2.11: Kader Haritası

Gelişim biyologları, bir organizma olgunlaşırken hücre soylarını izlemek için bir araç olarak kader haritalamasını kullanırlar. Bu, hücreleri embriyonik bir aşamada etiketleyerek ve daha sonra organizmanın gelişimi boyunca onları ve soylarını izleyerek yapılır. Kader haritalaması, gelişim sırasında hücre göçü ve farklılaşmasının yanı sıra yetişkinlik döneminde yenilenme ve onarımı incelemek için de kullanılır.

Bu video, kader haritasına genel bir bakış sağlayacak, zebra balıklarında bir kader haritası oluşturmak için kullanılan bir protokolü açıklayacak ve bu tekniğin şu anda laboratuvarlarda uygulandığı bazı yolları gösterecektir.

Prosedürel ayrıntılara geçmeden önce, bir kader haritasının ne olduğunu ve nasıl oluşturulduğunu tartışalım.

Klasik kader haritalama deneylerinde, bilim adamları, gastrula aşamasındakiler gibi erken bir embriyodaki hücre gruplarını, bu hücrelerin tüm torunlarına aktarılacak bir boya ile boyadılar. Embriyonun belirli bir süre gelişmesine izin verdikten sonra, daha olgun organizmadaki lekeli hücreleri incelediler. Olgun organizmadaki lekeli hücrelerin yeri daha sonra not edildi. Birkaç benzer deneyin bir araya getirilmiş sonuçları, kader haritası olarak bilinen bir diyagramın oluşturulmasına izin verdi.

Bu nedenle, bir kader haritası, erken bir embriyonun her bir parçasının kaderini özetleyen genel bir plandır. Bu haritalar, bilim insanlarının hangi embriyonik hücrelerin hangi işlevsel yetişkin hücrelere farklılaştığı ve olgun yapılara nasıl göç ettikleri ve organize oldukları gibi şeyleri belirlemelerine yardımcı olur.

Bilim adamları, kurbağalar, nematodlar, balıklar, civcivler ve fareler dahil olmak üzere kader haritaları oluşturmak için birçok model organizma kullandılar. Zebra balığı Danio rerio gibi bazı model organizmalar bu tür deneylerde ek bir avantaja sahiptir. Küçük olduklarından ve gelişim sürecinin çoğunda şeffaf kaldıklarından, bilim adamları balıkları ışık mikroskobu altında inceleyerek hücreleri kolayca izleyebilirler. Daha da önemlisi, hücre etiketleme tekniklerindeki ilerlemeler artık bilim adamlarının tek hücreleri hassas bir şekilde işaretlemelerine ve organizma geliştikçe onları izlemelerine izin veriyor ve bu da son derece ayrıntılı bir kader haritasının oluşturulmasına yardımcı oluyor.

Artık kader haritalarının ne olduğu hakkında bir fikriniz olduğuna göre, zebra balıklarında fotoaktivasyon kullanan kader haritalama protokolünü tartışalım. Bu nispeten yeni yaklaşım, fotoaktive edilebilir proteinlere bağlıdır. Bunlar, "kafesli" olan özel floresan proteinlerdir, yani floresanı önlemek için belirli bir konformasyonda tutulurlar. Kontrollü bir lazer darbesinin uygulanması, görünür floresan ile sonuçlanan "açma" olarak adlandırılan konformasyonel bir değişikliğe neden olur.

Bu deneyi gerçekleştirmek için, bu özel kafesli proteinler önce sentezlenir ve daha sonra bir veya iki hücre evresindeki zebra balığı embriyolarına enjekte edilir. Daha sonra, embriyoların fotoaktivasyondan önce istenen gelişim aşamasına olgunlaşmasına izin verilir.

Daha sonra, balığı fotoaktivasyona hazırlamak için, hedef dokuyu erişilebilir kılmak için embriyolar dekoryonlanır. Daha sonra, düşük erime sıcaklığındaki agaroz gibi optik olarak berrak bir ortama monte edilirler ve bu da onları güvenli bir şekilde sabit bir konumda tutar. Numuneler, ilgilenilen alanı ortaya çıkaracak şekilde hizalanır ve lazer donanımlı bir mikroskop üzerine monte edilir. İlgilenilen hücreleri içeren hedeflenen alana bir lazer darbesi uygulanır ve fotoaktivasyonu indükler.

Lazer tedavisini takiben embriyolar agarozdan dikkatli bir şekilde çıkarılır ve istenen gelişim aşamasına ulaşılana kadar doğal ortamlarına geri döndürülür. Fotoaktif hücreleri izlemek için, embriyolar tekrar düşük erime sıcaklığındaki agaroza gömülür ve fotoaktif hücreler daha sonra doğrudan floresan veya immün boyama kullanılarak görselleştirilebilir ve izlenebilir.

Artık bir kader haritalama protokolü hakkında genel bir anlayışa sahip olduğunuza göre, bu prosedürden yararlanan birkaç laboratuvar deneyine bir göz atalım.

Embriyonik gelişimi incelemeye ek olarak, olgun sistemlerde onarımı incelemek için kader haritalaması kullanılabilir. Bu deneyde, transgenik bir zebra balığı retinasından spesifik bir hücre alt tipi kesildi. Bilim adamları daha sonra, yaralanma sonrası kaderlerini belirlemek için genetik olarak etiketlenmiş yerleşik yetişkin kök hücrelerin izini sürdüler. Son olarak, yetişkin kök hücrelerin aktivasyonunu ve ardından doku onarımını gösteren görüntü analizi yapıldı.

Bilim adamları da nakledilen kök hücrelerin kaderini anlamak için benzer protokoller kullanıyorlar. Burada, genetik olarak etiketlenmiş insan embriyonik kök hücreleri veya hESC'ler, bağışıklığı baskılanmış bir fare modeline nakledildi. İmplante edilen hücrelerin 8-12 hafta boyunca farklılaşmasına izin verildi, ardından birden fazla germ katmanından doku içeren bir tümör olan ortaya çıkan teratom, implante edilen kök hücrelerin kaderini belirlemek için hasat edildi, sabitlendi ve immün olarak boyandı. Bu tür bir deney, bilim insanlarının kültürlenmiş kök hücrelerin in vivo farklılaşma potansiyelini doğrulamasına yardımcı olur.

Daha önce de belirtildiği gibi, bilim adamları memeliler de dahil olmak üzere çeşitli model organizmalarda kader haritalama prosedürleri gerçekleştirirler. Bu özel çalışmada, bilim adamları, indüklenebilir genetik yaklaşımlar kullanarak erken bir fare embriyosunun belirli bir bölgesindeki hücreleri işaretlediler. Bu, genetiği değiştirilmiş yavrular taşıyan hamile bir fareye indükleyici bir ajan uygulanarak yapılır. Etiketli hücreler daha sonraki gelişim aşamaları boyunca izlendi ve bu da bilim adamlarının nihai kaderlerini belirlemelerine yardımcı oldu.

Az önce JoVE'nin kader haritalaması hakkındaki videosunu izlediniz. Bu video, kader haritaları oluşturma konusunda bazı bilgiler sağladı, belirli bir kader haritalama protokolünü gözden geçirdi ve bu son derece kullanışlı tekniğin bazı modifikasyonlarını ve uygulamalarını tartıştı. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!