Yerfıstığı aflatoksin RNAi aracılı Kontrol: Yöntem Yerfıstığı Mikotoksin Üretim ve Transgen Anlatım Analiz /

Bu çalışmanın genel amacı, minimum sayıda tohum kullanılarak transgenik yer fıstığında aspergillus'un aflatoksin sentez genlerinin RNAi aracılı susturulmasının etkinliğini test etmek için güvenilir, doğru, ucuz ve hızlı bir yöntem sağlamaktır, numunelerdeki aflatoksinleri etkili bir şekilde ölçmek için genellikle yüzlerce gram tohum gerekir. Bu tekniğin temel avantajı, tohumların hazırlanmasından 10 gün önce belirli bir işlemi test etmek için beşten az tohum kullanmasıdır: ZAP Pex burgu ortamında bir aflatoksin pozitif aspergillus flavus NR RL 3 3 5 7 kültürü oluşturun. Bu kültürü 25 santigrat derecede büyütün.

Tohum aşılaması için kullanılacaktır. Metin protokolünde detaylandırılan RNAI'yi ifade eden transgenik bitkileri hazırladıktan sonra tohumlarını hasat etmeye devam edin. İlk olarak, perik sazanı düşük ayarlı bir basınçlı yıkayıcıdan aşınma kullanarak çıkarın veya peric sazanı elle kazıyın.

Peri sazan çıkarıldıktan sonra, baklaları bir olgunluk tahtası üzerine uygun gruplara yerleştirerek mezo sazanının rengini belirleyin. Şimdi delikleri çıkarın ve sarı ve kahverengi tohumları ayrı ayrı işleyin. Deney için gereken tohum sayısını en az üç tohum parçası olarak hesaplayın, bu da örneklenen fıstık hattı başına üç ortak kurşun yarısına ihtiyaç duyulduğu anlamına gelir.

Steril bir beherin altını bir tohum tabakası ile örtün ve ardından tohumları ölçülen hacimde% 75 etanol ile örtün. Sonra bu hacmi ikiye katlayın. Tohumların çözelti içinde 30 saniye inkübe etmesine izin verin ve ardından sterilize edilmiş damıtılmış suda durulayın.

Daha sonra, tohumları F etanol ile yapıldığı gibi% 2 hipoklorit ile muamele edin. Bu inkübasyonun beş dakika devam etmesine izin verin. Daha sonra beş kat hacimde sterilize edilmiş damıtılmış suda üç durulama kullanın.

Hipokloriti çıkarmak için, bu adımda tüm hipoklorit çözeltisinin yıkanması çok önemlidir. Tohumlar artık yüzey sterilize edilmiştir. Daha sonra, tohumları steril bir Petri kabına koymak için hazırlanan iki saat boyunca sterilize edilmiş damıtılmış suya batırarak tohumları nemlendirin.

Bu noktada tüm malzemeler sterilize edilmelidir. Forseps kullanarak tohum kabuklarını çıkarın, ardından kohaini ayırın. Son olarak, embriyoları bir neşter ile çıkarın.

Embriyolar atılabilir veya yeni bitkileri yenilemek için kullanılabilir. Daha sonra, oleini bir neşter ile ikiye bölün ve yarımları ve sterilize edilmiş damıtılmış suyu aşılamaya hazır olana kadar batırın. Daha sonra, steril kağıt havlu üzerine yarım co kurşundan fazla suyu kurulayın ve tohum parçalarını, tohum büyüklüğünde bölmeler ile ayrı% 1.5 burgu plakalarına yerleştirin ve co leadin yarımlarını aşılamak için tohumları, kesilmiş tarafları yukarı bakacak şekilde içlerine sokun.

Kesilen yüzeylere mikrolitre süspansiyon başına 10.000 aspergillus sporundan iki mikrolitre ekleyin. Süspansiyonun tohum yarısının kenarlarından aşağı akmasına izin vermeyin. Son olarak, bulaşıkları test edilene kadar bir ila dört gün boyunca 30 santigrat derecede karanlık bir inkübatöre koyun.

Bir gün sonra, iki gün sonra ve üç veya dört gün sonra tohumlardan numune alın, rastgele seçilen aşılanmış yarımları gerektiği gibi nazikçe çıkarın. Fazla sporları ve burguyu silmek için bir mendil kullanın ve numuneyi bir cam vidalı kapaklı şişeye yerleştirin. Aşılanmamış numuneleri R-T-P-C-R analizi için iki mililitrelik tüplere aktarın.

Numuneleri sıvı nitrojen içinde serbest bırakın ve donmuş numuneleri işlenene kadar bir dondurucuda saklayın. Aflatoksin analizi için, gerekirse dört mililitrelik cam vidalı kapaklı bir şişede aşılanmış yarım karyola kurşununu alın. Numune, eksi 80 santigrat derecede aylarca stabil kalacaktır.

Tohumlar oda sıcaklığındayken, dört hacim metanol ekleyerek ve tüplerin gece boyunca karanlıkta oda sıcaklığında çalkalanmadan inkübe kalmasına izin vererek numuneyi çıkarın. Ertesi gün, önce UPLC'yi gerçekleştirin, uygun bir frit ile 1,5 mililitrelik bir propilen mini sütun hazırlayın. Sonra 200 miligram alüminyum oksit ekleyin.

Ve sonra, başka bir frit yerleştirin. Sonraki konum, buharlaşmayı en aza indirmek için A-U-P-L-C otomatik örnekleyici şişesi mini sütunun altında ve temas halindedir. Şimdi numuneden 0,5 mililitre metanol özütü ekleyin, ikisi plastik değil, tek kullanımlık bir cama.

Daha sonra tüpe 0,5 mililitre aseto nitril ekleyin ve çözeltileri bir pipetle karıştırın. Şimdi hazırlanan mini kolona 0,5 mililitre karışım uygulayın ve EIT'yi sadece yerçekimi kullanarak toplayın. EIT toplandıktan sonra, UPLC'de kullanılmak üzere toplama şişesine hızlı bir şekilde bir septik kapak takın.

Şişeleri, mobil bir su metanol ve asedonit denemesi ile hazırlanmış olan A-U-P-L-C'ye yerleştirin. Daha sonra EIT'lerdeki aflatoksin içeriğini ölçün. UPLC analiziyle birlikte daha fazla ayrıntı için metin protokolüne bakın.

Ekstraksiyon için kullanılan tohum parçalarını ayrı cam şişelere yerleştirin. Daha sonra şişeleri gece boyunca liyofilize edin ve sabahları doku örneğinin kuru ağırlığını ölçün, böylece aflatoksin konsantrasyonları numunenin gramı başına nanogram olarak ifade edilebilir. Daha sonra numuneleri dondurucudan çıkarın ve triol ekleyin ve donmuş dokuları bir boncuk değirmeni homojenizatörü ile 3, 100 PPM'de 40 saniye öğütün ve RNA ekstraksiyonuna devam edin, yer fıstığı bitkilerini dönüştürmek için bir flavisten beş aflatoksin sentez geninin küçük parçalarını taşıyan bir RNAI vektörü kullanıldı.

Kimlik numaraları, geniş enstitünün genom açıklama numaralarına karşılık gelir: 99 rejenere TRANSFORMANT'tan elde edilen yedi PCR pozitif hat klonlandı ve açıklandığı gibi test edildi. Yedisi de kontrol hatlarına kıyasla %60 ila %100 daha az aflatoksin birikimi gösterdi. Yedi satırdan ikisinden elde edilen sonuçlar sunulmuştur.

Bu iki RN AI çizgisi, NPT iki seçilebilir işaretleyicinin varlığını gösterdi. S-T-N-P-C-R sonuçlarına göre, kullanılan negatif kontrol, RNAi hatlarını bir aflatoksin pozitifin taze hasat edilmiş kedialarına direnme yetenekleri açısından test etmek için dönüşüm sürecinden geçen bir PCR negatif hattı. 96 saate kadar inkübasyondan sonra embriyo ve testa eksikliği olan yarım karyola kurşununa bir flavis hattı NRRL 3 3 5 7 uygulandı.

Aşılanan dokular, tarif edildiği gibi aflatoksin seviyelerini ölçmek için UPLC kullanılarak işlendi. Bu sonuçlar sıvı kromatografisi kütle spektrometresi ile daha da doğrulandı. Genel olarak, RNAi 2 88 72, kontrole kıyasla aflatoksin B ikisinde %94 ila %100 ve aflatoksin B ikide %90 ila %100 azalma gösterdi.

RNAi 2 88 74 ise her iki aflatoksinde %60 ila %100'lük bir azalma gösterdi. Bu prosedürü takiben, mantar istilasına tohum tepkisini daha iyi anlamak için fito Xin'i analiz etmek için aynı tohum ekstraktları kullanılabilir. Bu yöntem aynı zamanda mikotoksinlerin kontrolü için RNAI teknolojisinin geliştirilmesine yardımcı olacak benzersiz bir araç sağlayacaktır.