İnsan çevresel kanından üretilmesi ve kültür Blood üremesi Endotel Hücreleri

Bu protokolün genel amacı, insan periferik kanından güvenilir bir şekilde kan büyümesi endotel hücreleri üretmektir. Bu yöntem, endotel hücre disfonksiyonunun pulmoner arteriyel hipertansiyon veya von Willebrand hastalığı dahil olmak üzere kardiyovasküler hastalıklara nasıl katkıda bulunduğu gibi vasküler biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, küçük bir yetişkin periferik kan hacminden sürekli olarak stabil bir kan büyümesi endotel hücresi popülasyonu oluşturmasıdır Gösterme prosedürü, laboratuvarım ve laboratuvarım Profesör Nicholas Morrell'den yüksek lisans öğrencisi Christopher Wang olacaktır.

Bu prosedüre başlamak için. Her donör için, iki adet 50 mililitrelik konik santrifüj tüpünün her birine üç mililitre sodyum sitrat ekleyin. Daha sonra toplanan kandan 30 mililitre her tüpe ekleyin.

Karıştırmak için tüpleri iki ila üç kez yavaşça ters çevirin. Daha sonra, 60 mililitre kanı DPBS ile bire bir oranında seyreltin, yoğunluk gradyanını içeren tüpü eğin. Bir pipet yardımcısı ve 25 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak çalışma yüzeyi ile 20 derecelik bir açıyla santrifüjleme ortamı.

Ortamın üzerine yavaşça 21 mililitre seyreltilmiş kan koyun. Daha sonra, numuneleri hızlandırıcı ile oda sıcaklığında 35 dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyin ve koparın Santrifüjleme sırasında, stoğu seyrelterek mililitre başına 50 mikrogramda bir kollajen çözeltisini onarın. 10 mililitre 0.02 molar asetik asit steril içinde bir kollajen yazın.

Kullanmadan önce kollajen süspansiyonunu süzün. Daha sonra, bir T 75 hücre kültürü şişesine 7,5 mililitre kollajen çözeltisi ekleyin. Şişenin oda sıcaklığında bir saat kaplanmasına izin verin.

Bir saatlik kaplamadan sonra, kollajen solüsyonunu aspire edin ve kalan asetik asidi yıkamak için şişeye 10 mililitre DPBS pipetleyin. DPBS'yi aspire edin ve yıkamayı bir kez daha tekrarlayın. Ardından, hücre süspansiyonu kaplamaya hazır olana kadar kollajen kaplamanın kurumasını önlemek için şişeye beş mililitre BOEC üretim ortamı ekleyin.

Yoğunluk gradyan santrifüjlemesini takiben, steril bir plastik transfer pipeti kullanarak buffy coat tabakasını dikkatlice toplayın ve yoğunluk gradyan ortamının aktarılmasından kaçının. Buffy coat koleksiyonu, her tüpten yaklaşık 20 mililitre cel süspansiyonu ve plazma vermelidir. Daha sonra, DPBS'deki mononükleer hücre süspansiyonunu bire bir oranında seyreltin ve karıştırmak için ters çevirin, ardından santrifüjlemeden sonra fren ve hızlandırıcı maksimuma ayarlanmış olarak oda sıcaklığında 300 kez G'de 20 dakika santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve her pelete bir mililitre BOEC üretim ortamı ekleyerek hücreleri yeniden süspanse edin ve tekrar tekrar pipetleyerek tüm hücre süspansiyonlarını bir araya getirin ve Kalan ortam ile toplam hacim 10 mililitredir.

Toplam hücre sayısını tahmin etmek için, kırmızı kan hücrelerini yerleştirmek için 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu 490 mikrolitre Turk çözeltisi ile seyreltin. Daha sonra bir hemo sitometre kullanarak seyreltilmiş hücre süspansiyonunun 10 mikrolitrelik bir örneğini sayın. Daha sonra hücre süspansiyonunu tek bir kollajen kaplı T 75 şişesine yerleştirin.

Orta hacmi şişe ve kültür başına 15 mililitreye kadar doldurun. Hücreler 37 santigrat derecede% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde. Şimdi 15 mililitre taze BOEC üretimi ekleyerek ortamı iki günde bir değiştirin, hafta sonları için kültüre ortam, orta değişiklikler her üç günde bir geciktirilebilir.

Büyüme kolonilerinin görünümü için BOEC kültür şişesini yedi ila 14. günlerde izleyin. Kolonileri, klasik endotelyal parke taşı morfolojisini sergileyen dairesel hücre grupları olarak tanımlayın. Şişede bir koloni veya birden fazla koloni tanımlandıktan sonra, orta değişikliklerle devam edin ve kolonilerin koloni başına yaklaşık 1000 ila 2000 hücreye kadar büyümesine izin verin.

Paketlemeden önce, kaba bir görsel tahminle koloni başına hücre sayısını belirleyin. Daha sonra şişeleri 10 mililitre DPBS ile iki kez durulayarak hücreleri geçirin. Beş mililitre bir x tripsin EDTA ekleyin ve 37 santigrat derece inkübatörde beş dakika inkübe edin.

Beş dakika sonra, tripsini 10 mililitre FBS içeren ortam ile nötralize edin ve tekrarlanan pipetleme ile hücreleri süspansiyon haline getirin. Daha sonra, süspansiyonu beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin. Hücreleri 15 mililitre taze BOEC üretimi, ortamı içinde yeniden süspanse edin ve tüm hücre süspansiyonunu kollajen kaplaması olmayan yeni bir T 75 şişesine yerleştirin. Devam etmek.

Ortam, hücreler birleşene ve geçene kadar değişir. Devam eden ambalaj plakası için daha önce açıklandığı gibi hücreler. T 75 şişesi başına en az 750.000 hücre, çünkü düşük hücre yoğunlukları BO EEC'lerin çoğalmasını durdurabilir.

Bu prosedürde, tripsin hücreleri gözler ve beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjler. Bundan sonra, snat'ı aspire edin ve hücreleri 10 mililitre ortamda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonundan 10 mikrolitrelik bir numune toplayın ve manuel hücre sayımı yapın.

Daha sonra, numuneyi tekrar santrifüjleyin ve buz gibi soğuk kriyo koruma ortamında mililitre başına 10 ila altı hücre arasında iki kez yeniden süspanse edin. Her şişeye 0,5 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin ve şişeleri buz gibi soğuk bir izopropanol kriyo koruma kabına yerleştirin. Ardından, sıvı nitrojene aktarmadan önce kabı en az iki saat boyunca eksi 80 santigrat derece dondurucuya koyun.

Hücreleri çözmek için, 15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne 10 mililitre ön ısıtma ortamı ekleyin. Hücreleri sıvı nitrojenden çıkarın ve şişede sadece küçük bir buz kristali kalana kadar 37 santigrat derece su banyosunda hafif çalkalama ile çözdürün. Daha sonra şişenin içeriğini konik santrifüj tüpüne damla damla ekleyin ve beş dakika boyunca 300 kez G'de döndürün.

Daha sonra, süpernatanı aspire edin ve hücre peletini tekrar askıya alın. Hücre süspansiyonunu T 75 şişesine ekleyin ve ortamı 15 mililitreye kadar doldurun. Bu görüntüde, endotel benzeri hücre koleksiyonları olarak görünen çıkıntı kolonileri, bir parke taşı tek tabakasında düzenlenmiştir ve çıkıntı kolonilerini çevreleyen merkezi bir noktadan radyal olarak çoğalır, erken kültürlerdeki hücrelerin büyük çoğunluğunu oluşturan yapışık monositik hücrelerdir Paketlemeyi takiben, proliferatif olmayan monositik hücreler ya ölürken ya da yeniden bağlanamadıkça, yüksek oranda proliferatif bo Oec'ler kültürü devralır.

Burada, endotel hücre yüzey belirteci CD 1 44'e karşı bir antikorla boyanmış Bo Oecs immünolarının temsili bir immünofloresan görüntüsü verilmiştir. Ve bu görüntüde B oec'ler, kan glikoproteini von Willebrand faktörüne karşı bir antikorla immün boyaydı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki saatten daha kısa sürede yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, kan örneklerini mümkün olan en kısa sürede ve tercihen toplandıktan sonraki iki saat içinde işlemeyi hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, hücreler sağlık ve hastalıkta endotel hücre fonksiyonunu incelemek için kullanılabilir veya geliştirildikten sonra farklılaşma çalışmalarında, hastalık modellemesinde veya hücre tedavisinde kullanılmak üzere indüklenmiş flury potent kök hücrelere yeniden programlanabilir. Bu teknik, tip iki kemik morfogenetik protein reseptöründeki mutasyonların pulmoner arteriyel hipertansiyon patogenezi üzerindeki etkisini hem hasta kan büyümesi endotel hücrelerinde hem de IPSC'den türetilen duygudurum kas hücrelerinde incelememizin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, küçük bir periferik kan hacminden stabil kan büyümesi endotel hücrelerinin nasıl oluşturulacağını ve karakterize edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Taranmamış insan kanı ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven ve laboratuvar önlüğü de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman giyilmesi gerektiğini unutmayın.