki aktif vokseler için belirgin sinyal gösterilmiştir. Talamik hemodinamik yanıt fonksiyonu, stimülasyon sonrası motor korteksteki yanıta kıyasla gecikmeli bir yanıt göstermektedir.
Bu videoyu izledikten sonra, implantasyon cerrahisinin ve optogenetik fonksiyonel manyetik rezonans görüntülemenin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Uzmanlaşıldığında, bu görüntüleme prosedürü iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, hayvanı izlemek ve fizyolojisini normal sınırlar içinde tutmak çok önemlidir.
Bu prosedürün ardından, nöroaktivitenin zamansal dinamiklerini incelemek için elektrofizyoloji veya opsinin ekspresyonunu ve özgüllüğünü doğrulamak için immünohistokimya gibi tamamlayıcı yöntemler kullanılabilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, nörobilimcilerin bütün ve canlı bir beyindeki fonksiyonel bağlantısallığı araştırmalarının önünü açmıştır. MRI tarayıcı ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.
Bu prosedür uygulanırken, manyetik ekipmanların tarayıcıdan yeterince uzakta tutulması gibi önlemler her zaman alınmalıdır.
Genel Bakış
Bu protokol, yüksek alanlı fMRI'yı optogenetik stimülasyon ile entegre eden bir teknik olan optogenetik fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme (ofMRI) uygulaması için prosedürü ve veri analizini özetlemektedir. Bu yöntem, araştırmacıların canlı beyinlerdeki fonksiyonel nöral devreleri ve bunların dinamiklerini hücre tipi özgüllüğü ile haritalandırmasına olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Görüntüleme Teknikleri
- Optogenetik
Arka Plan
- ofMRI, fMRI ve optogenetik stimülasyonu birleştirir.
- Bu teknik, nöral devrelerin hassas bir şekilde haritalanmasına olanak tanır.
- Beyin devresi fonksiyonlarına ilişkin temel sorulara yanıt verir.
- Yüksek uzamsal çözünürlük, bu yöntemin önemli bir avantajıdır.
Çalışmanın Amacı
- Nöral devrelerin incelenmesinde ofMRI kullanımını göstermek.
- Araştırmacılar için ayrıntılı bir protokol sağlamak.
- Prosedür sırasında fizyolojik parametrelerin izlenmesinin önemini vurgulamak.
Kullanılan Yöntemler
- Hayvan hazırlığı ve anestezi.
- Kraniyotomi ve beyne vektör çözeltisi enjeksiyonu.
- Fiber optik kablo implantasyonu ve lazer ışık kaynağına bağlantısı.
- Görüntüleme ve veri toplama için MRI tarayıcı kullanımı.
Temel Sonuçlar
- Aktivasyon haritaları, motor korteks ve talamus arasındaki bağlantıları göstermektedir.
- Talamusta gecikmiş hemodinamik yanıt gösterilmiştir.
- Görüntüleme sırasında optogenetik stimülasyonun başarılı bir şekilde uygulanması gerçekleştirilmiştir.
- Prosedür yaklaşık iki saat içinde tamamlanabilir.
Sonuçlar
- ofMRI, beyindeki fonksiyonel bağlantıların incelenmesi için değerli bir araçtır.
- Prosedür sırasında hayvan fizyolojisinin korunması kritik önem taşır.
- Tamamlayıcı yöntemler, nöroaktivite dinamiklerinin anlaşılmasını geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulama Uygunluğu
Optogenetik fonksiyonel MRI (ofMRI), nöropsikiyatrik ilaç keşfinde hedef doğrulamasını destekleyerek, tüm beyin uzamsal çözünürlüğü ile nöral devrelerin hücre tipine özgü sorgulanmasına olanak tanır. Kesin devre manipülasyonunu küresel beyin aktivitesi okumalarıyla ilişkilendiren bu yöntem, erken aşama hedef hipotezlerinde mekanistik risk azaltmayı ve öngörüsel güveni artırır. Bu yetenek, hastalık modelleri ve terapötik mekanizmalarla ilgili fonksiyonel bağlantısallığı netleştirerek portföy önceliklendirmesine yardımcı olur.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Küresel aktiviteyi yönlendirmede spesifik beyin devresi elemanlarının sorgulanmasına olanak tanıyarak terapötik hipotez testlerini destekler.
- Operasyonel Değer: Beyin dinamiklerinin yüksek uzamsal çözünürlüklü çıktısıyla birlikte hücre tipine özgü stimülasyon sağlar.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Bilimsel Değer: Devre tabanlı analiz tasarımı için, motor korteks ve talamus arası gibi uzun menzilli sinaptik bağlantıları gösteren aktivasyon haritaları oluşturur.
- Operasyonel Değer: Stimülasyon koşullarının ve ağ yanıtlarının karşılaştırılmasına olanak tanıyan kantitatif BOLD sinyal ölçümleri sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Sağlıklı ve hastalıklı durumlar genelinde, bozulmamış canlı beyinlerdeki fonksiyonel bağlantısallığı haritalandırarak hastalığa özgü sistem modellemeyi destekler.
- Operasyonel Değer: Nöronal aktivitenin non-invaziv ve tekrarlanabilir görüntülemesi yoluyla, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürecin sürekliliğini kolaylaştırır.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu yöntem; devre fonksiyonunun hipotez testlerini mümkün kılarak keşif biyolojisine, analize hazır nicel çıktılar aracılığıyla tarama süreçlerine ve hastalıkla ilgili konnektomik haritalama yoluyla translasyonel araştırmalara entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Hipotez testlerini, yolak açıklığa kavuşturma süreçlerini ve nöral hedeflerin biyolojik risklerinin azaltılmasını destekler.
- Tarama: Bileşik değerlendirmesi için assay standardizasyonu, tekrarlanabilirlik ve kantitatif BOLD okumaları sağlar.
- Analitik: Farklı koşullar arasındaki devre etkileşimlerini karşılaştırmak için hemodinamik yanıt fonksiyonu verileri ve aktivasyon haritaları sunar.
- Translasyonel Araştırma: Hastalık modellerinde tüm beyin izlemesi yoluyla preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Nörobilim keşif programları genelinde devre tabanlı hedef doğrulaması için yeniden kullanılabilir bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Öngörü güvenilirliği, hedef doğrulaması, devre tabanlı hipotezlerdeki mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Devreye özgü beyin aktivasyon haritalamanın standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: Nöropsikiyatrik programlarda daha iyi devam/durdurma kararları, sermaye verimliliği ve geç aşama biyolojik risklerin azaltılması.
- Portföy Etkisi: Devre düzeyindeki hedef etkileşimine dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirme ve ilerleme kararları.
Uygulama Hususları
- Cerrahi implantasyon ve görüntüleme alımı için nörobilim, optogenetik ve MRI fiziği konularında uzmanlık gerektirir.
- Yüksek alanlı MRI tarayıcı, lazer ışık kaynağı, fiber optik implantlar ve fizyolojik izleme sistemleri gereklidir.
- Cerrahi protokoller, ışık iletim parametreleri ve görüntüleme sekansları için ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Türler, beyin bölgeleri ve opsin ekspresyon sistemleri genelinde adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Cerrahi invazivlik, dokuda ışık saçılması ve hemodinamik sinyal yorumlama karmaşıklığı gibi pratik sınırlamaları içerir.
