Adım özgü Fare spermatidlerin Sıralama'yı Akışı Sitometrinin tarafından

Bu prosedürün genel amacı, fare spermatidlerini dört farklı popülasyona ayırmak ve spermiyogenezin moleküler çalışmasına izin vermektir. Bu yöntem, kromatik modellemenin genomik bütünlük üzerindeki etkisi gibi ayna üreme alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, spermin çapraz kontaminasyon olmadan saf hücre popülasyonuna ayrılmasını sağlamasıdır.

Bu yöntem için ilk olarak, hücre sıralamasından bir gün önce haplo parametrelerinde kromatinin yeniden şekillenmesi sırasında DN boyama yoğunluğunda önemli değişiklikler gözlemlediğimizde aklımıza geldi. Beş mililitre polipropilen yuvarlak tabana ve 15 ve 50 mililitre polipropilen konik tüplere bir ila iki mililitre ısıyla etkisiz hale getirilmiş FBS ekleyin. Daha sonra, ertesi gün bir döndürücü üzerinde dört santigrat derecede gece boyunca ters çevirerek tüpleri yavaşça kaplayın.

15 ve 50 mililitrelik tüplerden kalan FBS'yi çıkarmak için bir P 200 pipet kullanarak FBS'yi dikkatlice boşaltın ve hücrenin gününde saflaştırılmış hücreleri toplamak için beş mililitrelik tüplerde 100 ila 200 mikrolitre FBS'lik küçük bir kalıntı hacmi bırakın. Sıralama, kapsüllenmiş test parçalarını 500 mikrolitre ayırma tamponunda kıyın. Daha sonra doku parçalarını kesik bir mikro pipet ucu kullanarak 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Germ hücrelerini seminifer tübüllerden nazikçe yukarı ve aşağı pipetleme ile yıkayın, ardından sağlam bir uçla yıkayın. Daha sonra, süzüntüyü FBS kaplı 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayan kalıntıları ve kümeleri çıkarmak için 40 mikronluk bir hücre süzgeci kullanın. Filtreyi toplam hacmi üç mililitreye kadar ayırma tamponu ile bir kez yıkayın ve süzüntüyü FBS kaplı 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Daha sonra hücrelere mililitre hücre süspansiyonu başına 16 mikrolitre EDTA ekleyin ve hücreleri üç hacim buz gibi,% 100 etanol ile bir dakika boyunca yavaşça sabitlemek için 10 mililitrelik bir pipet kullanın, düşük hızda girdaplama sırasında, süspansiyon fiksasyondan sonra sütlü hale gelecektir. Hücreleri ara sıra ters çevirerek 15 dakika buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra hücre süspansiyonunu santrifüjleyin, paleti iki mililitre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin ve germ hücrelerini sıralamadan hemen önce dört mikrolitre cyto 16 DNAD ile boyayın.

Hücreleri 50 mikronluk bir filtreden FBS kaplı bir faks tüpüne süzün ve filtreyi bir ila iki mililitre ayırma tamponu ile iyice yıkayın. Sabit germ hücrelerini 488 nanometre lazerle donatılmış bir hücre sıralayıcıya yükleyin. Ardından, Alexa kat 4 88 alanına karşı olay sayısını temsil eden bir histogram ile toplam olayları görüntüleyin ve pozitif DNA boyama hücrelerini geçitleyin.

Ardından, bu geçitten gelen hücreleri, bir yan saçılma alanında, bir ileri saçılma alanı grafiğine ve kapısına karşı görüntüleyin. Belirtildiği gibi hücreler, bu kapılı hücreleri bir Alexa kat 4 88 alanına, çizimine ve kapısına karşı öne doğru bir saçılma alanında görüntüler. Hücreler daha sonra bu kapıları Alexa kat 4 88 alan parsellerine karşı Alexa kat 4 88 genişliğinde ayrı olarak görüntüler.

Spermiyogenez birden dokuza ve 10'dan 12'ye kadar olan adımlardır. Spermatidler daha sonra 13'ten 14'e ve 15'ten 16'ya kadar olan adımları toplamak için sıralama için kapılanabilir. Spermatidler, hücreleri ilk kapıdan bir EXOR 4 88 alan grafiğine ve kapısına karşı ileri bir saçılma alanına görüntüler.

Belirtildiği gibi hücre popülasyonları. Ardından bu kapıları ayrı ayrı Alexa'da görüntüleyin. Kat 4 88 Alexa'ya karşı genişlik kat 4 88 alan arsaları ve kapı.

Sıralama için 13'ten 14'e ve 15'ten 16'ya kadar olan adımlar. Son olarak, saflaştırılmış fraksiyonları 100 ila 200 mikrolitre FBS'de, buz üzerinde ayrı ayrı FBS kaplı beş mililitre yuvarlak tabanlı tüplerde toplayın. Bu görüntülerde, akışın zarif bir şekilde boyanması, sıralanmış, vurulmuş popülasyonlar gösterilmektedir.

Spermiyogenez bir ila dokuz spermatid arasındaki adımlar, tipik olarak spermiyogenezde oval şekilli görünen yuvarlak şekilli çekirdekler gösterir. Dokuzuncu adım spermatidler ve bunlar 10 ila 12. adımlarda uzun kancalar olarak gözlenir. Spermatidler spermiyogenez aşamaları 13 ila 14 ve 15 ila 16 spermatidler, benzer bir şekle sahip çekirdekler sergiler, ancak bu farklı DNA boyama yoğunluğuna sahiptir, bu da bu farklı sper popülasyonlarının akış sitometrisi ile sınıflandırılmaları sırasında tanımlanmasına izin verir.

Gösterilen protokolü takiben, deney yapılan bireysel S popülasyonlarının saflığının %95 ila %100 arasında olması beklenebilir. Bu teknik altı ila sekiz saat içinde tamamlanabilir. Her adım doğru bir şekilde takip edilirse. Bu prosedürü takip ederek hücreleri prosedür boyunca her zaman buz üzerinde tutmayı unutmamaktır, çünkü farklı sperm popülasyonları elde edilebilir, dramatik ting yeniden şekillenme sürecini karakterize etmek veya bu geçişin genetik etkisini incelemek gibi moleküler analiz için yeterli miktarda malzeme sağlar.