Membran Transport Tek Protein çözünürlükte Oldukça Paralel nanopore çip Sistemi Analiz Süreçleri

Bu nano yapılı çip tabanlı platformun genel amacı, zar protein fonksiyonunu tek moleküler düzeyde oldukça paralel bir şekilde analiz etmektir. Tek proteinleri çözme yeteneği sayesinde, zar taşınması ve akısı hakkında yeni bilgiler elde edilir. Bu yöntem, özellikle elektrojenik olmayan kargolarda olduğu gibi, tek kanalların veya taşıyıcıların iletkenliği veya taşıma davranışı gibi membran protein alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin ana avantajı, yüz binlerce nano gözenek ve taşıma olaylarından okunan floresan içeren nano yapılı çip tasarımından türetilen yüksek paralelliğidir. Bu tekniğin etkileri, zar proteinleri için etkili kütüphanelerin en iyi tahlillerini oluşturan şeye kadar uzanır. Çünkü çip tabanlı platform, son derece paralel ve otomatik taşıma kaydı sağlar.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, sunulan tekniği nasıl kullanacaklarını hızlı bir şekilde öğreneceklerdir. Odak noktası, ilgilenen herkesin benimseyebilmesi için her zaman kullanıcı dostu bir test oluşturmaktı. Bu membran taşıma tahlili, reaksiyon iyonu aşındırma kullanılarak tasarlanmış, yalıtılmış gofret üzerinde bir silikon kullanır.

Her gofretten yaklaşık 1.000 tahlil çipi üretilir. Her çip 250.000 mikro boşluk içerir. Bu boşluklar, ilgilenilen taşıma proteinlerini içeren lipid çift katmanları ile kapatılır.

Membran, sensör arayüzünü oluşturur. Başlangıçta, floresan malzemeler, oluştukları lipozomların iç kısmına karşılık gelen lipit çift tabakasının bir tarafında bulunur. Her boşluk, bir multispektral floresan okuması ile adreslenebilir.

Opak bir üst katman, tampon rezervuarından gelen floresan sinyallerini engelleyerek biyo-çipi ters çevrilmiş floresan mikroskoplarla uyumlu hale getirir. Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak, silikon-dioksit tabakasının eşit şekilde düzenlenmiş gözenek açıklıkları ve yüzey pürüzlülüğü, vezikül füzyonu için en uygun olan 3.6 nanometrede ölçüldü. Taramalı Elektron Mikroskobu, silikon çipin içindeki femtolitre boşluklarına erişen bir nano gözenek boyunca bir kesit gösterir.

Bu video, proteolipozomların hazırlanmasını, test için çiplerin hazırlanmasını ve temel tahlil uygulamasını gösterir. Etanol ile yıkanmış yuvarlak tabanlı bir şişeyi döner bir buharlaştırıcıya bağlayın. Şişenin cam duvarında homojen bir lipit filmi oluşturmak için lipit filmi 300 milibar, 30 santigrat derece su banyosu sıcaklığında ve maksimum dönüş hızında 40 dakika kurutun.

Ardından, yüksek vakumlu bir pompa kullanarak, lipit filmi oda sıcaklığında 30 dakika daha kurutun. Daha sonra, çok katmanlı vezikülleri yapmak için şişeye beş mililitre tampon ve sekiz etanolle yıkanmış cam boncuk ekleyin. Şişeyi döner buharlaştırıcıya bağlayın ve maksimum hızda 50 santigrat derecede vakumsuz döndürün.

45 dakika sonra, çözelti sütlü görünecek ve duvarlarda artık lipit filmi kalmayacaktır. Şişeyi inert bir gaz altında ultrasonik bir banyoya aktarın ve oda sıcaklığında dört dakika boyunca sonikasyon yapın. Sonikasyon, lipozomları bozar ve onları tek kişilik hale getirir.

Şimdi, LUV çözeltisini bir mililitrelik alikotlara bölün ve sıvı nitrojen ve 40 santigrat derece su banyosu kullanarak beş donma çözülme döngüsü gerçekleştirin. Bu, lipozomların yırtılmasına, yeniden düzenlenmesine ve büyümesine yol açar. Son dondurma adımında, tüm numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Bir LUV alikotunu sulandırmadan önce, alikotu bir mini ekstrüder kullanarak 400 nanometrelik bir polikarbonat filtre membranından 17 kez geçirerek lipozomları ekstrüde edin. Ardından, çözelti içinde% 0.25 için% 4 Triton X-100 ekleyerek LUV'leri kararsızlaştırın. Karışımı 50 santigrat derecede beş dakika inkübe edin.

Şimdi, bir kısım saflaştırılmış, modifiye edilmiş MscL'yi deterjanla doymuş lipozomların 20 kısmına karıştırın ve inkübasyona 30 dakika devam edin. İnkübasyondan sonra, 100 mikrolitrelik bir alikot alın ve bir hacim 30 milimolar kalsin ekleyin. Bu karışımı 50 santigrat derecede beş dakika inkübe edin.

Şimdi, kalsinle muamele edilmiş ve işlenmemiş numuneden deterjanı çıkarın. Her birine Tris tamponunda ıslak biyo-boncuklar ekleyin ve bunları dönen bir plaka üzerinde dört santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. Deneyden önce, bir aktivite tahlili kullanarak bir preparasyonu test edin.

Başlamak için, elastomer bazını kürleme maddesine karıştırın ve karışımı dehşet verici olacak şekilde tamamen kurutun. Yapıştırıcı hazır olduğunda 30 dakika içinde kullanılmalıdır. Bu arada, önlem alarak, bir cam şırıngadan uygulanan beş mililitre kloroform kullanarak bir kapak cam sürgüsünü temizleyin ve sürgünün kurumasını bekleyin.

Şimdi, 10 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, hazırlanan yapıştırıcıyı kapak camına bırakın. Ardından, ince cımbız kullanarak gofret tahtasından bir çipi dikkatlice çıkarın. Çipin kaplanmış tarafı yukarıda, yapıştırıcının üzerine bırakın ve yapıştırıcıyı eşit şekilde dağıtmak için hafifçe sürtün.

Hava kabarcıklarının aşağıda sıkışmasına veya herhangi bir yapıştırıcının çipin üzerine çıkmasına izin vermeyin. Ayrıca, montajı sekiz odacıklı kayar tutucuya sığacak şekilde yapın. Şimdi düzenekleri bir kabin kurutucusunda 65 santigrat derecede iki saat kurutun.

Daha sonra, 54 santigrat derecede birkaç solvent yıkama ile cipslerin üzerindeki koruyucu tabakayı çıkarın. İlk olarak, monte edilmiş talaşları bir kayar tutucuya yerleştirin. Ardından, her biri 10 dakika boyunca üç çözücü banyosunda inkübe edin.

İzopropanol, aseton ve izopropanol. Ardından, cipsleri ultra saf suyla dikkatlice ve iyice yıkayın. Talaşları hafif bir nitrojen gazı akışı altında kurutarak işlemi tamamlayın.

Şimdi, sekiz kuyulu yapışkan bir slayt hazırlayın ve tezgahın üzerine geriye doğru koyun. Ardından, kapak kızaklarını, talaşlar kuyucuklara bakacak şekilde yapışkan sürgünün üzerine dikkatlice kaldırın ve bastırın. Devam etmeden önce düzeneğin birkaç dakika dinlenmesine izin verin.

Translokasyon testine devam etmeden önce, talaş tertibatını metin protokolünde açıklandığı gibi iyice yıkayın ve bir Tris tampon banyosu ile bitirin. Daha sonra, banyo çözeltisini beş milimolar kalsiyum klorür ve bir mikromolar Oy647 boyası içeren DOPEd Tris tamponu ile değiştirin. Daha sonra, mililitre başına bir miligramlık son konsantrasyon için çip odasına proteolipozomlar ekleyin ve bir saat bekleyin.

Bir saat sonra, cipsleri 400 mikrolitre kalsiyum içermeyen Tris tamponu ile dört kez durulayın. Şimdi, kontrollü boyayı her bir oyuğa beş mikromolar ekleyin ve tahlil işlemine devam edin. Ardından, çip tutucuyu epifloresan mikroskobuna monte edin ve mikro boşlukları bulmak için nanopor çipinin kenarına odaklanın.

Mikro boşluklar odaklandıktan sonra, en yüksek tavan oranını gösteren bir bölge için nanopor dizisini tarayın. Ayrıntılar metin protokolünde verilmiştir. Lipozomlar hazırlandı ve boyutları, dağılımları ve dağılımları için kontrol edildi.

Hazırlanan lipozomlar, test için gözenek çapından daha büyüktü, bu da esastır. Monodispers lipozomlar da arzu edilir. Deneyden önce, lipozomun preparasyonundaki modifiye MscL proteini, bir floresan söndürme testi kullanılarak kontrol edildi.

Aktif modifiye MscL barındıran lipozomların oranı, translokasyon deneyine devam etmek için yeterliydi. Biyoçip üzerinde, modifiye edilmiş MscL kanalı yoluyla bir floresan hedefin çözünen translokasyonu gözlendi. Kimyasal modülatör MTSET, elektrostatik itme yoluyla tasarlanmış MscL kanallarını açmak için kullanıldı.

Boşluk boşluğu içindeki floresanın müteakip azalması izlendi. Bu sürecin, çok tutarlı akış olaylarıyla yüksek oranda tekrarlanabilir olduğu kanıtlandı. Ortaya çıkan akış eğrileri, tek kanallı veya çok kanallı translokasyon olaylarına karşılık gelen iki farklı popülasyonda kümelenmiştir.

Sistem, gerçek zamanlı analizle üç adede kadar benzersiz floresan boyayı takip edebildi. Bu, pozitif sonuçların, mono-üstel akış olaylarının, karmaşık kinetiklerin, lipid intrüzyonlarının ve membran yırtılmalarının hassas bir şekilde ayırt edilmesini kolaylaştırır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, çip hazırlama, numune hazırlama, görüntüleme ve analiz gibi ardışık adımlarla yürütülebilir ve tüm protokolü modüler hale getirir.