Name: Fizyolojik Yanıtları Ölçüm Drosophila Canlı Kalsiyum Görüntüleme kullanma Lipit Feromonlar Sensory Nöronlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Öğrenin canlı kalsiyum görüntüleme yöntemiyle Drosophila tat alma duyu nöronlarının lipit feromonlara fizyolojik yanıtlarını ölçmeyi. Bu teknik bireysel nöron aktivitesini bütün bir organizmada çalışmaya olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Singapur Ulusal Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir (JYY'ye NRF-RF2010-06 hibesi).

1. Numune Hazırlama <ol><li> (P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40 1118 w) UAS-GCaMP5G 19 sinekler Gal4 3,22 sürücü çizgiyi. Çapraz 25 ° C&#39;de büyümeye olanak sağlar. Not: Yaratma floresan sinyal yoğunluğu arttırmak için yardımcı olabilir Gal4 veya UAS-GCaMP transgenlerin birden fazla kopya ile uçar. Gr68a-Gal4 sürücünün kontrolü altında eksprese edildiği zaman, UAS GCaMP transgeni (UAS GCaMP3) daha önceki bir versiyonu çok zayıf floresan yoğunluk gösterdi. <ol><li> Toplayın ve seks yeni eclosed yetişkin sinekler tarafından ayrı ve 25 ° C&#39;de yükseltmek. Not: GCaMP5G çiçeklenme bazal seviyesi 14-28 gün arasında değişen sinekler uygunudur. Cinsiyete göre sinekler Yalıtımlı nöral yanıtları etkileyebilir sosyal etkileşimler olasılığını engeller. </li></ol></li><li> CO 2 hafif bir akımı altında bir sinek uyutmak. </li><li> f takınly ilk 0,17 mm lamel merkezinde oje küçük bir damla koyarak bir cam lamel. Yavaşça net oje damla üzerinde yan bir sinek yerleştirin ve tüm damla anında kapsamında olduğundan emin olun. </li><li> 8X büyütme kullanılan bir diseksiyon stereomikroskop altında adımları 1.5 ve 1.6 gerçekleştirin. </li><li> sineğin bir ön bacağını uzatmak için ıslak bir fırça kullanın. Birinci ve beşinci tarsal kesimleri (Şekil 2A) üzerinden bant iki ince şeritler yerleştirerek pozisyonda ön bacağını elde edin. Bu görüntüleme (Şekil 2B) için tarsal segmanları T2 T4 gösterecektir. </li><li> Burnumun görüntü nöronlar, labellum (Şekil 2C, D) maruz burnumun kürsüden üzerinde bant ince bir şerit yerleştirin. </li><li> lamel yüzeyi üzerinde akan çözelti önlemek için bir PAP kalem ile anında yaklaşık bir hidrofobik bariyer çizin. Montaj 30 dakika içinde ölçüm yapmak. </li></ol> Stimulus 2. HazırlıkÇözüm <ol><li> Lipofilik ligandlan seyreltik PBST solüsyonu (örneğin, bu çalışmada kullanılan CH503 gibi): 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4,% 0.1 Triton X-100 (v / v ); pH 7.4. <ol><li> PBST kullanarak ligand 1 mg / ml stok çözelti yapmak. PBST kullanarak stok çözeltisi Müteakip tüm seyreltiler hazırlanır. Not: ilgi ligandın çözünürlüğüne bağlı olarak, farklı çözücüler ligandın çözülmesi için gerekli olabilir. Çeşitli çözücüler içinde CH503 çözünürlüğü Tablo 1&#39;de tarif edilmektedir. Diğer çözücüler farklı olarak, PBST floresansta bir artış sağlamamıştır. </li></ol></li></ol> Tat Nöronlar ve Image Acquisition 3. stimülasyonu <ol><li> 10 ul pipet kullanarak tarsal kesimleri üzerine PBST 10 ul yerleştirin. Not: Bu adım bacak nemlendirir ve sürüklenen gelen tarsal segmentleri engeller. </li><li> su bir kameraya sahip bir optik sistemini kullanınfficient hız ve hassasiyet yüksek zaman çözünürlüğü iyi floresan sinyal elde etmek. Not: Bu çalışma için biz dönen bir disk konfokal mikroskop ve bir sCMOS kamera (Malzeme listesi bakınız). </li><li> Belirli tarsal segment ve nöronlar seçin yansıması. üç ön stimülasyon konfokal Z-yığınlarının edinin. <ol><li> İdeal olarak, kullanım edinme ayarları hala tüm hücre hacmi çekerken maksimum süre çözünürlüğü izin verecek kadar hızlı. Örnek edinme ayarları şunlardır: her 2 saniyede yakalanan x 2 2 ve 6 x 0,5 mikron 2 optik bölümleri, binning 200 msn pozlama. Not: İmmobilize bacak GCaMP sinyalinin hiç bir farkedilebilir ağartılması ile, 30 saniye aralıklarla, en fazla 10 dakika için başarılı bir şekilde görüntülenmiştir edilmiştir. uzun kayıt süreleri için, bacaklar lamel yerinde çok sıkı tutulur emin olun. </li><li> en yüksek sinyal-gürültü bütün ima boyunca en az photobleaching ile elde için lazer gücünü optimizerejimi ging. Burada tarif edilen deneyler için, görüntüleme için% 30 iletim de bacaklar ve burnumun üzerinde Gr68a ve ppk23 tat nöronlar hem 491 nm diyot lazer (100 mW) kullanın. hala yeterli uzaysal çözünürlüğü elde ederken kısa pozlama süreleri için izin vermek için 2 x 2 binning kullanın. Not: lazer gücü ayarlar 1.2- 4.5 katlık bir artışa kadar fluoresan değişim saptanmasına olanak tanınması için optimize edilmiştir. </li></ol></li><li> Pipet tarsal kesimleri üzerine uyarıcı çözeltisinin 10 ul. Kontrol deneyleri için PBST bir 10 ul ekle. Hemen 117 sonrası uyarım görüntüler elde. Not: edinilen sonrası stimülasyon görüntülerin sayısı floresan maksimal değişiklik ulaşıldı edildiği süreyi (yaklaşık 2 dakika) dayanmaktadır. <ol><li> KRİTİK ADIM: Bu ön ayağı konumunun dışına hareket etmesine sebep olacağından hazırlama çözüm pipetleme iken, pipet ile sinek dokunmak yok. Not: Alternatif olarak, kullanımıdoğru tarsal segment uyaran yakın içeren bir cam kılcal konumlandırmak için bir mikromanipülatör yansıması. üreticinin talimatlarına göre bir hücre içi mikroenjeksiyon dağıtıcı kullanarak uyaran kontrol birimleri verin. </li></ol></li></ol> 4. Görüntü İşleme ve Analiz: Tepki sayısallaştırılması <ol><li> Fiji (kullanarak konfokal Z-yığınlarının bir dizi aç <a href="http://fiji.sc/Fiji" target="_blank">http://fiji.sc/Fiji</a> ) 23 veya ImageJ ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) 24 görüntü analizi ve işleme yazılımı. </li><li> 120 kez noktalarının her biri için altı Z dilim toplamı yoğunluklu projeksiyonu yapın. <ol><li> &quot;Image&quot; altında &quot;Yığın&quot; seçeneğini seçin. Ayrıca, &quot;Z projeksiyon&quot; seçeneğini seçin ve durdurma dilim olarak başlangıç ​​dilim ve &quot;4&quot; olarak &quot;1&quot; girin. projeksiyon tipi için, R seçin20; toplamı dilimleri Tüm zaman dilimlerini &quot;açılır menüden, ve seçim&quot; &quot;. </li></ol></li><li> bir hücrenin vücuda ya da nöronal projeksiyon etrafında bir sınır çizmek için serbest seçim aracını kullanarak ilgi (ROI) bölgesini tanımlar. &quot;Analiz&quot; etiketi tıklayın ve &quot;Araçlar&quot; altında &quot;ROI yöneticisi&quot; seçeneğini seçin. </li><li> , &quot;Analiz&quot; menüsü altında, &quot;Set ölçümler&quot; seçeneğini seçerek ve entegre yoğunluğu, alan için kutuları işaretleyerek ROI floresan ölçmek ortalama ve maksimum gri değer ve etiket. Ardından, YG yöneticisi menüsü altında &quot;Diğer&quot; seçeneğini seçin ve daha sonra &quot;Çok önlem&quot; seçeneğini seçin. Not: Bu, seçilen parametrelerin her biri için değerleri ile bir pop-up kutusu oluşturur. </li><li> Piksel hiçbirinin doygunluğa ulaşmıştır sağlamak için maksimum gri değerleri kontrol (örneğin, 16-bit kamera 65.535). Not: deneylerde, T gösterilenonun kağıt, yanıtlar kadar taşınmış / F maksimal artış gözlendi yere bağlı olarak hücre gövdeleri veya nöronal projeksiyonları, gelen ya ölçüldü. </li><li> Aşağıdaki gibi bir zaman noktasında t floresan (mesafe kadar taşınmış / F) maksimum bağıl değişim hesaplamak: <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/53392/53392eq1.jpg" /><ol><li> Her bir F (hücre) değerinden Çıkar eşiğe. Arka plan floresan ölçmek için, tespit edilebilir nöronların yoksun ön ayağın (ya da hortum) bir alandan eşdeğer boyut ve şekilde bir ROI entegre yoğunluğunu ölçer. </li><li> Post-stimülasyon floresan, F (hücre) t ölçmek için uyarılmasından sonra zaman noktası &quot;t&quot; hücre gövdesinin veya sürecin ROI entegre yoğunluğunu ölçmek. </li><li> Ön stimülasyon floresan ölçmek için, F (hücre) t = 0, aynı şekilde olarak hücre gövdesi veya sürecin öncesi uyaran görüntüleri analizPost-stimülasyon sinyali. F (hücre) t = 0 belirlemek için 3 görüntülerin ortalama entegre yoğunluğunu kullanın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candidate+taste+receptors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Candidate taste receptors in Drosophila.</a> Science. 287, 1830-1834 (2000).</li>
<li>Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+expression+of+candidate+taste+receptors+in+the+Drosophila+gustatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system.</a> Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).</li>
<li>Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+chemoreceptors+mediate+male-male+repulsion+and+male-female+attraction+during+Drosophila+courtship%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship.</a> Cell. 149, 1140-1151 (2012).</li>
<li>Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+female+aphrodisiac+pheromone+activates+ppk23%28%2B%29+sensory+neurons+to+elicit+male+courtship+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior.</a> Cell Rep. 1, 599-607 (2012).</li>
<li>Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+pheromone-sensing+neurons+expressing+the+ppk25+ion+channel+subunit+stimulate+male+courtship+and+female+receptivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity.</a> PLoS Genet. 10, 1004238(2014).</li>
<li>Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ppk23-Dependent+chemosensory+functions+contribute+to+courtship+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster.</a> PLoS Genet. 8, e1002587(2012).</li>
<li>Koh, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+IR20a+Clade+of+Ionotropic+Receptors+Are+Candidate+Taste+and+Pheromone+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors.</a> Neuron. 83, 850-865 (2014).</li>
<li>Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+taste+of+the+Drosophila+gustatory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">A taste of the Drosophila gustatory receptors.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).</li>
<li>Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+organs+of+Drosophila+melanogaster%3A+fine+structure+and+expression+of+the+putative+odorant-binding+protein+PBPRP2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2.</a> Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).</li>
<li>Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+coding+of+bitter+taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Peripheral coding of bitter taste in Drosophila.</a> J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).</li>
<li>Rodrigues, V., Siddiqi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gustatory+mutant+of+Drosophila+defective+in+pyranose+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors.</a> Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).</li>
<li>Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+antagonistic+gustatory+receptor+neurons+responding+to+sweet-salty+and+bitter+taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila.</a> J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).</li>
<li>Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+taste+coding+in+the+legs+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila.</a> J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).</li>
<li>Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recording+from+Drosophila+labellar+taste+sensilla%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla.</a> J. Vis. Exp. , e51355(2014).</li>
<li>Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+individual+firing+frequencies+of+two+neurons+recorded+with+a+single+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode.</a> Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).</li>
<li>Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+neural+circuits+with+activity-dependent+nuclear+import+of+a+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor.</a> J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+the+GCaMP+calcium+sensor+reveal+the+mechanism+of+fluorescence+signal+change+and+aid+rational+design%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design.</a> J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).</li>
<li>Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Drosophila+glucose+receptor+using+Ca2%2B+imaging+of+single+chemosensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons.</a> PloS One. 8, e56304(2013).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li>
<li>Shikichi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+synthesis.+Part+250%3A+Determination+of+the+stereostructure+of+CH503+a+sex+pheromone+of+male+Drosophila+melanogaster%2C+as+%283R%2C11Z%2C19Z%29-3-acetoxy-11%2C19-octacosadien-1-ol+by+synthesis+and+chromatographic+analysis+of+its+eight+isomers%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron%22%5BJournal%5D)">Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers.</a> Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).</li>
<li>Yew, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+male+sex+pheromone+and+novel+cuticular+cues+for+chemical+communication+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila.</a> Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).</li>
<li>Bray, S., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+Drosophila+pheromone+receptor+expressed+in+male-specific+taste+neurons+is+required+for+efficient+courtship%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship.</a> Neuron. 39, 1019-1029 (2003).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+processes+in+insect+olfactory+receptors.+Mechanisms+and+behavioral+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).</li>
<li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+pattern+generators+and+the+control+of+rhythmic+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Central pattern generators and the control of rhythmic movements.</a> Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).</li>
<li>Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+function+of+neural+oscillations+in+early+sensory+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems.</a> Front Neurosci. 4, 53(2010).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361, 315-325 (1993).</li>
<li>Busch, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+signaling+from+O%282%29+sensors+sets+neural+circuit+activity+and+behavioral+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state.</a> Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarların olmadığını beyan eder.

Biz burada 2 farklı duyu organları Drosophila periferik nöronların canlı kalsiyum görüntüleme gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ca + 2 CH503 doza bağımlı ve nicel olduğu feromon ligand ile uyarılan Gr68a-nöronlarda GCaMP fluoresan yanıt -evoked. Böyle fazik ve tonik yanıtlar gibi farklı nöral yanıt desenleri ayırt etmek de mümkündü. Fazik tepkiler gösteren nöronlar sürekli uyaranlara hızlı uyum sağlamak olduğuna inanılmaktadır. Yanıtın Bu tip koku algılama ...

Hayvanlar hayatta kalma ve üreme için gerekli kararları arabuluculuk koku ve tat bilgilere güveniyor. Algılanabilir ve sinir sistemi tarafından nasıl işlendiğini kimyasal duyu ipuçları anlama duyu reseptör (ler) ve karşılık gelen kimyasal ligand tanımlanmasını gerektirir., Drosophila uçucu ve uçucu olmayan bileşiklerin şaşırtıcı bir dizi tespit etmek ve fizyolojik olarak incelenmesi için mükemmel bir modeldir mekanizmalar chemosensation altında yatan. koku organları uçucu moleküller algıladıkları iken, tat organları düşük volatilite bileşikleri tespit etmek için uzman bulunmaktadır. Burada, doğrudan düşük volatilite, lipofilik ligandlara Drosophila melanogaster tat organlarından nöronal tepkilerini ölçmek için bir yöntem mevcut. sinek tat organları kol, burnumun ve kanatları dahil. s yanıt Sensilla olarak bilinen saç benzeri yapılar tat organları yüzeyi üzerinde dağıtılırugars, bitters, tuzlar, su ve feromonlar 8. Sensilla tat kıllar içine morfolojik tasnif edilmiş ve tat 9 mandal. uzun (L-tip) sınıflandırılır labellum yaklaşık 31 tat kılların kısa (S-tipi) ve ara madde (I-tipi) morfolojileri vardır. Şeker fizyolojik yanıt &#39;L&#39; ve &#39;S&#39; Sensilla evi 4 duyu nöronları (S hücresi), düşük tuzlu (L1 hücresi), tuz ve acı bileşikleri (L2 hücre) ve su (W hücresi) 10 11. Diğer cevaplarından ise yüksek tuz 12 düşük tuz ve şeker hem tepki biri &#39;i Sensilla evi 2 duyusal nöronlar,. erkeklerde yaklaşık 41 tat Sensilla ve Ön ayakların her dağıtılmış kadınlarda 26 Sensilla vardır. Her iki erkek ve kadınlarda, midleg 21 Sensilla ve hindleg 13 yaklaşık 22 Sensilla vardır. ayakları üzerinde tat Sensilla çevrili tat nöronlar da c vardırL1, L2, W ve S tipe lassified. tek nöronların elektrik aktivitesini ölçmek için bir standart yöntem iyon akışını kaydetmek için hücre dışı ya da hücre içi elektrotlar kullanır. Elektrot ölçümleri nöronal fonksiyonu, Drosophila türüne, kelebekler ve nöral etiketleme için geniş genetik araçları yoksun arılar gibi non-model organizmaların incelenmesi gereken sağlar. Elektrofizyolojik yöntemler rutin bu yaklaşımı uygulayarak, 4,13,14 Sensilla Drosophila tadı aktivitesini ölçmek için kullanılır olmuştur Bununla birlikte, birçok teknik zorluklar getirmektedir. İlk olarak, kıllar morfolojisi ve uzamsal yere göre tespit edilmesi gerekir tadı. kimlik üzerine, elektrofizyolojik ölçümler, Sensilla küçük boyutu ile engellenmiş olabilir pozisyona bağlı erişilebilirlik sınırlıdır ve bir tat kimyasal uyarıcı kontrollü hacimleri uygulayarak zorluk kıl. Ayrıca, Sensilla uyarılması birden fazla sinyal oluşturabilirnöronal tip 15. İkinci olarak, elektrik sinyallerinin tespiti elektronik cihazların mekanik titreşim ve gürültü kaynaklanan arka plan gürültüsünü tarafından eleştirilmiştir olabilir. Yanlış 14 kullanıldığı takdirde Üçüncü olarak, bir bilenmiş elektrodun kullanılması, sinek hazırlık zarar verebilir. Son olarak, bir elektrofizyoloji teçhizat montaj uyaran teslim sinyal kayıt ve veri analizi için özel elektronik bileşenleri gerektirir ve masraflı olabilir. D. melanogaster, genetik olarak kodlanmış araçların kullanılabilirliği nöronların küçük popülasyonlarının yanıtları okudu izin görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesini kolaylaştırmıştır. Bu tür bir yaklaşım CaLexA raportör 16 kullanımıdır. Bu yöntemde, LexA-VP16 transkripsiyon faktörü ve kalsiyuma duyarlı bir protein NFAT kodlayan gen dizileri birbirine birleştirilir. protein fosfataz calcineurin&#39;in kalsiyum aktivasyon dönüş, facilita içinde, NFAT de-fosforilasyon katalize veçekirdeğin içine ithal TES. çekirdeğin içinde, LexA alan, böylece, işlevsel aktif nöronların sürekli teşhisine izin veren, yeşil flüoresan proteini (GFP) raportörün ifadesini yöneten bir LexAOp-DNA bağlanma motifi ile bağlanır. Yaklaşım odorant 16 canlı sinek maruz kaldıktan sonra antennal lobda özel koku glomerulusların tepkisini ölçmek için başarıyla kullanılmaktadır. Son zamanlarda, IR52c tat reseptör nöronların fizyolojik yanıtlar CaLexA 7 kullanılarak canlı sinekler ölçüldü. 6 haftaya kadar GFP transkripsiyonu geliştirmek için Ancak, bu çalışma için, bu yaş sinekler gerekliydi. Bir anti-GFP antikoruyla immün CaLexA sinyali artırmak için kullanılabilir, ancak bu durumda, yöntem, canlı hücre görüntüleme olasılığını engelleyen, doku fiksasyon gerektirir. genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi proteini GCaMP da kapsamlı bir dizi nöronal yanıtları incelemek için kullanılmıştırtürler 17. Protein GCaMP nöronal uyarım önce düşük yoğunluklu fluoresces. Uyarıcı uygulanması Ca2 + akışı ile sonuçlanır nöron bir eylem potansiyeli tetikler. Ca + 2 bağlı GCaMP, bu daha parlak yoğunluk (Şekil 1) ile floresan neden konformasyonel değişime uğrar. Son yıllarda geliştirilmiş olan tek nöron kalsiyum görüntüleme yaklaşımı ön ayağı belirli bir Gr61a tat nöronlar 18 için ligand olarak glükoz tespit etmek için kullanıldı. Bu çalışmada, Gr61a tat nöronlarda GCaMP eksprese Drosophila kesilerek ön bacakları görüntüleme önce agaroz tabakası ile kaplanmıştır. Bununla birlikte, kesilerek doku kullanımı, böylece ölçüm süresi ve saptama hassasiyetini sınırlayıcı GCaMP ifade nihai özet neden olabilir. Buna ek olarak, agaroz, yüksek floresan arka plan seviyeleri ve ışık saçma özelliklerine duyarlılık sınırlayabilir. To Bu sakıncalardan bazılarının ele, biz ön ayağın ve burnumun bozulmamış hayvanların tat nöronlar gelen fizyolojik yanıtları kaydetmek için GCaMP aracılı kalsiyum görüntüleme kullanımını tarif eder. Biz, bir Drosophila lipit feromon genetik olarak kodlanmış GCaMP5G 19 ifade eden fizyolojik Gr68a cevaplan ve ppk23 nöronlar, (3R, 11 Z, 19 Z) -3-asetoksi-11,19-octacosadien-1-ol (CH503), 20 göstermektedir 21. Nöronal tepkiler feromon uyarımı esnasında GCaMP5G sinyalinin floresanstaki artışı miktarının ile ölçülür. Bu protokolde, nöronlar bireysel hücrelerin nöronal aktivasyon kalıplarını ayırt etmek yeterlidir 120 sn, toplam süresi görüntülenmiş.

<table><tbody><tr>H. Amrein'den <td>Gr68a-Gal4</td><td></td><td></td><td>Hediyesi (Texas A& M Sağlık Bilimleri Merkezi, Teksas, ABD) ve J. Carlson (Yale Üniversitesi, CT, ABD)</td></tr> <tr>K<td>. Scott'tan (Kaliforniya Üniversitesi, Berkeley, CA, ABD)</td> <td>ppk23-Gal4</td><td></td><td></td></tr> HediyesiUAS-GCaMP5<tr><td>&nbsp;</td><td></td><td>42037</td><td>Bloomington Drosophila&nbsp; Stok Merkezi</td></tr><tr><td>0.17 mm lamel (Gold-Seal lamel )</td><td>Elektron Mikroskobu Hizmetleri</td><td>63790-10</td><td></td></tr><tr><td>Oje, "Sert Çivi Kadar Şeffaf"&nbsp;</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP kalemi</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>Z377821</tr><tr><td>Boya fırçası</td><td></td><td></td><td>ince uçlu fırça</td></tr><tr><td>Bandı&nbsp;</td><td>İskoç markası</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>13021</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, laboratuvar sınıfı</td><td>Merck</td><td>10094</td><td></td></tr><tr><td>Hekzan, HPLC sınıfı</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H303SK-4</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>472301</tr> Mori >et al<.>> sCMOS Kamerada (ORCA Flash4.0) açıklanan <tr><td>CH<sub5</<>subsub3</td><td></td><td></td><td>Sentez</td></tr><tr><td>protokol bölümünde açıklanan</td><td>PBST</td><td></td><td></td> Tarifi</tr> <tr><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td></td><td>C11578-22U</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop (Ti-Eclipse)</td><td>Nikon</td><td>Ni-E</td><td></td></tr><tr><td>Dönen Disk Tarama kafası&nbsp;</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1-A1</td><td></td></tr><tr><td>Aquistion Yazılımı (MetaMorph Premier)</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>40002</td><td></td></tr><tr><td>Fiji yazılımı</td><td>açık kaynak</td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji</a></td></tr></tbody></table>

fizyolojik yanıtları Ölçüm<em&gt; drosophila</em&gt; canlı kalsiyum görüntüleme kullanma lipit feromonlar sensory nöronlar

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Memeliler aksine, örneğin Drosophila olarak böcekler birden tat organları vardır. Bacaklar, burnumun, kanat ve Drosophila ovipositor üzerine nöronların tat reseptörleri 1,2, iyon kanalları 3-6 ve uçucu ve uçucu olmayan duyusal ipuçlarının saptanmasında katılan iyonotropik reseptörler 7 ifade eder. Bu nöronlar doğrudan gıda, zararlı maddeler ve feromonlar gibi tat yoğunluğu arttırıcı başvurun ve bu nedenle bu tür beslenme, yumurtlama ve çiftleşme gibi birçok karmaşık davranışlar etkilemektedir. Elektrot kayıtları ve kalsiyum görüntüleme yaygın olarak bu tat yoğunluğu arttırıcı tarafından uyarılmış nöronal yanıtları ölçmek için böcekler kullanılmaktadır. Ancak, elektrofizyoloji hücre tipi, boyutu ve konumuna bağlı olarak teknik olarak zor olabilir, tek bir tat Sensillum gelen özel ekipman ve elde ölçümleri gerektirir. Buna ek olarak, Drosophila tek nöron çözünürlüğü tat Sensilla hou beri elde etmek zor olabilirkimyasal duyu nöron se birden fazla türü. Burada anlatılan canlı kalsiyum görüntüleme yöntemi canlı sinekler tek tat nöronların yanıtları ölçülecek sağlar. Bu yöntem, su bazlı çözücüler içinde düşük çözünürlüğe sahip, lipid feromonlar ve diğer ligand türlerine nöronal yanıtları görüntüleme için özellikle uygundur.

GCaMP kalsiyum göstergesi genetik Gr68a-Gal4 veya ppk23-Gal4 sürücüleri kullanarak ifade edildi. Kol nöronlar ve nöral olmayan destek hücrelerinin ayrı nüfus her sürücü (Şekil 3A-C) tarafından sınıflandırılmıştır. Lipofilik feromon CH503 ligand spesifik yanıtlar Gr68a-Gal4 gözlendi ve ppk23-Gal4 hücreleri GCaMP (Şekil 3D) ifade. Görece GCaMP5G sinyali (kadar taşınmış / F) flüoresan yoğunluğundaki değişim ve CH503 (Şekil 3E) v...

Drosophila'nın ön ayakları ve hortumu, tat alma duyusal nöronlarının zengin bir repertuarını içerir. Burada, canlı sineklerin ön bacak ve hortumundaki duyusal nöronlardan gelen fizyolojik tepkileri ölçmek için kalsiyum görüntüleme kullanan bir yöntem sunuyoruz.

Fizyolojik Yanıtları Ölçüm<em&gt; Drosophila</em&gt; Canlı Kalsiyum Görüntüleme kullanma Lipit Feromonlar Sensory Nöronlar

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Bu prosedürün genel amacı, Drosophila gustatuar nöronlarının lipid feromonlara verdiği fizyolojik yanıtları ölçmektir. Bu teknik, yetim gustatuar reseptörlerin ligandlarının belirlenmesi gibi duyusal nörobiyolojideki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tekil gustatuar nöronların yanıtlarının bozulmamış, canlı bir hayvan üzerinde incelenebilmesidir.Sinek anestezi edildikten sonra, çok küçük bir şeffaf oje damlası kullanarak onu 0.17 milimetrelik bir lamelle sabitleyin. Sineğin yan tarafını, damlanın tamamını kullanarak lama yapıştırın. Ardından, bir diseksiyon mikroskobu altında, ıslak bir resim fırçası kullanarak sineğin bir ön bacağını uzatın.Ardından, iki çok ince bant şeridi kullanarak birinci ve beşinci tarsal segmentleri lamelle sabitleyin. Eğer probosisteki nöronların görüntülenecekse, labellumu açığa çıkarmak için probosisin rostrum kısmının üzerine başka bir ince bant şeridi yerleştirin. Şimdi, PAP kalem kullanarak sineğin etrafına kısa bir duvar oluşturun.Ölçümlerden önce anestezinin etkisinin geçmesi için yarım saat bekleyin. Bu protokol için, 1 mg/mL stok ligand çözeltisinin gerekli seyreltmelerini PBST kullanarak hazırlayın. İşleme

measuring-physiological-responses-drosophila-sensory-neurons-to-lipid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz yaşam antennal lobda koku uyarılmış kalsiyum yanıtları ölçmek ve analiz etmek için kurulmuş bir tekniği...

Koku-uyarılmış Cevaplarının Kalsiyum Görüntüleme Drosophila Antennal Lob

Belirlenen Nöronlar ve Beslenme Davranışı Kalsiyum sinyaller aynı anda kayıt Drosophila melanogaster</em

Bu videoda, GCaMP kullanılarak Drosophila nöronlarında in vivo kalsiyum görüntüleme açıklanmaktadır. Öne çıkan protokol klibi, bir koku alma koşullandırma deneyi sırasında mantar vücut nöronlarından GCaMP floresansındaki değişikliklerin nasıl kaydedileceğini gösterir.

Drosophila In Vivo Kalsiyum Görüntüleme: Nöronal Aktivitenin Fonksiyonel Görüntülenmesi İçin Bir Yöntem

Bu video, ligand bağlanması ve floresan görüntüleme kullanarak Drosophila'da duyusal nöron tepkilerini tespit etmek için bir yöntemi göstermektedir. Ligandlar nöron reseptörlerine bağlanarak kalsiyum akışına neden olur. Kalsiyum, gösterge komplekslerine bağlanarak floresan emisyonuna yol açar ve bu da ligandın nöronal tepkisini doğrular.

Drosophila'da Duyusal Nöronlardan Gelen Fizyolojik Tepkilerin Saptanması

Bu videoda, sineklerde sinaptik olarak lokalize kalsiyum sensörleri kullanılarak in vivo kalsiyum görüntüleme yöntemi gösterilmektedir. Sinekleri mikroskopi için hazırlamak, koku alma koşullandırması yapmak ve koku kaynaklı kalsiyum akışını görselleştirmek için adımları ana hatlarıyla belirtir.

In vivo (İn canlı) Drosophila melanogaster'de Sinaptik Lokalize Kalsiyum Sensörleri Kullanılarak Kalsiyum Görüntüleme

Kaynak: Ishimoto, H. et. al., Drosophila'da endokrin sinyalizasyona beyin tepkilerini görselleştirmek için ex vivo kalsiyum görüntüleme. J. Vis. Uzm.  (2018) Bu video, çalışmak için kalsiyum görüntülemeyi göstermektedirDrosophila nöropeptitlere beyin tepkileri. Floresan kalsiyum indikatörünü eksprese eden nöronlar, hücre içi kalsiyum dinamiklerini ve sinyal moleküllerine fonksiyonel tepkileri ortaya çıkarır.

Drosophila Beyninin Nöropeptitlere Tepkilerini İncelemek için Ex Vivo Kalsiyum Görüntüleme

Bu makalede, Drosophila yumurta aktivasyonu sırasında 2+ Ca görselleştirmek için uyarlanabilir ex vivo protokolü açıklanır.

Görüntüleme Kalsiyum<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Aktifleştirme de

Bu kağıt için ex vivo kalsiyum düşsel Drosophila beyin protokolünü açıklar. Bu yöntemde, doğal veya sentetik bileşikler beyindeki belli nöronlar etkinleştirmek için yeteneklerini test için tampon uygulanabilir.

Ex Vivo Endokrin Drosophila içinde sinyal beyin yanıt-e doğru görüntülenmesi için kalsiyum görüntüleme

Burada drosophila öğrenme ve bellek bağlamında pre-ve/ veya postsinaptik kalsiyum görselleştirilebilen bir protokol sayılmaktadır. Sinapti lokalize kalsiyum sensörleri kullanılarak yapılan in vivo kalsiyum görüntüleme, bu tür bir assosiyatif öğrenmenin altında yatan sinaptik plastisitenin belirlenebileceği klasik koku alma koşullandırma paradigması ile birleştirilir.

Drosophila melanogaster Öğrenme Kaynaklı Sinaptik Plastisite Vivo Optik Kalsiyum Görüntüleme

Kalsiyum görüntüleme yaklaşımı, labelluma bir çözelti uygulanırken uyanık sineklerin beyinlerinde tat kaynaklı tepkilerin kaydedilmesini sağlar. Drosophila melanogaster'deki birincil tat tepkileri örnek olarak kullanılır, ancak bu protokol aşağı akış nöronlarını veya diğer türleri incelemek için uyarlanabilir.

In vivo (İn canlı) Erişkin Drosophila'da Tat Kaynaklı Nöral Yanıtların Kalsiyum Görüntülemesi

İmmobilizasyon için topikal bir doku yapıştırıcısı kullanarak bir Drosophila larva koku alma nöronu için kalsiyum görüntüleme protokolleri sunuyoruz. Bu yöntem stabiliteyi artırarak güvenilir in-vivo ve ex-vivo deneyleri kolaylaştırır. Özel R komut dosyaları kalsiyum sinyallerini analiz ederek ayrıntılı nörofizyolojik araştırmalar için etkili bir platform sağlar.

Üçüncü Dönem Drosophila melanogaster Larvasında Bir Koku Alma Devresi Nöronunun İn-vivo ve Ex-vivo Kalsiyum Görüntülemesi

Öğrenin canlı kalsiyum görüntüleme yöntemiyle Drosophila tat alma duyu nöronlarının lipit feromonlara fizyolojik yanıtlarını ölçmeyi. Bu teknik bireysel nöron aktivitesini bütün bir organizmada çalışmaya olanak tanır.

Fizyolojik Yanıtları Ölçüm

Daha fazla video keşfet