Name: Membran Transport Tek Protein çözünürlükte Oldukça Paralel nanopore çip Sistemi Analiz Süreçleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Öğrenin, nanopore çip sistemi kullanarak tek protein çözünürlüğünde membran transport analiz yöntemlerini. Bu yüksek paralellikteki teknik, membran proteinlerinin iletkenlik ve transport davranışlarını inceleme olanağı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Barbara Windschiegl'e SÇP'lerin oluşturulmasındaki yardımı için teşekkür ederiz; NanoCalcFX yazılımı üzerindeki çalışmaları için Dennis Remme'ye ve el yazması hakkında yararlı önerileri için Alina Kollmannsperger, Markus Braner ve Milan Gerovac'a teşekkür ederiz. DFG ve Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı tarafından R.T.'ye sağlanan Alman-İsrail Proje İşbirliği (DIP) ve Federal Ekonomi ve Teknoloji Bakanlığı (ZIM Ar-Ge Projesi) R.T. ve Nanospot GmbH'ye sağlanan bu çalışmayı destekledi.

<ol><li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-target+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Drug-target network.</a> Nat Biotechnol. 25, 1119(2007).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Osaki, T., Suzuki, H., Le Pioufle, B., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multichannel+simultaneous+measurements+of+single-molecule+translocation+in+%CE%B1-hemolysin+nanopore+array%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Multichannel simultaneous measurements of single-molecule translocation in α-hemolysin nanopore array.</a> Anal. Chem. 81, 9866-9870 (2009).</li>
<li>Carrillo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+membrane+capacitance+measurements+for+studying+endocytosis+and+exocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">High-resolution membrane capacitance measurements for studying endocytosis and exocytosis in yeast.</a> Traffic. , (2015).</li>
<li>Giacomini, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+transporters+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Membrane transporters in drug development.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 9, 215-236 (2010).</li>
<li>Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+membrane+protein+inhibition+by+optical+ion+flux+in+a+droplet+interface+bilayer+array%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 3134-3138 (2012).</li>
<li>Zollmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+liposome+analysis+of+peptide+translocation+by+the+ABC+transporter+TAPL%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single liposome analysis of peptide translocation by the ABC transporter TAPL.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 2046-2051 (2015).</li>
<li>Tamm, L. K., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Supported phospholipid bilayers.</a> Biophys. J. 47, 105-113 (1985).</li>
<li>Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membranes%3A+scientific+and+practical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supported membranes: scientific and practical applications.</a> Science. 271, 43-48 (1996).</li>
<li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+supported+lipid+bilayers%3A+From+biophysical+studies+to+sensor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design.</a> Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).</li>
<li>Wagner, M. L., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+polymer-supported+planar+lipid+bilayers+for+reconstitution+of+integral+membrane+proteins%3A+silane-polyethyleneglycol-lipid+as+a+cushion+and+covalent+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker.</a> Biophys. J. 79, 1400-1414 (2000).</li>
<li>Naumann, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymer-supported+phospholipid+bilayer%3A+tethering+as+a+new+approach+to+substrate-membrane+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">The polymer-supported phospholipid bilayer: tethering as a new approach to substrate-membrane stabilization.</a> Biomacromolecules. 3, 27-35 (2002).</li>
<li>Weiskopf, D., Schmitt, E. K., Klühr, M. H., Dertinger, S. K., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-BLMs+on+highly+ordered+porous+silicon+substrates%3A+Rupture+process+and+lateral+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Micro-BLMs on highly ordered porous silicon substrates: Rupture process and lateral mobility.</a> Langmuir. 23, 9134-9139 (2007).</li>
<li>Watanabe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrayed+lipid+bilayer+chambers+allow+single-molecule+analysis+of+membrane+transporter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity.</a> Nat. Commun. 5, (2014).</li>
<li>Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Microarrays+of+Attoliter+Molecular+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 115, 5738-5741 (2003).</li>
<li>Lohr, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Liposomes+Used+to+Study+the+Activity+of+Individual+Transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single Liposomes Used to Study the Activity of Individual Transporters.</a> Biophysical Journal. 106, 229a(2014).</li>
<li>Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+electrophysiology%3A+an+emerging+paradigm+for+ion-channel+screening+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and physiology.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 358-368 (2008).</li>
<li>Milligan, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robotic+multiwell+planar+patch-clamp+for+native+and+primary+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Robotic multiwell planar patch-clamp for native and primary mammalian cells.</a> Nat. Protoc. 4, 244-255 (2009).</li>
<li>Soga, N., Watanabe, R., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attolitre-sized+lipid+bilayer+chamber+array+for+rapid+detection+of+single+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Attolitre-sized lipid bilayer chamber array for rapid detection of single transporters.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li>
<li>Kleefen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+parallel+single+transport+recordings+on+nanopore+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiplexed parallel single transport recordings on nanopore arrays.</a> Nano Lett. 10, 5080-5087 (2010).</li>
<li>Wei, R., Gatterdam, V., Wieneke, R., Tampé, R., Rant, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+sensing+of+proteins+with+receptor-modified+solid-state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores.</a> Nat. Nanotechnol. 7, 257-263 (2012).</li>
<li>Urban, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+transport+recordings+on+a+membrane-on-nanopore+chip+at+single+molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Highly parallel transport recordings on a membrane-on-nanopore chip at single molecule resolution.</a> Nano Lett. 14, 1674-1680 (2014).</li>
<li>Kusters, I., Van Oijen, A. M., Driessen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-on-a-Chip%3A+Microstructured+Silicon%2FSilicon-Dioxide+Chips+for+High-Throughput+Screening+of+Membrane+Transport+and+Viral+Membrane+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Membrane-on-a-Chip: Microstructured Silicon/Silicon-Dioxide Chips for High-Throughput Screening of Membrane Transport and Viral Membrane Fusion.</a> ACS Nano. 8, 3380-3392 (2014).</li>
<li>Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+directed+intrinsic+membrane+protein+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Lipid directed intrinsic membrane protein segregation.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 17294-17297 (2013).</li>
<li>Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Micrometer-Sized+Free-Standing+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Preparation of Micrometer-Sized Free-Standing Membranes.</a> ChemPhysChem. 12, 2568-2571 (2011).</li>
<li>Lazzara, T. D., Carnarius, C., Kocun, M., Janshoff, A., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+attoliter-sized+compartments+using+fluid+pore-spanning+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Separating attoliter-sized compartments using fluid pore-spanning lipid bilayers.</a> ACS nano. 5, 6935-6944 (2011).</li>
<li>Winterhalter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Black+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Black lipid membranes.</a> Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 5, 250-255 (2000).</li>
<li>Koçer, A., Walko, M., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+utilization+of+reversible+and+irreversible+light-activated+nanovalves+derived+from+the+channel+protein+MscL%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Synthesis and utilization of reversible and irreversible light-activated nanovalves derived from the channel protein MscL.</a> Nat. Protoc. 2, 1426-1437 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

Burada sunulan teknik membran proteini ulaşım son derece paralel analiz sağlar. Sulandırılmış membran proteini sistemleri doğrudan teorik her zar taşıyıcı uyarlanmasını yapmadan veya olası kanala, Biochip uygulanabilir. Taşıma analizi sadece doğrudan floresans değişimi (fluorophores translokasyon veya floresan etiketli substratlar) ya da dolaylı olarak floresans değişimi (pH&#39;a duyarlı boyalar, sekonder enzimatik reaksiyonlar) yoluyla, bir flüoresan okuması sisteminin kurulması ile sınırlıdır. İkincisi ise henüz tam ...

membran proteinlerinin analizi son 20 yılda temel ve ilaç araştırmaları için artan ilgi haline gelmiştir. yeni ilaçların geliştirilmesi halen kısıtlayan faktörlerden biri olan tanımlanması ve yeni hedefler detaylı karakterizasyonu bağlıdır. Tüm ilaç hedefleri yaklaşık% 60 zar proteinleri 1 olması, tekniklerin geliştirilmesi fonksiyonları önemli aydınlatmak için yapar. 4 - Geçmişte, electrogenic kanalları ve taşıyıcıları çalışma teknikleri 2 sayıda geliştirilmiştir. Aksine olmayan electrogenic yüzeyler daha zorlu bir görev sunuyoruz. Onlar kaskadlar 5 sinyal kilit reseptörler olarak hücre zarı ve fonksiyonu üzerinde çözünen ve besin akışını kontrol gibi onlar, ancak ana ilaç hedefleri olarak özel bir öneme sahiptir. Önemli çaba t gelişimi girmiştirtekniki membran transport proteinleri 6, 7 işlevini incelemek için. Birkaç isim katı desteklenen lipid bilayers, gergin bilayers 11, 12, microblack lipit membranlar 13, 14 ve yerli vezikül dizileri 15, 16 olmak üzere 10, - Katı destekli membranlar kullanılarak Sistemleri bu alanda 8 olarak en umut verici araçlar ortaya çıkmıştır. Bazıları ticari kurulumları 17, 18 hatta mevcuttur. Bazı örnekler son derece paralel bir şekilde 14, 19, tarama uygulamaları için bir ön koşul olarak, tek zar proteinleri çalışma yeteneği birleştiren yayınlanmıştır. Ancak, bu yöntemler nadiren endüstriyel ortamlarda temel araştırma köprü. güçlükler çoğu otomatikleştirilebilir için sistemin özelliği, yüksek maliyetli üretim ve / veya zahmetli hazırlanmasında uzanmaktadır. Bir yaklaşım oYukarıda açıklanan tüm engelleri aşılabilir nihai amaçtır. 22 - Burada sunulan teknik tek bir protein düzeyinde 20 kontrollü bir ortamda in vitro membran kanalları ve taşıyıcıları incelemek için geliştirilmiştir. 26 ya da siyah lipit membranlar 27 - luvs içine saflaştırılmış membran proteinlerinin Sulandırma daha GUVs 23 karşılaştırılabilir yaklaşımlara göre kurulmuştur. Direkt olarak iki katmanlı oluşum şeklinde kendini montaj işlemi ile gerçekleşiyor yonga yüzeyi, uygulanabilir. Nano-gözenekli çip (Şek. 1) ve cam alt tasarım sistemi basit otomasyon izin hava mikroskopi için izin verir. motorlu bir sahne ile birlikte çoklu cips analiz için mühürlü boşlukların binlerce içeren görüş her alanı ile aynı anda ölçülebilir. Şekil 1. Çoklanmış nanopore bioçipler tasarımı. A) silikon üzerinde yalıtkan (SOI) gofret reaktif iyon dağlama ile yapılandırılmıştır. Yaklaşık 1,150 ayrı cips aynı özellikleri ve kalite. B) Her çip nano delikler ile 250.000 bireysel, mikro içermektedir her gofret imal edilmektedir. Ölçek çubuğu:. 200 mikron C) Her oyuk multi-spektral floresan okuma-out üzerinden adreslenebilir. Ters floresan mikroskobu. D) Atomik kuvvet mikroskobu ile biyoçip uyumlu hale bir şeffaf üst tabaka blokları tampon hazneden floresan sinyalleri (AFM) görüntüleme eşit (gözenek açıklıkları ve 3.6 nm silikon dioksit tabakasının yüzey pürüzlülüğü düzenlenmiş ortaya koymaktadır n = vezikül füzyon 40) optimum. Ölçek çubuğu:. 5 mikron E) Taramalı elektron mikrofonfloroskop (SEM) görüntüsü silikon çip içinde femtoliter boşluklara erişim sağlayan nano-gözeneklere enine kesitini göstermektedir. Bu rakam 21 izni ile yeniden yapıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53373/53373fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Tüm veri analizi, son kullanıcılar için sınırsız erişim sağlamak için ücretsiz kullanarak gerçekleştirilir. Zaman serisi ücretsiz görüntü işleme yazılımları ve özel bir yapı eğrisi analiz yazılımı sağlayan toplu işleme ve eğrilerin çoklu floresan kanalları ve binlerce büyük veri kümelerinin basit korelasyon kullanılarak analiz edilmektedir. Bu protokolde kullanılan model proteini E. türetilen büyük iletkenlik (MSCL) kanal proteinin mechanosensitive kanal E. coli. Doğada ozmotik şok serbest bırakmak için bir valf olarak davranır, fakat rasyonel SYNT tasarlanmış bir şekilde değiştirildiinfographie işlevleri kovalent kanal daralma tarafına monte edilebilir. Nano-valf oluşturarak kanal açmak için tetiklenir kovalent bağlı aktivatör (MTSET) şarj-itme Via. iyonları, su, küçük proteinler, aynı zamanda küçük fluorophores gibi küçük moleküller kanalından nüfuz edebilir. Burada, bir protein, protein aracılı translokasyon algılamak üzere yeteneğini göstermek için bir model olarak kullanılır.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Reaktif< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>[2- (Trimetilamonyum) etil] metanetiyosülfonat</td><td>Toronto Araştırma Kimyasalları A.Ş.</td><td>T792900</td><td>MTSET; su ile hidrolize edilir. Tamponda çözündükten hemen sonra (30 dakika) -80 ° C'de kuru pouder aliquot olarak saklayın.</td></tr><tr><td>1 ml gaz geçirmez şırınga</td><td>Hamilton</td><td>#1001</td><td></td></tr><tr><td>10 ml yuvarlak şişe</td><td>Schott Duran</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,7 mm cam boncuk</td><td>Roth</td><td>N032.1</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanole</td><td>Roth</td><td>9866.5</td><td></td></tr><tr><td>30 cm Luer-Lock Uzatma Tüpü</td><td>Sarstedt</td><td>744304</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Roth</td><td>5025.5</td><td></td></tr><tr><td>Biyo-Boncuk SM-2 Adsorban</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920'nin</td><td>ilk kullanımdan önce etkinleştirilmesi gerekir</td></tr><tr><td>CaCl2 Dihidrat</td><td>Roth</td><td>HN04.3</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td>-20 ° C'de koyu saklayın; C</td></tr><tr><td>Kloroform reaktif sınıfı</td><td>VWR Kimyasalları</td><td>22711324</td><td></td></tr><tr><td>DOPE ATTO390</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 390-165</td><td>-20 ° C'de koyu saklayın; C</td></tr><tr><td>Etanol mutlak</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205</td><td></td></tr><tr><td>Injekt Tek kullanımlık şırınga</td><td>Braun</td><td>460 60 51V</td><td></td></tr><tr><td>Injekt-F tek kullanımlık şırınga</td><td>Braun</td><td>91 66 017V</td><td></td></tr><tr><td>Keck klipsleri</td><td>Schott</td><td>KC29</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-Fosfatidilkolin, %20 (Soya)</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>5416016</td><td>-20 °C'de inert gaz altında saklanır; C</td></tr><tr><td>NaCl %99,5 yıllık</td><td>Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Nanopore E100 gofret/cips</td><td>Mikromotor (Mainz/Almanya)</td><td></td> <td>istek üzerine temin edilebilir</td></tr><tr><td>Nucleopore Track-Etch Membran 0.4 & m</td><td>Whatman</td><td>800282</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)</td><td>life Technologies</td><td>D-7173</td><td>-20 &°C'de karanlık mağaza C</td></tr><tr><td>Oy647</td><td>Luminartis (M&uuml; nster / Almanya)</td> <td>OY-647-T-1mg</td><td>-20 ° C'de koyu mağaza; C</td></tr><tr><td>Rotilabo-şırınga filtrasyonu, steril olmayan, gözenek boyutu 0.22 ve mikro; m</td><td>Roth</td><td>P 818.1</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5080</td><td>boyut dışlama kromatografisi için kolon malzemesi</td></tr><tr><td>Silastic MDX4-4210</td> Kapak <td>camı desteğine talaş sabitlemek için</td><td>Dow Corning</td><td></td> kürleme maddesi</tr><tr><td>yapışkan-Slayt 8 kuyulu</td><td>ibidi</td><td>80828</td><td>cam kızaklara montaj için çok kuyulu hazne (talaş tutucu)</td></tr><tr><td>Üç musluk mavisi</td><td>Sarstedt</td><td>744410001</td><td></td></tr><tr><td>Tris Pufferan %99,9 Ultra Kalite</td><td>Roth</td><td>5429.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0.2 & mikro; m selüloz nitrat membran filtre</td><td>Roth</td><td>NH69.1</td><td></td></tr> <tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B & uuml; chi 461 su banyosu</td><td>B&uuml; </td><td></td><td></td>chi</tr><tr><td>B&uuml; chi Rotavapor RE 111</td><td>B&uuml; </td><td></td><td></td>chi</tr><tr><td>Cary Eclipse Floresan Spektrometresi&nbsp;</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiposoFast Mini Ekstruder</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membran pompası&nbsp;</td><td>Vaccubrand</td><td>15430</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight Nanopartikül İzleme Mikroskobu</td><td>Malvern / Nanosight</td><td>LM 14C</td><td></td></tr><tr><td>NyONE mikroskop</td><td>Synentec</td><td></td><td>istek üzerine temin edilebilir</td></tr><tr><td>Pompa kontrolü</td><td>Vaccubrand</td><td>CVC 2II</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator banyosu Sonorex RK100H</td><td>Brandelin elektronik</td><td>31200001107477</td><td></td></tr><tr><td>Vakum pompası RC5</td><td>Vaccubrand</td><td>1805400204</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu W13</td><td>Haake</td><td>002-9910</td><td></td></tr><tr><td>Plazma Temizleyici PDC-37G</td><td>Harrick Plazma</td><td>PDC-37G</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Açık Kaynak</td><td></td> <td>http://imagej.nih.gov/ij/ bilimsel görüntü işleme yazılımı</td></tr><tr><td>NanoCalcFX</td><td>Freeware</td><td>http://sourceforge.net/projects/nanocalc/</td> <td>büyük taşıma kinetik veri kümeleri için veri analizi/değerlendirme yazılımı</td></tr><tr><td>NTA 2.3 Analitik Yazılım</td><td>Nanoparçacık takibi için Nanosight</td><td></td><td>veri toplama ve analiz yazılımı mikroskop</td></tr><tr><td>NTA 2.3 Sıcaklık İletişimi</td><td>Nanopartikül izleme mikroskobu için Nanosight</td><td></td><td></td> sıcaklık kontrol yazılımı</tr></tbody></table>

membran transport tek protein çözünürlükte oldukça paralel nanopore çip sistemi analiz süreçleri

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

transloke substrat olmayan electrogenic ise tek bir protein düzeyinde membran proteini taşıma hala detaylı analizler kaçıyor. Kaydadeğer çaba bu alanda yapılmış, ancak zar taşıyıcıları analizi için gerekli olan solvent içermeyen çift katlı lipid teknikleri ile birlikte otomatik yüksek verimli taşıma analizi sağlayan teknikler nadirdir. taşıyıcıların Bu sınıf, ancak hücre homeostazında önemli ve bu nedenle ilaç geliştirme ve yeni anlayışlar kazanmak için metodolojiler önemli bir hedef umutsuzca ihtiyaç olduğunu. Burada sunulan el yazması tek taşıyıcı çözünürlükte membran proteini aracılı taşıma süreçlerinin analizi için yeni bir Biochip kurulmasını ve kullanımını açıklar. biyoçip tasarımında oldukça paraleldir ve endüstriyel cins ve miktarda üretilebilir nanopores çevrelediği, mikro boşlukların üst oluşmaktadır. Protein Barınma lipozomlar doğrudan uygulanabilirSSM-teknikleri kullanarak kendini monte gözenek kapsayan çift katlı lipit katmanını oluşturan yonga yüzeyi (katı lipid membranlar desteklenir). membran parçaları, müstakil içine veya gerçek zamanlı multi-spektral floresan okuma ile takip edilebilir kavite alanı, dışarı substrat translokasyonu için arayüz sağlıyor Gözenek kapsayan. standart operasyon prosedürleri (SOP) kurulması işlevsel yeniden olabilir hemen hemen her membran proteini çip yüzeyinde protein barındıran lipit tabakalarının kolay kurulmasını sağlar. tek ön şart olmayan electrogenic taşıma yüzeyler için bir floresan okuma-out sistemi kurulmasıdır. Yüksek içerik tarama uygulamaları paralel olarak birden fazla fiş kayıt otomatik ters floresan mikroskop kullanılarak accomplishable vardır. Büyük veri kümeleri serbestçe kullanılabilir özel tasarlanmış bilgisayar programları kullanılarak analiz edilebilir. Üç renkli çoklu spektral floresanOkuması ayrıca yanlış pozitif sonuçlar ortadan kaldırarak, farklı olay sınıflarına tarafsız veri ayrımcılık sağlar. Chip teknolojisi şu anda SiO 2 yüzeylere göre, ama altın kaplamalı yonga yüzeyleri kullanılarak daha fonksiyonlandırmalar da mümkündür edilir.

Gözenek kapsayan zarlar kolayca kendi kendine monte şekilde nano yapılı çip yüzeyinde oluşturulabilir. Ancak altta yatan süreç hala hassas ve lipozom boyutu, lipozom nüfus, lameller, lipid-ve tuz konsantrasyonu ve kimyasal yüzey özelliklerinin monodispersiteye gibi birçok parametrede tarafından etkilenir. Bu parametrelerin çoğu dikkatle, özelliği yukarıdaki protokol standardize edilmiştir. Ancak her yeni hazırlanması sırasında kontrol edilmelidir Diğer parametreler, başarılı bir deney sa...

Sunulan protokol, gözenekleri kapsayan solvent içermeyen lipid çift katmanları kullanılarak tek taşıyıcı seviyesinde membran protein aracılı taşımanın analizini açıklar. Bu, yüksek derecede paralel veri toplama ve analizi ile birleştirilen toplu olarak üretilen nanopor dizi çiplerinin oluşturulmasıyla elde edilir ve gelecekte membran protein efektör taramalarının kurulmasını sağlar.

Membran Transport Tek Protein çözünürlükte Oldukça Paralel nanopore çip Sistemi Analiz Süreçleri

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Bu nano-yapı çip tabanlı platformun genel amacı, membran proteini fonksiyonlarını tek moleküler düzeyde ve yüksek derecede paralel bir şekilde analiz etmektir. Tekil proteinleri çözümleme yeteneği sayesinde, membran transportu ve akısına ilişkin yeni içgörüler elde edilmektedir. Bu yöntem, özellikle elektrojene olmayan kargoya sahip olanlar başta olmak üzere, tekil kanalların veya taşıyıcıların iletkenliği veya transport davranışı gibi membran proteini alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin temel avantajı, yüz binlerce nanopor içeren nano-yapılı çip tasarımından kaynaklanan yüksek paralelliği ve taşıma olaylarının floresan okumasıdır. Bu tekniğin etkileri, membran proteinleri için etkili kütüphanelerin en iyi assaylerinin oluşturulmasına kadar uzanmaktadır. Çünkü çip tabanlı platform, oldukça paralel ve otomatik taşıma kaydı yapılmasına olanak tanır.Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler sunulan tekniği nasıl uygulayacaklarını hızla öğreneceklerdir. Odak noktası, ilgilenen herkesin benimseyebileceği kullanıcı dostu bir analiz oluşturmak olmuştur. Bu membran transport analizi, reaktif iyon aşındırma yöntemiyle tasarlanmış, yalıtılmış tabaka üzerinde silikon bir gofret kullanmaktadır.Her bir gofretten yaklaşık 1.000 analiz çipi üretilir. Her bir çip 250.000 mikroboşluk içerir. Bu boşluklar, ilgilenilen taşıma proteinlerini içeren lipid çift tabakaları ile mühürlenir.Membran, sensör arayüzünü oluşturur. Başlangıçta, floresan materyaller, lipid çift katmanının tek bir tarafında, yani oluştukları lipozomların iç kısmında yer alır. Her bir boşluk, multispektral floresan okuması aracılığıyla adreslenebilir.Opak bir üst katman, tampon rezervuarından gelen floresan sinyallerini engelleyerek biyochipi ters floresan mikroskoplarla uyumlu hale getirir. Atomik kuvvet mikroskopisi kullanılarak, silikon dioksit katmanının düzgün düzenlenmiş gözenek açıklıkları ve yüzey pürüzlülüğünün, vezikül füzyonu için optimal olan 3.6 nanometre olduğu ölçülmüştür. Taramalı Elektron Mikroskopisi, silikon çip içindeki femtolitre boşluklara erişim sağlayan bir nanoporun kesitini göstermektedir.Bu video, proteolipozomların hazırlanmasını, analiz için çiplerin hazırlanmasını ve temel analiz yürütme sürecini göstermektedir. Etanolle yıkanmış yuvarlak tabanlı bir balonu döner evaporatöre bağlayın. Balonun cam duvarında homojen bir lipid film tabakası oluşturmak için lipid filmini 300 millibar basınçta, 30 °C su banyosu sıcaklığında ve maksimum dönme hızında 40 dakika boyunca kurutun.Ardından, yüksek vakumlu bir pompa kullanarak lipid filmini oda sıcaklığında 30 dakika daha kurutun. Daha sonra, multilamellar veziküller oluşturmak için balona beş mililitre tampon çözelti ve etanolle yıkanmış sekiz adet cam boncuk ekleyin. Balonu döner evaporatöre bağlayın ve vakum uygulamadan 50 °C'de maksimum hızda döndürün.45 dakika sonra, çözelti sütlü bir görünüm alacak ve çeperlerde artık lipid filmi kalmayacaktır. Balonu inert gaz altında bir ultrasonik banyoya aktarın ve oda sıcaklığında dört dakika boyunca sonikasyona tabi tutun. Sonikasyon, lipozomları parçalayarak onları unilameller hale getirir.Şimdi LUV solüsyonunu bir mililitrelik alikotlara ayırın ve sıvı azot ile 40 °C su banyosu kullanarak beş dondurma-çözme döngüsü gerçekleştirin. Bu işlem lipozomların yırtılmasına, yeniden düzenlenmesine ve büyümesine yol açar. Son dondurma adımında, tüm örnekleri -80 °C'de saklayın.Bir LUV alikotunu yeniden oluşturmadan önce, alikotu bir mini-ekstrüder kullanarak 400 nanometre polikarbonat filtre membranından 17 kez geçirerek lipozomları ekstrüde edin. Ardından, çözeltide %0,25 konsantrasyon sağlamak için %4 Triton X-100 ekleyerek LUV'ları destabilize edin. Karışımı 50 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin.Şimdi, bir birim saflaştırılmış, modifiye edilmiş MscL'yi 20 birim deterjanla doyurulmuş lipozomla karıştırın ve inkübasyona 30 dakika boyunca devam edin. İnkübasyonun ardından, 100 microliter'lık bir alikot alın ve bir hacim 30 millimolar kalsin ekleyin. Bu karışımı 50 degrees Celsius sıcaklıkta beş dakika boyunca inkübe edin.Şimdi, kalsinasyon uygulanmış ve uygulanmamış numunelerdeki deterjanı uzaklaştırın. Her birine Tris tamponunda ıslatılmış bio-bead'ler ekleyin ve bir döner tabla üzerinde dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Deneyden önce, bir hazırlığı aktivite analizi kullanarak test edin.Başlamak için, elastomer bazını kürleme ajanına karıştırın ve karışımı tamamen kurutun. Yapıştırıcı, hazır olduğunda 30 dakika içinde kullanılmalıdır. Bu sırada, gerekli önlemleri alarak, bir cam şırınga yardımıyla uygulanan beş mililitre kloroform ile bir lamel camı temizleyin ve lamelin kurumasını bekleyin.Şimdi, 10 µL'lik bir pipet kullanarak hazırlanan yapıştırıcıyı lamel üzerine damlatın. Ardından, ince cımbız yardımıyla wafer board üzerinden dikkatlice bir çip alın. Çipin kaplı yüzeyi yukarı bakacak şekilde yapıştırıcının üzerine yerleştirin ve yapıştırıcıyı eşit şekilde dağıtmak için çipi lam üzerine hafifçe bastırın.Alt kısımda hava kabarcığı kalmadığından veya çip üzerine herhangi bir yapıştırıcı bulaşmadığından emin olun. Ayrıca, düzeneği sekiz odacıklı lam tutucuya sığacak şekilde hazırlayın. Şimdi düzenekleri bir kabin kurutucuda 65 °C'de iki saat boyunca kurutun.Daha sonra, çipler üzerindeki koruyucu tabakayı 54 °C'de birkaç solvent yıkamasıyla temizleyin. Öncelikle monte edilmiş çipleri bir lam tutucuya yerleştirin. Ardından, çipleri her biri 10 dakika sürecek şekilde üç ayrı solvent banyosunda inkübe edin.İzopropanol, aseton ve izopropanol. Ardından, çipleri ultra saf su ile dikkatlice ve iyice yıkayın. Çipleri hafif bir nitrojen gazı akımı altında kurutarak işlemi tamamlayın.Şimdi, sekiz kuyucuklu yapışkan bir lam hazırlayın ve tezgahın üzerine ters şekilde yerleştirin. Ardından, kapatma lamlarını, çipler kuyucuklara bakacak şekilde dikkatlice kaldırıp yapışkan lamın üzerine bastırın. İşleme devam etmeden önce düzeneğin birkaç dakika dinlenmesini bekleyin.Translokasyon deneyi ile devam etmeden önce, metin protokolünde açıklandığı üzere çip düzeneğini iyice yıkayın ve işlemi Tris tampon banyosu ile tamamlayın. Ardından, banyo solüsyonunu 5 mM kalsiyum klorür ve 1 µM Oy647 boyası içeren DOPE'li Tris tamponu ile değiştirin. Sonrasında, çip haznesine nihai konsantrasyonu 1 mg/mL olacak şekilde proteolipozomlar ekleyin ve bir saat bekleyin.Bir saat sonra, çipleri dört kez 400 µL kalsiyum içermeyen Tris tamponu ile durulayın. Şimdi, her bir kuyucuğa kontrol boyasını beş µM olacak şekilde ekleyin ve analize geçin. Ardından, çip tutucuyu epifloresan mikroskoba yerleştirin ve mikrokoviteleri bulmak için nanopore çipinin kenarına odaklanın.Mikrokaviteler odaklandığında, nanopor dizisini en yüksek tavan oranını gösteren bir bölge için tarayın. Detaylar metin protokolünde verilmiştir. Lipozomlar hazırlanmış, boyut dağılımları ve dispersiyonları kontrol edilmiştir.Hazırlanan lipozomların, analiz için temel bir gereklilik olan, gözenek çapından daha büyük olması sağlanmıştır. Monodispers lipozomlar da tercih edilen bir durumdur. Deneyden önce, lipozom hazırlığındaki modifiye MscL proteini, bir floresan sönümlemesinin giderilmesi (dequenching) analizi kullanılarak kontrol edilmiştir.Aktif modifiye MscL içeren lipozomların oranı, translokasyon deneyine devam etmek için yeterliydi. Biyochip üzerinde, modifiye MscL kanalı aracılığıyla floresan bir hedefin çözünük translokasyonu gözlemlendi. Elektrostatik itme yoluyla mühendislik ürünü MscL kanallarını açmak için kimyasal modülatör MTSET kullanıldı.Kavite alanı içindeki floresansın ardından meydana gelen azalma izlendi. Bu sürecin, oldukça tutarlı eflluks olayları ile yüksek derecede tekrarlanabilir olduğu kanıtlandı. Elde edilen eflluks eğrileri, tek kanallı veya çok kanallı translokasyon olaylarına karşılık gelen iki belirgin popülasyonda kümelendi.Sistem, gerçek zamanlı analiz ile üç farklı floresan boyayı takip edebilmiştir. Bu durum; pozitif sonuçların, mono-eksponansiyel eflluks olaylarının, karmaşık kinetiklerin, lipid sızıntılarının ve membran yırtılmalarının hassas bir şekilde ayırt edilmesini kolaylaştırır. Uzmanlaşıldığında bu teknik; çip hazırlama, örnek hazırlama, görüntüleme ve analiz şeklinde ardışık adımlarla uygulanabilir, bu da tüm protokolü modüler hale getirir.

membrane-transport-processes-analyzed-highly-parallel-nanopore-chip

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tek molekül mikroskopi, nükleer taşıma yeni bakış açıları sağlanan Yaklaşım.

Tek Molekül Görüntüleme Nükleer Ulaştırma

Inorganik bir yüzeye proteinlerin non-spesifik adsorpsiyon izlemek için solid-state nanopores kullanarak bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak ve tek-molekül düzeyinde probed olması adsorpsiyon için izin, rezistif-pulse prensibi kullanmaktadır. Tek bir protein adsorpsiyon süreci denge noktasından uzak olduğu için, kantitatif protein adsorpsiyonu sabit görünen birinci dereceden reaksiyon hızı belirlenmesi yanı sıra ve Langmuir adsorpsiyon sabit sağlayan sentetik nanopores...

Solid-state Nanopores ile izlenmesi Protein Adsorpsiyon

Biyomoleküler translokasyon deneyler için çözelti içinde katı-hal nanopores hazırlanması için bir yöntem sunulmuştur. Yüksek elektrik alanların kısa darbeleri uygulayarak, nanopore çapı kontrollü subnanometer hassasiyetle genişlemiş olabilir ve elektriksel gürültü karakteristikleri önemli ölçüde geliştirilmiş. Bu prosedür, deney koşulları altında, standart laboratuar ekipmanı kullanılarak yerinde gerçekleştirilir.

Boyutu ince ayar ve Solid-state nanopores Gürültü en aza indirmek

Burada, ayrı metal oksijen kümeleri, polyoxometalates (POMs), biyolojik nanopore tabanlı elektronik platform kullanarak tek molekül limitinde tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, bu moleküllerin çalışmada kullanılan geleneksel analitik kimya araçlarına tamamlayıcı bir yaklaşım sağlar.

Tek metalik nanopartiküller yüksek çözünürlüklü fiziksel karakterizasyonu

Burada, proton translocation moleküler mekanizması tek lipozomlar, lipid membranlar üzerinde çalışmak için bir protokol sitokrom bo3  örnek olarak kullanarak mevcut. Birleştirerek elektrokimya ve floresan mikroskopisi, lumen tek veziküller, tek içeren veya birden fazla enzim, pH değişiklikler algıladı ve ayrı ayrı analiz.

Proton pompalama membran enzimler elektrokimya ve floresan mikroskopisi kullanılarak incelenmesi için tek lipozom ölçümleri

Nanopore sıralamasını uzak konumlarda ve kaynak kötü ayarlarında maliyet-etkili sıralamaya izin veren bir yeni teknoloji. Burada, mRNAs 'ın bu şartlar ile uyumlu olan tüm kandan sıralanması için bir protokol sunuyoruz.

Nanopore sıralamayı kullanarak tüm kan mRNA sıralaması

Burada, elektron mikroskopisi ile birlikte yerli hücreli membran nanopartikül sistemini kullanan membran proteinlerinin oligomerik durumunun belirlenmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Bu protokol, hücresel bir ortamda reseptörlere gerçek zamanlı olarak adenin nükleotid bağlanmasını ölçmek için bir yöntem sunar. Bağlanma, trinitrofenil nükleotid türevleri ile kanonik olmayan, floresan amino asit ile etiketlenmiş protein arasındaki Förster rezonans enerji transferi (FRET) olarak ölçülür.

Sağlam, fonksiyonel membran proteinlerine bağlanan nükleotidin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi

Bu protokol, moleküler kütlenin ve lipit membranlarla etkileşime giren makromoleküllerin difüzyon davranışının eşzamanlı olarak araştırılmasını sağlayan iSCAT tabanlı bir görüntü işleme ve tek parçacık izleme yaklaşımını açıklar. Numune hazırlama, kütleden kontrasta dönüştürme, film edinme ve son işleme için adım adım talimatlar, olası tuzakları önlemek için talimatlarla birlikte sağlanır.

Membranla İlişkili Makromolekül Dinamiğini Karakterize Etmek için Kütleye Duyarlı Partikül İzleme

Bu protokol, bireysel iyon kanallarını izlemek ve desteklenen lipit membranlarındaki aktivitelerini belirlemek için TIRF mikroskopisinin nasıl kullanılacağını açıklar, böylece yanal membran hareketi ile kanal fonksiyonu arasındaki etkileşimi tanımlar. Membranların nasıl hazırlanacağını, verilerin nasıl kaydedileceğini ve sonuçların nasıl analiz edileceğini açıklar.

Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu Kullanılarak Lipid Çift Katmanlarında Yanal Mobilite ve İyon Kanalı Aktivitesinin Tek Moleküllü Görüntülenmesi

Öğrenin, nanopore çip sistemi kullanarak tek protein çözünürlüğünde membran transport analiz yöntemlerini. Bu yüksek paralellikteki teknik, membran proteinlerinin iletkenlik ve transport davranışlarını inceleme olanağı sunar.

Membran Transport Tek Protein çözünürlükte Oldukça Paralel nanopore çip Sistemi Analiz Süreçleri

Daha fazla video keşfet