İnsan Palatine Bademcikler B ve T Lenfosit için Verimli İzolasyon Protokolü

Bu prosedürün genel amacı, insan bademcik örneklerinden BNT lenfosit fraksiyonları elde etmektir. Bu yöntem, viral hastalıkların patogenezinde BT lenfosit fraksiyonlarının rolleri nelerdir gibi viroloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir Cerrahi olarak çıkarıldıktan sonraki üç saat içinde. Bademcik dokusunu, buz gibi, steril HBSS içeren takviyelerle doldurulmuş 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde laboratuvara taşıyın.

Daha sonra insan dokusunu işlemek için önerilen uygun biyogüvenlik prosedürlerini kullanarak. Dokuyu HBSS içeren taze takviye ile nemlendirin ve bademcikleri buz üzerinde 60 milimetrelik plastik hücre kültürü plakasına aktarın. Forseps kullanarak, görünür kan pıhtılarını veya yağ ve bağ dokularını çıkarın ve ardından bademcikleri, takviyelerle birlikte beş mililitre HBSS içeren 60 milimetrelik yeni bir plakaya aktarın.

Sonra kes. Bademcik dokusu üç ila 10 milimetrelik fragmanlar halinde toplanır, ardından fragmanlar, plastik bir şırınganın piston ucunu kullanan takviyelerle birlikte 10 mililitre taze HBSS içeren yeni bir 60 milimetre hücre kültürü plakasında 100 mikrometrelik bir plastik hücre süzgecine aktarılır. Doku parçalarını hücre süzgecinden sıkın, tüm doku yumuşatıldığında bademcik parçalarının tamamen HBSS'ye daldırıldığından emin olun, süzgeci atın ve elde edilen hücre süspansiyonunu buz üzerinde 50 mililitrelik bir plastik santrifüj tüpüne aktarın.

Hücre çözeltisini, takviyeleri içeren taze HBSS ile 35 mililitrelik bir nihai hacme getirin ve ardından birkaç 50 mililitrelik konik tüpe 10 mililitre oda sıcaklığında yoğunluk gradyan çözeltisi ekleyin. Hücre süspansiyonlarını yoğunluk gradyanlarının üzerine nazikçe yerleştirin, çözeltileri karıştırmamaya dikkat edin ve ardından hücreleri santrifüjleme ile ayırın. Mononükleer hücreler, tüpün altındaki tortuda bulunan kırmızı kan hücreleri, fibroblastlar ve hücre kalıntıları ile arayüzde kabarık beyaz bir tabakaya ayrılacaktır.

10 mililitrelik bir pipet kullanarak, mononükleer hücre tabakasını dikkatlice toplayın ve mononükleer hücreleri 50 mililitrelik yeni bir tüpe çekin. Daha sonra hücreleri her yıkamada 25 mililitre buz gibi soğuk PBS'de üç kez yıkayın ve son peleti 15 mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Canlı hücrelerin sayısını saydıktan sonra, tonsor T hücrelerini manyetik boncuk ayırma ile izole etmek için hücreleri buzun üzerine yerleştirin.

Mononükleer hücre süspansiyonunu aşağı doğru döndürün ve peleti yedi hücreye bir kez 10 kere 80 mikrolitre buz gibi soğuk ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra hücre süspansiyonunu steril iki mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücreleri ve süspansiyonu inkübasyonun sonunda tutmak için sürekli yumuşak karıştırma ile dört santigrat derecede bir saat boyunca 20 mikrolitre CD üç manyetik antikor içinde inkübe edin, hücreleri beş mililitre buz gibi soğuk ayırma tamponu içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve yıkama sırasında yıkayın. Manyetik ayırıcıyı standa takın ve mıknatısın üzerine bir sütun yükleyin.

Kolonu 500 mikrolitre buz gibi soğuk ayırma tamponu ile yıkayın ve ardından kolonun üzerine 40 mikrometrelik bir süzgeç yerleştirin. Şimdi hücre peletini 500 mikrolitre taze ayırma tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri süzgeçten geçirerek EIT içeren B hücresini 15 mililitrelik bir konik halinde toplayarak kolona yükleyin. Tüm hücreler toplama tüpüne geçtiğinde iki bon buz.

Kolonu dört kez yıkayın, her seferinde 500 mikrolitre ayırma tamponu ile yedi hücreye 10 kere yıkayın ve bir sonraki yıkamayı uygulamadan önce kolon rezervuarının boşalmasını bekleyin. Son yıkamadan sonra, sütunu 15 mililitrelik yeni bir toplama tüpüne aktarın. Daha sonra, CD üç pozitif T hücresi fraksiyonunu toplamak için kolondan tüpe iki mililitre ayırma tamponu bastırmak için kolon pistonunu kullanın.

İzole edilmiş B ve t tonsor hücre fraksiyonlarını analiz etmek için, CD üç pozitif ve CD üç negatif hücre fraksiyonunu pelet haline getirin ve ikinci dönüşten sonra her iki hücre setini% 0.2 BSA veya PBSA ile desteklenmiş bir mililitre PBS'de yıkayın. Hücrelerin ve PBSA'nın 100 mikrolitrelik alikotunu faks etiketleme için uygun sayıda tüpe dağıtın ve her tüpe uygun miktarda floro dört konjuge monoklonal veya kontrol antikoru ekleyin. Daha sonra tüpleri kısaca girdaplayın ve inkübasyonun sonunda karanlıkta dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Tüpleri taze PBSA ile iki kez yıkayın ve ardından hücrelerde adenovirüs DNA'sının varlığını PCR ile tespit etmek için hücre boyamasını %1 paraform aldehit ile sabitleyin. Elde edilen PCR amplifikasyon ürünlerini %1.5'lik bir AGROS jeli ve interestate EDTA tamponu üzerinde ayırarak PCR amplifikasyonunu uygun döngü koşulları altında gerçekleştirin. Son olarak, ortaya çıkan bantları uygun nükleik asit boyası ile görselleştirin.

Standart protokollere göre, tonsör mononükleer hücrelerinin başarılı bir şekilde ayrılması, sırasıyla b ve t lenfosit popülasyonlarını tespit etmek için anti CD 20 ve anti CD iki antikor kullanılarak akış sitometrik analizi ile doğrulandığı gibi, BNT lenfositlerinin yüksek oranda saflaştırılmış alt popülasyonları ile sonuçlanır. Buna karşılık, mononükleer hücrelerin verimsiz bir şekilde ayrılması, hem b hem de t lenfositlerinden gelen hücrelerin bir karışımı olan hücre fraksiyonları ile sonuçlanır. Alt popülasyonlar, DNA ve RNA, az önce gösterildiği gibi aşağı akış analizi için manyetik boncukla ayrılmış b ve t lenfositlerinden ekstrakte edilebilir.

Örneğin, burada, PCR ile tespit edilen TONSOR T lenfositlerinde adenovirüs DNA'sının spesifik tespiti, kalite sitoplazmik olarak gösterilmiştir. RNA, izole tonsor B NT lenfositlerinden de ekstrakte edilebilir. Bir kez canavar iki bademcik örneği, teknik uygun şekilde uygulanırsa altı saat içinde işlenebilir.

Bu prosedürü denerken, bademcik örneklerini mümkün olduğunca hızlı bir şekilde işlemek önemlidir. Yıkama adımlarının sayısı ve yıkama tamponunun hacmi de iyi bir sonuç için kritik parametrelerdir. Bu prosedürü takiben, viral DNA ve mRNA'nın geliştirilmesinden sonra kantitatif varlığı hakkında ek soruları yanıtlamak için QPCR ve R-T-Q-P-C-R gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Bu teknik, viroloji alanındaki araştırmacıların insan lenfoid dokularındaki farklı viral türlerin patogenezini ve gecikmesini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, insan bademcik örneklerinden BT lenfosit fraksiyonlarını nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Kan ve dokular gibi insan kaynaklı taranmamış materyallerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu nedenle, uygun güvenlik uygulamalarına uyulmalıdır.