Akış Sitometrisi ile A549 Hücreleri Eklenti ve içselleştirilmesi Gribi bir virüs Ölçme

Bu prosedürün genel amacı, influenzanın bağlanmasını ve içselleştirilmesini ölçmektir. Bir virüs, 5 49 akciğer epitel hücresine parçacıklar. Bu, ilk olarak, bağlanmaya izin veren ancak viral partiküllerin alımını önleyen bir virüs olan 5 49 hücreli bir virüs olan bir ated influenza tarafından gerçekleştirilir.

Daha sonra, sıcaklığı 37 santigrat dereceye kaydırarak virüsün içselleşmesine izin verilir. Daha sonra etiketlenmemiş strp Aden'in hücre yüzeyine bağlandığı bir engelleme adımı. Bağlı virüsler, bağlı ve içselleştirilmiş viral parçacıklar arasında ayrım yapmak için gerçekleştirilir.

Son olarak, hücre ile ilişkili biyotinile virüs, CY üç etiketli streptavidin ile inkübe edilir ve lekeli virüsleri tespit etmek için akış sitometrisi kullanılır. Sonuç olarak, bağlı ve içselleştirilmiş virüslerin göreceli miktarı hesaplanır. Bu yöntem, 5 0 9 hücresine bağlanan ve içselleştiren bir virüs olan influenzanın nispi miktarı hakkında fikir verebilir.

Farklı hücre hatları veya diğer virüsler kullanılarak diğer sistemlere de uygulanabilir Biyotinile virüs ürettikten ve metin protokolüne göre etiketli virüs strep din ve SI üç etiketli strep din'in gerekli miktarlarını belirledikten sonra, her biri 200.000, A 5 49 hücre içeren dört derin kuyu tüpü hazırlayın. Sıfır dakika artı STV, 30 dakika ve 30 dakika artı STV. Sonra, tüpleri döndürün.

Süpernatanı çıkarın ve peletleri yeniden süspanse etmek için 200 mikrolitre PBS kullanın. Daha sonra tüpleri tekrar döndürdükten sonra, hücreleri yeniden süspanse etmek için 200 mikrolitre 5: 49 standart büyüme ortamı kullanın, inkübasyonu takiben 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin, numuneleri santrifüjleyin ve peletleri 200 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin Yıkamayı bir kez daha tekrarladıktan sonra, tüpleri 10 dakika buz üzerinde soğutun. Tüpler soğuduğunda, tekrar döndürün ve bir saat buz üzerinde inkübe ettikten sonra peletleri yeniden süspanse etmek için enfeksiyon PBS'de seyreltilmiş 100 mikrolitre biyotinile virüs kullanın, sıkmayı tekrarlayın ve PBS ile iki kez yıkayın, aşağıdaki numuneleri sıfır dakika numuneleri için mümkün olduğunca paralel olarak işleyin.

Döndürme işleminden sonra, hücre peletini yeniden süspanse etmek için 100 mikrolitre %3.7 paraform aldehit veya PFA kullanın. Döndürmeden önce oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin ve fiksasyondan sonra hücreleri iki kez yıkamak için PBS kullanın. Tüm numuneler işlenene kadar dört santigrat derecede saklayın.

Sıfırıncı dakika artı STV örneklerini tedavi etmek için, tüpleri döndürün, süpernatanı çıkarın ve hücre peleti inkübatını 30 dakika boyunca buz üzerinde yeniden süspanse etmek için PBS'de 15 mikrolitre STV% 2 BSA ve% 0.1 sodyum azi kullanın. Daha sonra santrifüjleyin ve PFA ile fiksasyondan sonra hücreleri iki kez yıkamak için PBS'yi kullanın, tıpkı 30 dakikalık numuneler için numuneleri dört santigrat derecede kapıda gösterildiği gibi. Süpernatı döndürdükten ve çıkardıktan sonra, numuneleri çözmek için PBS %2 BSA kullanın.

PBS ile yıkamadan ve PFA ile sabitlemeden önce 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra numuneleri 30 dakika artı STV numuneleri için dört santigrat derecede saklayın. Peletlemeden sonra, numuneleri 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe ettikten sonra 200 mikrolitre PBS% 2 BSA içinde süspanse ediyoruz.

PBS'de hücreleri 50 mikrolitre STV %2 BSA %0.1 Sodyum azi içinde döndürün ve yeniden süspanse edin, yıkamadan ve sabitlemeden önce 30 dakika ICE üzerinde inkübe edin. Daha sonra tüm numuneleri geçirgen hale getirdikten ve STV SI üç ile boyadıktan sonra, metin protokolündeki ayrıntıları takip ederek numuneleri dört santigrat derecede saklayın. Son olarak, numuneleri akış sitometrisi ile analiz edin.

Her numunedeki CY üç pozitif hücrenin yüzdesini belirleyin. Bağlı virüsün yüzdesini ve içselleştirilmiş virüsün göreceli miktarını hesaplayın. Burada sıfır dakika örneğinde gösterildiği gibi metin protokolüne göre, ated virüsü, St.V.SI üç boyama ile görselleştirildiği gibi hedef hücrelere soğuk bağlanır.

STV bir bloke edici adım olarak uygulandığında, hücre yüzeyindeki virüs artık S St.V.SI üç boyama ile tespit edilemez ve sinyali güçlü bir şekilde azaltır. Sıcaklık 37 santigrat dereceye yükseldiğinde, bağlı virüs hücrelere alınır. İçselleştirilmiş virüs, etiketlenmemiş STV ile blokaja duyarlı değildir, bu da 30 dakika artı gösterilen STV örneklerinde sinyal yoğunluğunda daha az dramatik bir düşüşe neden olur.

İşte bu videoda açıklanan tüm deneysel koşullar için SI üç pozitif hücrenin yüzdeleri. Sahte enfekte olmuş hücreler, deney için arka plan sinyal yoğunluğunu verir ve virüs bağlanması için negatif bir kontrol görevi görür. Başka bir kontrol nöraminidaz, tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla IAV bağlanmasını% 90 oranında güçlü bir şekilde ortadan kaldırır.

Bir TP'yi tüketen ve böylece endositozu inhibe eden sodyum azi, burada gösterildiği gibi, enfeksiyon sırasında ve sonrasında virüs partiküllerinin içselleştirilmesini inhibe etti, sodyum azi tedavisinin ardından 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edilen hücreler, aynı koşullar altında inkübe edilen tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla içselleştirmede dramatik bir düşüş gösterdi. Bu videoyu izledikten sonra, 5 0 9 hücreli bir virüs olan influenzanın bağlanma ve içselleştirilmesini nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu protokol, akış sitometrisi ile uygun okumaya izin verir ve diğer deneysel ortamlara kolayca uyarlanabilir.