Koku kılavuzluğunda Davranış Yüksek çözünürlüklü Niceleme Drosophila melanogaster Flywalk Paradigma

Bu davranışsal biyo-tahlilin genel amacı, sirke sineklerinde koku güdümlü davranışı araştırmaktır. Fly Walk, birden fazla sineğin koku alma uyaranlarına verdiği davranışsal tepkileri otomatik olarak izleyen ve analiz eden yüksek verimli bir sistemdir. Bu yeni teknik, böcek koku alma alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Mesela bir kokunun hedonik dengesi nedir ya da bu dengeye ek koku maddelerinin eklenmesi ne anlama gelir? Bu deneyin temel avantajı, koku güdümlü davranışı yüksek geçici çözünürlükte yapabilmemiz ve böceklerin doğada deneyimlediklerine veya elektrofizyolojik kayıtlarda kullandıklarımıza benzer koku uyaranları kullanmamızdır. Genel olarak, bu yöntemi kullanmaya çalışan kişiler zorlanabilir çünkü gerçekten, hava geçirmez bir sisteme ihtiyaç duyar, bu nedenle havanın nereden geçtiğini bilmeniz ve havanın sistemden çıkabileceği hiçbir sızıntı olmadığından emin olmanız gerekir. Bu deneyler için, sinekleri 12 ila 12 açık karanlık döngü altında, düşük ila orta kültürlerde yetiştirmek önemlidir. normal gıda ortamı.

Oda sıcaklığını 23 ila 25 santigrat derece arasında tutun ve hazırlık sırasında bağıl nem yaklaşık %70 olmalıdır. Büyük kültür şişeleri kullanarak, bir hafta boyunca 20 ila 30 yetişkin yaptı ve deneysel bir kohort oluşturmak için 30 ila 40 karışık cinsiyetten oluşan gruplar topladı. Bir kohort iki ila dört günlük olduğunda, nemli bir köpük tıkaç veya nemli bir kağıt mendil içeren yeni bir şişeye aktarın.

Testten önce sineklerin bu şişede 24 saat aç kalmasına izin verin. Bu transfer sırasında sineklerin uyuşturulmaması hayati önem taşır. Bu kurulum için, 250 mililitrelik şişeler birçok nemlendirici görevi görür.

Her şişeyi 100 mililitre damıtılmış su ile doldurun. Daha sonra, her bir koku maddesinin yarım mililitrelik çalışma stoklarını, saf kokuların ve mineral yağın 1000 oranında seyreltilmesi olarak hazırlayın. Benzer şekilde, negatif kontrol görevi görmesi için sadece mineral yağ içeren bir PCR tüpü hazırlayın.

Şimdi her koku verici için koku dağıtım sistemini hazırlayın. Deneyde. Her koku şişesine iki küresel çek valf bağlayın.

Koku şişelerini doğru akış yönünde bağladığınızdan emin olun. Yanlış bir bağlantı yalnızca planlanan deneyi tehlikeye atmakla kalmaz, aynı zamanda dağıtım sistemini de kirletebilir. Ardından, sistemde sızıntı olup olmadığını kontrol edin.

İlk olarak, karıştırma odasının çıkışını kapatın. Ardından, uyaran cihazı sıfıra düşmeden önce tüm hava akışının olup olmadığını kontrol edin. Sistemde sızıntı varsa, onları dinleyin.

Genellikle önemli bağlantılarda lastik contaların değiştirilmesiyle veya Teflon boruların değiştirilmesiyle çözülebilirler. Bu prosedürün ilk adımı için camın kırılması endişe vericidir, bu nedenle koruyucu giysiler giyin. 15 ayrı test sineğini dikkatlice ayrı cam tüplere aktarın Bir aspiratör kullanarak, ilgili adaptörleri kullanarak her iki taraftaki cam tüpleri kapatın, çok sıkı oturmaları gerekir.

Ardından, yüklenen cam tüpleri sinek yürüyüşü kurulumuna bağlayın. Tüm tüpler takıldıktan sonra, deneye başlamadan önce sineklerin en az 15 dakika yeni ortama alışmasına izin verin. Şimdi ışık kaynağını açın.

Cam tüplerin içindeki sıcaklığı artırmadan verimli izleme için yeterli ışık sağladığınızdan emin olun. Kapalı bir sistem oluşturmak için koku şişelerinin tümü bu noktada bağlanmalıdır. Alışma süresi, sızıntı olmayan kapalı bir sisteme dayanır, bu nedenle tüplerden geçen hava akışı, test periyotlarındakiyle aynı hızdadır.

Bilgisayardaki hava akışını kontrol edin, dijital akış ölçerlere bağlayın. Sistemden çıkan toplam hava akışı, sisteme giren hava akışına eşit olmalıdır. Değilse, bir sızıntı var.

Sızıntı, tüm tüplerdeki hava akışını etkileyecektir, ancak sorunlu tüp genellikle hava akışında en büyük düşüşü gösteren tüptür. Yeni bir sızıntı tespit edilirse, buna genellikle adaptörün içinde kırılan bir cam tüp neden olur veya önceki deneylerden kalan adaptörlerin içindeki cam parçaları neden olur. Bu işlem sırasında, sinekler tüplerine alıştıktan sonra sistemden çıkan havanın nem oranının %60 ile %80 arasında olduğundan emin olun.

Prensip olarak, şimdiye kadar herhangi bir koku dizisi sunulabilir. En iyi sonuçlar, uyaranları rastgele hale getirerek ve en az 90 saniye ayırarak elde edilebilir. Toplamda.

Her kokuyu 500 milisaniyelik darbelerde 40 kez sunun. Ardından, izlenecek alan boyunca bir çerçeveyi sürükleyerek bir ilgi alanı oluşturun. Çerçevedeki 15 cam tüpün tümünü dahil edin, ancak tüp uçlarının dıştaki beş milimetresini hariç tutun.

Bir sonraki adım, izleme yazılımını kapatmak ve komut dosyasında değişiklikler yapmaktır. Bu, tek tek tüpleri ayıran 14 paralel çizginin Y ekseni konumunu değiştirecektir. İzleme yazılımı tekrar açıldığında, herhangi iki satır arasında yalnızca bir sinek bulunmalıdır.

Ardından, kamera parametrelerinin, sineklerin cam tüpler boyunca güvenilir bir şekilde izlenmesi için ayarlandığından emin olun. Sinekler ilgilenilen bölgenin kenarlarında kaybolursa, izleme yazılımının parlaklığını veya kazancını artırın. Artık sistem tamamen hazır olduğuna göre, teşvik protokolünü başlatın.

Sinek konumlarını saniyede 20 kare hızında kaydedin ve bu koordinat konumlarını koku valfi durumuyla birlikte metin dosyalarına kaydedin. Deney kokulara karşı çok hassas olduğundan, cam tüpleri temizlemek, deterjana batırmak ve ardından akan damıtılmış su altında durulamak için düzenli temizlik gereklidir. Durulamadan sonra, tüpleri basınçlı hava altında kurutun ve ardından sekiz saat boyunca 200 santigrat dereceye ısıtın.

Önce koku dağıtım sistemini temizlemek için, tüm koku şişelerini ve borularını merkezi karıştırma odasından çıkarın. Ardından boru adaptörlerini karıştırma haznesinden çıkarın. Boşaltılan karıştırma haznesini, tüpler gibi bir davlumbaz altında bir çözücü ile durulayarak temizleyin.

Karıştırma haznesini basınçlı hava kullanarak kurutun ve sekiz saat boyunca 200 santigrat derecede ısıtın. Koku şişelerini ve valfleri temizlemek için çelik tapaları çıkarın, lastik contaları atın ve çek valfleri, sabun çek valflerini ve etanolü ve hem etanol hem de asetondaki diğer bileşenleri çıkarın. Daha sonra, ıslatılmış bileşenleri maksimum ayarda 30 dakika boyunca sonikasyon yapın ve damıtılmış suyla durulayın.

Daha önce olduğu gibi, kurutmak için basınçlı hava kullanın ve bileşenleri sekiz saat boyunca 200 santigrat dereceye ısıtın. Aseton hava akışı yönüne geldiğinde, aseton kauçuk parçalara saldırdığından, yıkanmış çek valflerden kalan tüm kokuları gidermek için yıkanmış her bir çek valfi hemen basınçlı hava ile kurulayın. Birkaç gün boyunca içlerinden hava püskürtün, hava akışı bir saniyelik aralıklarla açılıp kapanacak şekilde 60 derecelik bir inkübatöre yerleştirin.

Aç kalan 15 dişi sinek etil bütirata maruz bırakıldı. Sarı çubuk koku nabzını temsil eder. Mavi kareler, 100 milisaniyelik bir zaman dilimi içinde rüzgara karşı hareketi gösterir.

Buna bağlı olarak kırmızı kareler rüzgar yönündeki hareketi tasvir eder. Aynı sinekler, popülasyona ortalama olarak isop pentil asetat, etil asetat veya iki üç bütan d ile stimülasyona yanıt olarak rüzgara karşı hareket de gösterdi. Sineğin etil asetata tepkisi keskin bir başlangıçlı, yüksek genlikli ve kısa bir süreye sahipti.

Buna karşılık, iki üç bütan Dion'a verilen yanıt, daha sonra bir ortalama başlangıç, daha düşük genlik ve daha uzun bir süreye sahipti. Sonuç olarak, her bir koku maddesinden elde edilen veriler bu şekilde çözüldü ve daha sonra dört kokunun tümünün çözücüden dört saniye içinde daha yüksek bir rüzgar yukarı yer değiştirmesi ortaya çıkardığını göstermek için daha fazla analiz edildi. Ek olarak, kokulu şişeler açılarak, eşzamanlı olarak sinekler olası tüm karışımlara maruz bırakıldı.

Sinekleri dört ayrı koku ile uyardıktan sonra, dört kokunun karışımları ile yapılan stimülasyonların tümü, en az karışımdaki en çekici tek bileşik kadar çekiciydi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu deneyi bir saat içinde çalıştırabilirsiniz ve daha sonra sekiz saat boyunca çalışır ve zaten 30 dakika sonra ilk sonuçlarınızı görselleştirebilirsiniz. Yani bu yöntem gerçekten çok sayıda sinekten kısa sürede yüksek geçici çözünürlükle veri elde edilmesini sağlar.

Ama dikkatli ol. Bu deney, deneyler arasında kapsamlı bir temizlik gerektirir. Sisteminiz hala son deneydeki karıncalarla kirlenmişse, sonuçlarınızı sinek yürüyüşünde unutabilirsiniz.

Tabii ki, genetik olarak değiştirilmiş sinekleri de test edebilirsiniz, böylece bireysel veya fabrika nöral devrelerinin OD güdümlü davranış üzerindeki etkisini araştırabilirsiniz. Bu yeni tekniğin geliştirilmesinden sonra, böceğin beynindeki bu kokuların kodlamasını anlamak için bu alanda, böcek fraksiyonunda araştırma yapmamızın önünü açtı. Ve daha da önemlisi, sinek yürüyüşündeki davranış ve fizyolojik deney için aynı tür stimülasyonu kullanmak, bu iki farklı deneysel paradigmayı gerçekten karşılaştırabileceğimiz anlamına gelir.

Bu videoyu izledikten sonra, sinek yürüyüşünü nasıl kuracağınız hakkında iyi bir fikre sahip olmalısınız ve bu deneyi kendi kucağınızda kurabilmeli ve böcek sevgisi üzerine kendi yüksek verimli deneylerinizi başlatabilmelisiniz. Ancak unutmayın, cam eşyalar ve kimyasallarla çalışmak son derece tehlikeli olabilir, bu nedenle her zaman laboratuvar önlüğü giyin. Gözlük ve eldiven kullanın.