Name: Adım özgü Fare spermatidlerin Sıralamayı Akışı Sitometrinin tarafından (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Keşfedin fare spermatidlerini akış sitometrisiyle dört saf popülasyona ayırma yöntemini. Bu teknik, spermiogenezin moleküler çalışmaları için çapraz kontaminasyonu en aza indirerek üreme biyolojisi araştırmalarını ilerletir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Epifloresans mikroskobu ile ilgili teknik danışmanlık için Dr. Leonid Volkov ve Éric Bouchard teşekkür etmek istiyorum. Finansal destek GB Sağlık Araştırması (hibe # MOP-93.781) Kanada Enstitüleri tarafından finanse

Hayvan bakım Université de Sherbrooke hayvan bakımı ve kullanımı komitesi ile uyumlu idi. 1. Tüp Hazırlığı <ol><li> Hücre sıralama bir gün önce, 5 ml&#39;lik bir polipropilen yuvarlak tabanlı tüpe ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) ile 1-2 ml ekleyin ve 15 ml ve 50 ml polipropilen konik tüplere. Kritik adım: protokolünde kullanılan her tüp kaplı olduğundan emin olun. Not: FBS kaplama boru duvarlarına yapışmasını germ hücrelerine önler. </li><li> Yavaş yavaş tüpler aynı şekilde bir rotator ile kaplamak için, 4 ° C&#39;de ters çevirme ile O / N karıştırın. </li><li> Ertesi gün, boşaltılarak kaplanmış tüpler FBS çıkarın. <ol><li> * Kritik adım: 5 ml polipropilen yuvarlak dipli tüpler ve hücre hazırlanması için kullanılan 15 ve 50 ml tüpler (protokol 2.11 2.1 adımları) tamamen havalandırmak (yan akımlarının, yani belirsiz sapma) önlemek için FBS boşalttı emin olun. FBS kaldırmak için bir P200 pipetlemeyin kullanın. <br/&gt; Not: önce hücrelerle veya hücre ayırma sırasında kullanılan tüpler kontaminasyon kaybına neden olabilir sıralama için tüplere Kalıntı FBS, </li><li> Yuvarlak 5 ml polipropilen saflaştırılmış hücreleri toplamak için kullanılan alt tüpler içinde FBS (yaklaşık 100-200 ul) küçük bir kalıntı hacmi bırakın. </li></ol></li></ol> 2. Hücre Hazırlanması <ol><li> O CO 2 boğulma ardından 2 / izofluran (daha sonra% 2 oranında muhafaza% 5 indüksiyon) ile anestezi altında tek erkek fare Kurban. </li><li> Tüketim ve açarlar hem testis ve 1.5 ml tüp içine tampon sıralama 500 ul küçük bir makas ile kıyma. </li><li> Sağlam bir 100-1,000 ul ucu ile daha sonra seminifer ilk kesik 100-1,000 ul ucu ile 1.5 ml tüp nazik yukarı ve aşağı pipetleme tübüllerinde, ve gelen yıkayın germ hücreleri. </li><li> 40 mikron hücre süzgeç kullanılarak bir filtrasyon adım enkaz ve kümeleri çıkarın ve 50 ml konik tüp prev içine süzülen toplamakiously Aşama 1 FBS kaplanmıştır. </li><li> Daha önce 1. adımda kaplı 15 ml konik tüp içine toplam 3 ml hacminde ve transfer filtrata kadar tampon sıralama ile bir kez filtreyi yıkayın. </li><li> 0,8 mM EDTA nihai bir konsantrasyon elde etmek üzere, 50 mM EDTA hücre süspansiyonu mililitre başına pH 8 (3 ml 48 ul) 16 ul ekle. </li><li> Germ hücreleri düzeltmek için, yavaş yavaş süt süspansiyon üretecek hafif ajitasyon ile 10 mi pipeti (düşük hızda vorteks) kullanılarak buz-soğuğu% 100 etanol içinde 3 hacim ekleyin. Kritik adım: yavaşça etanol ilave hücre hazırlama bütünlüğünü korumak için çok önemli ve çok önemlidir. Biz etanol hızlı ekleme etkinliğini sıralama önemli bir düşüşe neden hücre lizizine neden olduğunu kaydetti. 3 ml hücre süspansiyonu için, etanol, 9 ml, yaklaşık 1 dakika içinde ilave edilmelidir. </li><li> Ters çevirme ile ara sıra karıştırma ile 15 dakika süreyle buz üzerinde inkübe hücreleri. </li><li> Santrifüj hücre 5 dakika boyunca 800 xg&#39;de süspansiyon ve net çıkarmaksüpernatant. </li><li> Yavaşça tampon sıralama 2 ml sabit germ hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> SYTO16 DNA boyası (DMSO içinde 1 mM çözelti) 4 ul ekleyin ve (ışıktan korunarak), en az 30 dakika inkübe edilir. Not: iyi sıralama sonuçları kolayca spermatidlerin yüksek oranda sıkıştırılmış çekirdekler dahil edilen geçirgen bir DNA boya olduğu SYTO16 kullanılarak elde edilir. </li></ol> 3. Hücre Ayırıcı Kurma Not: Burada, bir 4-Lazer (405 nm - menekşe, 488 nm - mavi, 561 nm - sarı-yeşil, 633 nm - kırmızı) 20-parametre BDFACSAria III hücre sıralayıcı kullanılır. BD FACSDiva 6.1.3 yazılımı veri görselleştirmek ve analiz etmek için kullanılır. Ayarları kullanılır sıralayıcı türüne bağlı olarak değişebilir. <ol><li> Fluidik kapatma prosedürü (yazılımında &quot;Sitometre&quot; menüsü) sıralama öncesinde sırasında kılıf sıvısı olarak% 70 etanol çalıştırarak FACS sıralayıcı sterilize edin. Yazılımın araç çubuğundaki &quot;Sitometreyi&quot; seçin ve &quot;Fluidic sh seçin. &quot;utdown süreçler tarafından belirtilen adımları izleyin. </li><li> Hazırlama ve herhangi bir kristal ve kirletici maddelerin bertaraf edecek şekilde bir 0.22 um filtre ile 1x PBS filtre. Tankın iç üst kaynak hattına kılıf deposunu doldurunuz. </li><li> Yazılımını başlatın ve oturum açın. Önce sıralama için en az 30 dakika süreyle lazer ısınmak için FACS sıralayıcı başlatın. Akıskanlar tekni˘gi gelen etanol dışarı floş iki akışkan başlangıç ​​süreçlerini çalıştırın. Yazılımın araç çubuğundaki &quot;Sitometreyi&quot; seçin ve &quot;Fluidic başlangıç&quot; ı seçin. Süreçlerle belirtilen adımları izleyin. Not: Bu normal bir kılıf sıvısı (1x PBS) ile Fluidics geri yükler. </li><li> Sıralama blok ve distile su ile saptırma plakaları temizleyin ve iyice kurulayın. Bir sonikasyon banyosu içinde 2 dakika için damıtılmış su içinde bir boru içine yerleştirilmiş bir 100 um ağızlık sonikasyon. Iyice memeyi silin. </li><li> Akış hücre içine 100 mikron memesini takın ve 12 meme-kilitleme kolunu saat yönünde çevirinhr pozisyonu. 20 psi kılıf basıncını ayarlayın. </li><li> Dere açın ve (30 civarında) frekans hedef değerleri elde etmek için genlik ayarlayın 1 (150 civarında) bırakın ve (12 civarında) Gap ve istikrarlı bir damlacık kırılması deseni (birkaç uydu damla) kurmak. Zayıflama kapatın. </li><li> Dere düz ve sıralama bloğunun açısını değiştirerek atık aspiratör merkezini vurur emin olun. Not: 10 psi A 130 mikron meme de test edildi ve belirgin bir fark bulunmuştur. </li><li> Sarı-yeşil lazerler için, mavi mor kırmızı için -77.39, 37.33 -39.85 ve için 0 olarak ayarlayın lazer gecikme. </li><li> Sarı-yeşil lazerler için, mavi mor kırmızı için 1.0, 0.75 ve 0.96 için 1.14 ölçekleme ayarlayın alanları. </li><li> (Yazılım &quot;Yan Akım&quot; penceresinde) Test Sıralama kullanarak, yan akışları havalandırarak olmadığından emin olun. Onlar middl isabet böylece &quot;Yan Akım&quot; penceresinde, her yan akımının gerilim sürgü ayarlamakTest toplama tüpünün e. Merkez akışı sıkı değilse, merkez akışı sınırlamak için 2 nd, 3 rd ve 4. damla ayarlarını. </li><li> Yazılımın (&quot;Sitometre&quot; menüsü) Sitometrenin Kurulum ve İzleme (CS &amp; T) uygulamasını başlatın. </li><li> Üreticinin talimatlarını kullanarak sitometresinin performans karakterizasyonu ve izleme otomatikleştirmek için 350 ul başına 1 damla sitometresinin kurulum ve izleme boncuk kullanın. </li><li> CS &amp; T uygulaması çıkın. CS &amp; T ayarı uygulamak, dere parametreleri hala istikrarlı bir damlacık kırılması modelini izin verdiğinizden emin olun, ve (&quot;kırılması penceresinde&quot; olarak) üreticinin talimatlarına açıklandığı gibi Sweet Spot butonuna açın. </li><li> Floresan boncuklar kullanarak Bırak Gecikme değerini optimize (Malzeme Tablo). <ol><li> Tutucuya toplama tüpleri yükleyin. Sıralama bloğu kapağını açın. &quot;Yan Akım&quot; penceresinde, &quot;seçeneğini ardından gerilime açınTest sıralama &quot;ve çekmeceyi açın ve toplama tüpleri erişimi için Aspiratör Çekmece düğmesini tıklatın. </li><li> Onlar tüp merkezine gitmek böylece yan akışları optimize edin. Gerektiği gibi değer ve kaydırma çubuklarını ayarlayın. </li><li> Sıralama bloğu kapağını kapatın ve merkezde parlak boncuk nokta elde etmek mikrometre kadranını ayarlamak için emin olun. Unselect atık çekmece test sıralama ve gerilim. Toplama tüpleri çıkarın. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre açılan gecikme optimize edin. <ol><li> Kısaca, boncuk şişe kuvvetlice sallayın ve PBS 0.5 ml boncuk 1 damla sulandırmak. </li><li> Üreticinin talimatlarına kullanarak, yazılım mevcuttur Bırak Gecikme deneme şablonu kullanarak damla gecikme ayarlayabilirsiniz. Alternatif olarak, açılan gecikmesini ayarlamak için Otomatik Bırak Gecikme özelliğini kullanın. </li><li> Floresan boncuk tüp yerleştirin ve eşik oranı kadar ~ 3.000 4.000 olaylar / saniye akış hızını ayarlayın. Sıralama hassasiyetini ayarlamak için &quot;İlk&quot; ve sonly &quot;Sıralama düzeni&quot; penceresindeki &quot;İnce ayar&quot; için. Optik filtreyi seçin ve boncuk sıralayın. % 100 sola sıralanır ~ kadar Bırak Gecikmesi ayarlayın. Not: Bu adım emin olmak için kritik olduğunu bir yan akışına faiz tür hücreler. Boncuk ve optik filtre, bir% 100 damlacık sapma yakın elde etmek için kullanılır. </li></ol></li></ol></li><li> FSC dedektörü bloğunun sol ucundaki bir FSC 1.5 ND (nötr yoğunluk) filtreyi yerleştirin. 2.00 us pencere uzantısı ve (&quot;Sitometre&quot; penceresindeki &quot;Lazer&quot; sekmesinde) 1.00 FSC Alan ölçekleme ayarlayın. </li><li> Örnek tüpü yerleştirmeden önce, topaklanma önlemek için örnek hattının sonunda 50 um örnek filtre satırı koyun. Bunu yapmak için, &quot;Sitometre&quot; menüsünden &quot;Örnek Filtre değiştirme&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Yan akım arasındaki havalandırmadan iyi bir şekilde ayrılmasını sağlamak ve Polipropilen yapışmasını önlemek için hücrelerin örnek sıvı bileşimin testne tüpler. <ol><li> , Örnek tüp Yük saptırma plakaları açın ve çekmece kapalı &quot;Test tür&quot; seçeneğini seçin. Ayrılık çok fazla ventilatör olmadan oluşursa yan dereler bak. Not: Havalandırma, numune tamponu içinde, yüksek protein konsantrasyonunda muhtemeldir. </li></ol></li><li> FACS aracı haline örnek tüp yükleyin. 300 rpm&#39;lik bir ajitasyon örneği ve 4 ° C&#39;de bir örnek sıcaklığı seçin. &quot;Acquisition Dashboard&quot; in &quot;Veri Edinme&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Gerekirse, (3.0 maksimum akış hızında) / saniye 5000 etkinlikleri en fazla, uygun bir olay hızı elde etmek için örnek seyreltin. Sıralanmış hücrelerin saflığını muhafaza edecek şekilde Strictly bu sınırları saygı. </li><li> Analiz ve hücreleri sıralamak için, faiz nüfusu müdahale etmeden enkaz ortadan kaldırmak için FSC eşik değerini optimize. Logaritmik ölçekte yapmak amacıyla 530/30 filtresi ile foto-çoğaltıcı tüp (PMT) dedektörün voltajını ayarlamakEmin toplam nüfusun floresan sinyal ölçeğinde dahilinde ve pozitif nüfus kapısı (Şekil 1, Kapı 1). </li><li> Bir Forward Scatter-alanı (FSC-A) / Side Scatter alan SYTO16 pozitif nüfusun (SSC-A) arsa üretin ve yaklaşık 110 V Doğrusal ölçekte için FSC-A ayarlayın ve yaklaşık 150 V SSC-A Çok büyük hücreleri ve hücre agrega hariç ise logaritmik ölçekte tüm olayları görselleştirmek için. </li><li> &quot;Sıralama Düzeni&quot; penceresinde, &quot;Sıralama Hassas Mode&quot; set &quot;4-yollu saflık&quot; için (Verim maskesi: 0, Saflık Maskesi: 32, Faz Maskesi: 0). Sürekli sıralama için &quot;Hedef Etkinlikler&quot; menüsünden &quot;Sürekli&quot; yi seçin. </li><li> (&quot;Sıralama Düzeni&quot; penceresinde) tüplere karşılık gelen alanda sıralamak için popülasyonları ekleyin. Yüksek orta frekans ve ucunda düşük frekanslarda olanlar ile yerleştirin popülasyonları. , Sıralama sırasında 2500 V gerilim plakaları ayarlayın örnek toplama t tutmakBuz üzerinde UBE. </li></ol> 4. Hücre Ayırma <ol><li> Hemen sıralamadan önce, yuvarlak dipli tüp önceden kaplanmış 5 ml polipropilen 50 mikron filtre kullanılarak filtre hücreleri. </li><li> Tampon sıralama 1-2 ml yoğun filtreyi yıkayın. </li><li> Şekil 1&#39;de detaylı yolluk planı izleyen bir 488 nm lazer donanımlı hücre sıralayıcı kullanılarak sırala sabit germ hücreleri. Daha önce buz üzerinde bölüm 1 kaplı 5 ml polipropilen yuvarlak dipli tüplerde arıtılmış kesirler toplayın. <ol><li> FBS 100-200 ul tüp duvarına sıralanmış hücrelerin yapışmasını önlemek için toplama tüpleri muhafaza olduğundan emin olun. </li><li> SYTO16 konsantrasyonu sıralama döneminde floresan dalgalanmaları önlemek için doygunluğa emin olun. Ayırma Grafiklerdeki Alexa Fluor 488 parametresi (DNA boyama) hücre boyama yoğunluğunun daha fazla değişiklik olduğunda SYTO16 satürasyon. Gerekirse, 1 ulSıralama tüp SYTO16 doygunluk ulaşmak için. </li><li> Alexa Fluor 488-A vs olay sayısı: aşağıdaki parametreleri gösteren bir grafik üzerinde toplam etkinlik gösterir. </li><li> Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, Gate 1 pozitif bir DNA boyama hücreleri seçin. <ol><li> Parametre olarak FSC-A vs SSC-A kullanılarak bir grafik üzerinde kapısı 1 Ekran hücreleri <ol><li> Şekil 1&#39;de gösterdiği gibi, Gate 2 ile hücreleri seçin. </li><li> Parametre olarak Alexa Fluor 488-A vs FSC-A kullanılarak bir grafik üzerinde Gate 2 Ekran hücreleri. </li><li> Şekil 1&#39;de gösterdiği gibi, Gate 2 grafik üzerinde Gate 5 ve Gate 6 hücreleri seçin. </li><li> Parametre olarak Alexa Fluor 488-A vs 488-W Alexa Fluor kullanarak grafik üzerinde ayrı ayrı Gate 5 ve 6 Gate gösterir. </li><li> Seç Spermiyogenez Gate 5 grafikte 1-9 spermatid adımları ve Şekil 1&#39;de gösterdi Spermiyogenez Gate 6 grafik 10-12 spermatid adımları yineleyin. </li></ol></li><li> Ekranparametre olarak Alexa Fluor 488-A vs FSC-A kullanılarak bir grafik üzerinde kapısı 1 hücreleri <ol><li> Şekil 1&#39;de gösterdiği gibi, Gate 3 ve Gate 4 hücreleri seçin. </li><li> Parametre olarak Alexa Fluor 488-A vs 488-W Alexa Fluor kullanarak grafik üzerinde ayrı ayrı Gate 3 ve Gate 4 görüntüler. </li><li> Seç Spermiyogenez Kapısı 3 grafik üzerinde 13-14 spermatid adımları ve Şekil 1&#39;de gösterdi Spermiyogenez, Gate 4 grafik üzerinde 15-16 spermatid adımları yineleyin. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+production+of+functional+sperm+in+cultured+neonatal+mouse+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes.</a> Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+production+of+fertile+sperm+from+murine+spermatogonial+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines.</a> Nat. Commun. 2, 472(2011).</li>
<li>Sun, X., Kovacs, T., Hu, Y. -J., Yang, W. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+actin+and+myosin+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Rep%22%5BJournal%5D)">The role of actin and myosin during spermatogenesis.</a> Mol. Biol. Rep. 38 (6), 3993-4001 (2011).</li>
<li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+junction+dynamics+in+the+testis%3A+Sertoli-germ+cell+interactions+and+male+contraceptive+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell junction dynamics in the testis: Sertoli-germ cell interactions and male contraceptive development.</a> Physiol. Rev. 82, 825-874 (2002).</li>
<li>Laiho, A., Kotaja, N., Gyenesei, A., Sironen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+the+murine+testis+during+the+first+wave+of+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of the murine testis during the first wave of spermatogenesis.</a> PLoS ONE. 8 (4), (2013).</li>
<li>Leduc, F., Maquennehan, V., Nkoma, G. B., Boissonneault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response+during+chromatin+remodeling+in+elongating+spermatids+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">DNA damage response during chromatin remodeling in elongating spermatids of mice.</a> Biol. Reprod. 78 (2), 324-332 (2008).</li>
<li>Meistrich, M. L., Mohapatra, B., Shirley, C. R., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+transition+nuclear+proteins+in+spermiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis.</a> Chromosoma. 111 (8), 483-488 (2003).</li>
<li>Grégoire, M. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-driven+de+novo+mutations+in+haploid+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Male-driven de novo mutations in haploid germ cells.</a> Mol. Hum. Reprod. 19 (8), 495-499 (2013).</li>
<li>Simard, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+of+trinucleotidic+repeats+during+chromatin+remodeling+in+spermatids%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Instability of trinucleotidic repeats during chromatin remodeling in spermatids.</a> Hum. Mutat. , (2014).</li>
<li>Wykes, S. M., Krawetz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+spermatogenic+cells+from+adult+transgenic+mouse+testes+using+unit-gravity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Separation of spermatogenic cells from adult transgenic mouse testes using unit-gravity sedimentation.</a> Mol. Biotechnol. 25 (2), 131-138 (2003).</li>
<li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development (Cambridge, England). 133 (8), 1495-1505 (2006).</li>
<li>Moreno, R. D., Lizama, C., Urzúa, N., Vergara, S. P., Reyes, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activation+throughout+the+first+wave+of+spermatogenesis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat.</a> Cell Tissue Res. 325 (3), 533-540 (2006).</li>
<li>Meistrich, M. L., Trostle-Weige, P. K., Van Beek, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+specific+stages+of+spermatids+from+vitamin+A-synchronized+rat+testes+for+assessment+of+nucleoprotein+changes+during+spermiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Separation of specific stages of spermatids from vitamin A-synchronized rat testes for assessment of nucleoprotein changes during spermiogenesis.</a> Biol. Reprod. 51 (2), 334-344 (1994).</li>
<li>van Pelt, A. M., de Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+the+seminiferous+epithelium+after+vitamin+A+replacement+in+vitamin+A-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Synchronization of the seminiferous epithelium after vitamin A replacement in vitamin A-deficient mice.</a> Biol. Reprod. 43, 363-367 (1990).</li>
<li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Kovtun, I. V., McMurray, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trinucleotide+expansion+in+haploid+germ+cells+by+gap+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">Trinucleotide expansion in haploid germ cells by gap repair.</a> Nature Genet. 27 (4), 407-411 (2001).</li>
<li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).</li>
<li>Lassalle, B., Ziyyat, A., Testart, J., Finaz, C., Lefèvre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+method+to+isolate+round+spermatids+from+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric method to isolate round spermatids from mouse testis.</a> Hum. Reprod. 14 (2), 388-394 (1999).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

Spermatogenik hücreler her zaman seminifer epitel karmaşıklığı yanı sıra, in vitro kültür sınırlı bir başarı verilen araştırmaya zorlu oylandı. Yıllar boyunca, pek çok yaklaşım, çeşitli türlerden germ hücreleri geliştirildi saflaştırmak için. Percoll ya da sığır serum albümini gradyanları ile gravite arıtma kullanılarak sedimentasyon teknikler genellikle sağlam germinal hücrelerde daha iyi bir verim sağlar, ancak bu mayoz tetraploid hücre ve spermatidler 10 gibi bazı hücre tipleri arasında, uygun bir...

Haploid yuvarlak spermatidler, spermiyogenez adı verilen bir süreçle spermatozoaya farklılaşır. Bu, bir kamçının elde edilmesi, kromatin ve hücre iskeletinin yeniden şekillenmesi, çekirdeğin yoğunlaşması ve sitoplazmanın çoğunun kaybı dahil olmak üzere birçok farklı adımı içerir. Döllenmeye uygun, bozulmamış bir genoma sahip olgun bir fonksiyonel gamet üretmek için bu benzersiz hücresel olayların hassas bir şekilde düzenlenmesi gerekir. Spermiyogenez in vitro olarak incelenemez, çünkü şimdiye kadar hiçbir güvenilir hücre kültürü sistemi sürecin farklı aşamalarında ilerlemeyi destekleyememiştir. Ayrıca, gerçek in vitro teknikler düşük verime yol açar1,2. İn vivo, spermiyogenezin farklı aşamaları boyunca uygun geçişler, erkek gametin doğal fonksiyonel bütünlüğü için çok önemlidir. Spermatidlerin farklılaşma adımlarına göre başarılı bir şekilde saflaştırılması, spermiyogenezin moleküler karakterizasyonuna izin verecek yeterli bir zenginleştirme seviyesi ile hiçbir zaman gerçekleştirilmemiştir. Örneğin, spermatidal farklılaşmanın temel adımlarının saflaştırılması, gelişmekte olan akrozomun oluşumu, orta parça3'ün oluşumu, hücre bağlantı dinamikleri4, RNA dinamikleri5, kromatin yeniden şekillenme süreci6,7 veya genomik stabilite8'i incelemek için özellikle yararlı olacaktır. Spermatidlerin saflaştırılması, ilerleyici morfolojik dönüşümleri, bilinen evreye özgü dış biyobelirteçlerin eksikliği ve kendine özgü şekil ve büyüklükleri nedeniyle engellenmiştir. 
Çoğu erkek germ hücresi, DNA lekelenmesi ile ploidi (DNA içeriği) arasında doğrudan bir ilişki gösterse de, bu tür pozitif korelasyonun artık spermatidler için geçerli olmadığını fark ettik. Bu, seminifer tübül kesitlerinin farklı spermiyogenez aşamaları boyunca değişken yoğunlukta DNA boyama gösterdiğine dair erken gözlemimizden kaynaklanmaktadır. DNA boyama, spermiyogenez aşamaları 1'den 7'ye kadar olan haploid kromozom setleriyle tutarlı olmasına rağmen (yuvarlak spermatidler), nükleer yeniden yapılanma ve kromatin yeniden şekillenmesinin başlangıcında DAPI veya SYTO 16 ile floresan yoğunluğunda keskin bir artış gözlemledik (spermiogenez adım 8) nükleer yoğunlaşmanın başlangıcında zirveye ulaştı (spermiogenez aşamaları 11-12). Çekirdeğin yoğunlaşmasını takiben, DNA boyama yoğunluğu spermleşmeye kadar azalır (spermiogenez aşaması 16). Bunun muhtemelen, histonların protaminlerle değiştirildiği tuhaf kromatin yapı geçişlerinin oluşumu ile ilişkili olduğunu tahmin ettik. Bu nedenle, ana seçim parametresi olarak spermatidlerin DNA yoğunluğunun değişimini kullanarak spermatidlerin ayrılmasına izin veren güvenilir bir akış sitometrisi yöntemi geliştirdik.
 Basit bir akış sitometrisi yaklaşımı, fare spermatidlerini görünür DNA içeriğine (SYTO16 boyama), boyutlarına ve granülozitelerine göre yüksek saflıkta (%95-100) ayırmak için tanımlanmıştır. Spermatidler dört popülasyona ayrılır; spermiyogenez aşamaları 1-9, 10-12, 13-14 ve 15-16. Saflaştırılmış spermatidler, genetik/genomik analizlerin yanı sıra grup9'un yakın tarihli bir yayınında açıklandığı gibi proteomik uygulamalar için uygundur.

<table><tbody><tr><td>Isofluran</td><td>ABBOT</td><td>05260-05</td><td>Ötenazi öncesi fare anestezisi için</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Wisent</td><td>90150</td><td>Tüp kaplama için</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioShop</td><td>EDT</td><td>Tampon hazırlamayı sıralamak için</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H</td><td>Tampon hazırlamayı sıralamak için</td></tr><tr><td>%100 Etanol</td><td>Les alcools de commerce</td><td>092-09-11N</td><td>Hücre fiksasyonu için</td></tr><tr><td>SYTO 16</td><td>Life Technologies</td><td>S7578</td><td>DNA boyama</td></tr><tr><td>5 ml polipropilen yuvarlak tabanlı tüpler</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td>Sıralanmış hücrelerin toplanması</td></tr><tr><td>15 ml polipropilen konik tabanlı borular</td><td>PROgene</td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polipropilen konik tabanlı borular</td><td>PROgene</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>TEC4 anestezik buharlaştırıcı</td><td>Ohmeda</td><td>1160526</td><td>Fare ötenazisi için</td></tr><tr><td>CO2 gaz tankı</td><td>Praxair</td><td>C799117902</td><td>Fare ötenazisi için</td></tr><tr><td>O2 gaz tankı</td><td>Praxair</td><td>O254130501</td><td>Fare ötenazisi için</td></tr><tr><td>Ev yapımı fare gaz odası</td><td></td><td></td><td>Fare ötenazi</td></tr><tr><td>40 & mikro için; m Falcon hücre süzgeci</td><td>Corning Incorporated</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu; m numune hattı filtreleri</td><td>BD Biosciences</td><td>649049</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td>Labnet international, inc.</td><td>S0200</td><td>Hücre fiksasyonu için</td></tr><tr><td>Dynac santrifüj</td><td>Clay Adams</td><td>101</td><td></td></tr>, <tr><td>Celltrics 50 & m filtreler</td><td>Partec</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>488 nm lazerle çalışan hücre sıralayıcı</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria III</td><td></td></tr><tr><td>Accudop Floresan</td><td>Boncuklar BD Biosciences</td><td>345249</td><td></td></tr><tr><td>Sıralama Tamponu: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, %1 FBS</td><td></td><td></td><td>FBS ısıyla etkisiz hale getirilir. Taze çözelti yapın, 0.22 & mu; m filtrelenir ve 4 ° C'de tutulur.</td></tr></tbody></table>

adım özgü fare spermatidlerin sıralama&#39;yı akışı sitometrinin tarafından

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Fare spermatidler farklılaşması sağlam bir genomu olan bir fonksiyonel erkek gamet üretimi için bir kritik işlem sonraki kuşağa olmaktır. Şimdiye kadar, bu morfolojik geçiş moleküler çalışmalar daha sonraki analizler için spermatid farklılaşma bu önemli adımlardan yeterli ayrılmasını sağlayan bir yöntem olmaması nedeniyle sekteye oylandı. Akış sitometri kullanılarak bu hücrelerin düzgün gating de önceki girişimler için kromatin yenileme geçiren spermatidler DNA floresan kendine özgü bir artış zor olabilir. Bu gözleme dayanarak, biz etanol ile sabit fare spermatid dört popülasyonlarının tekrarlanabilir arıtılmasını sağlayan düzeni sitometri basit bir akış ayrıntıları, her nükleer yeniden şekillenme sürecinde farklı bir durumu temsil. Nüfus zenginleştirme aşaması özgü işaretleri ve morfolojik kriterler kullanılarak teyit edilir. Saflaştırılmış genomik spermatidler ve proteom için kullanılabiliric analizleri.

Yolluk strateji akış sitometri ile kullanılabilir Şekil 1 dört derece saf spermatid popülasyonları sıralamak için flow sitometri kullanılan yolluk stratejisini temsil eder. Kısaca, pozitif DNA boyama hücreleri (Alexa Fluor 488-A) Birinci boyut vs granulosity (SSC-A) gösteren bir nokta arsa üzerinde Spermiyogenezin 1. spermatid 1-12 seçilir adımlar Kapısı (Gate 2) ile seçilir (FSC Kapı 1. A) Daha sonra, Spermiy...

Akış sitometrisi kullanarak fare spermatidleri için bir sıralama stratejisi açıklıyoruz. Spermatidler, yuvarlak (spermiyogenez aşamaları 1-9), erken uzayan (spermiogenez aşamaları 10-12), geç uzayan (spermiyogenez aşamaları 13-14) ve uzun spermatidler (spermiyogenez aşamaları 15-16) dahil olmak üzere oldukça saf dört popülasyona ayrılır. Seçim parametreleri olarak DNA boyama, boyut ve granülozite kullanılır.

Adım özgü Fare spermatidlerin Sıralama&#39;yı Akışı Sitometrinin tarafından

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Bu prosedürün genel amacı, fare spermatidlerini dört ayrı popülasyona ayırarak spermiyogenezin moleküler çalışmalarına olanak sağlamaktır. Bu yöntem, kromatin modellemesinin genomik bütünlük üzerindeki etkisi gibi, üreme alanıyla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sperm hücrelerinin çapraz kontaminasyon olmaksızın saf hücre popülasyonlarına ayrılmasını sağlamasıdır.Haplo parametrelerinde kromatin yeniden düzenlemesi sırasında DN boyama yoğunluğunda önemli varyasyonlar gözlemlediğimizde bu yöntem için ilk fikri edindik. Hücre ayıklamasından bir gün önce, 5 ml'lik polipropilen yuvarlak tabanlı tüplere ve 15 ve 50 ml'lik polipropilen konik tüplere bir ila iki mililitre ısı ile inaktive edilmiş FBS ekleyin. Ardından, tüpleri bir rotatör üzerinde dört santigrat derecede gece boyunca tersyüz ederek yavaşça kaplayın.15 ve 50 mililitrelik tüplerdeki tüm kalıntı FBS'yi uzaklaştırmak için FBS'yi bir P 200 pipet kullanarak dikkatlice dekante edin; hücre ayırma gününde saflaştırılmış hücreleri toplamak için beş mililitrelik tüplerde 100 ila 200 mikrolitre civarında küçük bir kalıntı FBS hacmi bırakın. Kapsüllenmiş test parçalarını 500 mikrolitre ayırma tamponu içinde ince kıyın. Ardından, doku fragmanlarını uç kısmı kesilmiş bir mikropipet ucu kullanarak 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.Germ hücrelerini, nazikçe aşağı yukarı pipetleme yaparak seminifer tübüllerden boşaltın ve ardından ucu sağlam bir pipetle yıkayın. Ardından, döküntüleri ve kümeleri uzaklaştırmak için 40 mikronluk bir hücre süzgeci kullanın ve süzülen sıvıyı FBS kaplı 50 mililitrelik konik bir tüpe toplayın. Filtreyi, toplam hacim üç mililitreye ulaşana kadar bir kez ayıklama tamponu ile yıkayın ve süzülen sıvıyı FBS kaplı 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Ardından, hücrelere mililitre başına 16 µL EDTA ekleyin ve düşük hızlı vorteksleme yaparken, 10 mL'lik bir pipet kullanarak hücreleri üç hacim buz soğukluğundaki %100 etanol ile bir dakika boyunca yavaşça sabitleyin; fiksasyon sonrası süspansiyon sütlü bir görünüm alacaktır. Hücreleri, ara ara ters çevirerek 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra hücre süspansiyonunu santrifüjleyin, pelletini iki mL sıralama tamponu içinde yeniden süspande edin ve sıralamadan hemen önce germ hücrelerini 4 µL cyto 16 DNAD ile boyayın.Hücreleri 50 mikronluk bir filtreden geçirerek FBS kaplı bir fax tüpüne süzün ve filtreyi bir ila iki mililitre ayıklama tamponu ile kapsamlı bir şekilde yıkayın. Sabitlenmiş germ hücrelerini 488 nanometre lazer donanımlı bir hücre ayıklayıcıya yükleyin. Ardından, toplam olayları, olay sayısını Alexa fluor 488 alanına göre temsil eden bir histogramla görüntüleyin ve pozitif DNA boyamalı hücreleri kapılayın.Ardından, bu kapıdaki hücreleri bir yan saçılım alanı ile bir ileri saçılım alanı grafiğinde görüntüleyin ve kapılayın. Belirtilen hücreleri, bu kapılanmış hücreleri bir ileri saçılım alanı ile bir Alexa fluor 488 alanı grafiğinde görüntüleyin ve kapılayın. Bu kapıları daha sonra ayrı Alexa fluor 488 genişliği ile Alexa fluor 488 alanı grafiklerinde görüntüleyin.Spermiyogenezin bir ila dokuzuncu ve 10 ila 12. adımları. Ardından, 13 ila 14. ve 15 ila 16. adımları toplamak amacıyla spermatidleri ayırmak için kapılama (gating) yapılabilir. Spermatidler, ilk kapıdan gelen hücreleri bir EXOR 4 88 alan grafiğine karşı ileri saçılım (forward scatter) alanında görüntüler ve kapılar.Belirtilen hücre popülasyonları. Ardından, bu kapılamaları bireysel Alexa Floor 488 genişliği ile Alexa Floor 488 alanı grafiklerine aktarın ve kapılayın.13'ten 14'e ve 15'ten 16'ya kadar olan adımlar, ayıklama için spermleri hazırlar. Son olarak, saflaştırılmış fraksiyonları buz üzerinde, FBS kaplı beş mililitrelik yuvarlak tabanlı tüplerde 100 ila 200 µL FBS içine toplayın. Bu görüntülerde, akışla ayıklanmış popülasyonların DAPI boyaması gösterilmektedir.Spermiogenezin birden dokuza kadar olan aşamalarındaki spermatidler genellikle yuvarlak çekirdeklere sahiptir ve spermiogenez sırasında oval görünümlü olabilirler. Dokuzuncu aşamadaki spermatidler ve 10 ile 12. aşamalar arasında gözlemlenenler ise uzamış kancalar şeklinde görülürler. Spermiogenezin 13 ile 14. aşamaları ve 15 ile 16. aşamaları arasındaki spermatidler benzer şekilli çekirdekler sergiler, ancak DNA boyama yoğunlukları hafifçe farklıdır; bu durum, bu farklı sperm popülasyonlarının akış sitometrisi ile ayıklanması sırasında tanımlanabilmesine olanak tanır.Gösterilen protokole uyulduğunda, deneyle çalışılan bireysel S popülasyonlarının saflığının %95 ile %100 arasında olması beklenmektedir. Her bir adım düzgün şekilde takip edilirse, bu teknik altı ila sekiz saat içinde tamamlanabilir. Prosedür boyunca hücrelerin daima buz üzerinde tutulması gerektiğini hatırlatmak önemlidir; bu prosedür takip edilerek spermden oluşan farklı popülasyonlar elde edilebilir ve böylece dramatik chromatin yeniden şekillenme sürecinin karakterize edilmesi veya bu geçişin genetik etkilerinin incelenmesi gibi moleküler analizler için yeterli miktarda materyal sağlanabilir.

step-specific-sorting-of-mouse-spermatids-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Floresan aktif hücre sıralama (FACS) ile rafine bir hücre disosiasyon protokolü birleştirir fare testis yüksek derecede saflaştırılmış yaşayabilir mayotik kesirler elde etmek için etkili bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, DNA içeriği ve ayrık mayotik kesirler nükleer yoğunluğu farklılıkları yararlanır.

Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma

Enzimler ve deterjan kaçınarak kemirgen malzemeden testis hücre süspansiyonları, mekanik hazırlanması için bir yeni protokol tarif edilmektedir. Yöntem çok basit, hızlı, tekrarlanabilir ve akış sıralama ve RNA ekstraksiyon için uygun kaliteli hücre süspansiyonları, vermektedir.

Testis Hücre Cezalı Hazırlanması için basit ve Verimli Tekniği

STA-PUT yöntem büyüklüğü ve yoğunluğuna bağlı olarak spermatojenik farklı hücre popülasyonlarının ayrılması sağlar.

STA-PUT Hız Sedimentasyon kullanma spermatogenic Hücre Tiplerinin Ayrılması

Mayoz hangi gamet DNA ikileşmesi bir turu ve kromozom ayrışma birbirini izleyen iki tur üzerinden kurulan gelişimsel işlemidir. Memeli mayoz segregasyonun kromozom yayılır hazırlamak için bir teknik kullanarak incelenebilir. Burada, yüzey-yayılım çekirdeği fare spermatocytes üzerinden hazırlama yöntemi göstermektedir.

Fare Spermatocytes segregasyonun kromozom hazırlanması yayılır

Bu çalışma, farklı memeli türlerinin testiküler dokusundan saflaştırılmış germ hücresi popülasyonlarının elde edilmesi için bir yöntemin standartlaştırılmasını açıklamaktadır. Mekanik testis ayrışmasını, Hoechst-33342 ve propidyum iyodür ile boyamayı ve FACS sınıflandırmasını birleştiren basit bir protokoldür ve erkek üreme biyolojisi karşılaştırmalı çalışmalarında geniş uygulamalar yapılmıştır.

Memeli Erkek Germ Hücrelerinin Çok Denekli Saflaştırılmasında Standart Bir Yaklaşım, Mekanik Doku Ayrılma ve Akış Sitometrisi ile

Bu tübül squash teknik hızla hücresel bütünlüğünü koruyarak fare spermatocytes geliştirme saytolojik özellikleri değerlendirmek için hedeftir. Bu yöntem tüm aşamalarında spermatogenez çalışma için izin verir ve diğer biyokimyasal ve moleküler biyolojik yaklaşımlar için fare mayoz çalışmanın yanında kolayca uygulanabilir.

Seminifer tübül Squash tekniği fare modeli kullanarak sperma saytolojik analizi için

Burada sunulan pachytene spermatositler zenginleştirmek için bir protokol, yuvarlak spermatidler, ve yetişkin fare testislerinden uzayan spermatidler standart laboratuvar ekipmanları ile bir kesintili sığır serum albumin yoğunluğu gradyanı kullanarak.

Standart Laboratuvar Ekipmanları Kullanılarak Fare Testlerinden Pachytene Spermatosit ve Spermatidlerin Zenginleşmesi

Burada yetişkin fare testislerinden canlı meiotik ve post-meyotik mikrop hücrelerini izole etmek için basit ve etkili bir yöntem salıyoruz. Düşük sitotoksisite, menekşe heyecanlı DNA bağlayıcı boya ve floresan-aktive hücre sıralama kullanarak, bir birçok downstream uygulamaları için son derece zenginleştirilmiş spermatojenik hücre popülasyonları izole edebilirsiniz.

Mor-Heyecanlı Hücre-Geçirgen DNA Bağlayıcı Boya Kullanılarak Murine Spermatojenik Hücrelerin İzolasyon

Bu makalede, erkek mayotik bölünmesi için değerli bir model olan abdominal cerrahi ve testiküler GSK923295 enjeksiyonu yoluyla CENP-E'nin in vivo inhibisyonu bildirilmiştir. İmmünofloresan, akım sitometrisi ve transmisyon elektron mikroskobu tahlillerini kullanarak, CENP-E inhibisyonunun fare spermatositlerinde kromozom yanlış hizalaması ve genom instabilitesi ile sonuçlandığını gösterdik.

Kinesin-7 CENP-E'nin In Vivo İnhibisyon, İmmünofloresan ve Akım Sitometrisi Kullanılarak Spermatositlerde Fonksiyonel Değerlendirilmesi

Burada, farelerde yuvarlak spermatid enjeksiyonu (ROSI) gerçekleştirmek için bir yöntem sunuyoruz, umut verici klinik uygulamaları olan ve embriyonik gelişimin altında yatan mekanizmaları araştırmak için faydalı bir teknik.

Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Keşfedin fare spermatidlerini akış sitometrisiyle dört saf popülasyona ayırma yöntemini. Bu teknik, spermiogenezin moleküler çalışmaları için çapraz kontaminasyonu en aza indirerek üreme biyolojisi araştırmalarını ilerletir.

Adım özgü Fare spermatidlerin Sıralama'yı Akışı Sitometrinin tarafından

Daha fazla video keşfet