Bakteri-konak Etkileşimleri karakterize etmek Biyomimetik Malzemeler

Bu prosedürün genel amacı, polistiren boncuklara bağlanmış saf rekombinant adezyonlardan oluşan biyomimetik materyaller üretmektir, bu daha sonra bireysel bakteriyel adezyonlar ve konak hücre reseptörleri arasındaki biyokimyasal ve fonksiyonel etkileşimleri incelemek için kullanılabilir. Bu yöntem, konak hücre sinyalizasyonu üzerindeki etkilerin ölçülmesi ve patojen aracılı sitotoksisitenin inhibisyonu gibi konak patojen etkileşimleri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, saflaştırılmış adezyonların (AEA'ların) bakteriye benzer boyutta polimer partiküllerine yönlü ve kovalent olarak bağlanması ve böylece bakteri yüzey görüntüsünü taklit etmesidir.

Prosedürü benimle birlikte gösteren laboratuvarımızdan TU A-C-E-D-A Doktora öğrencisi olacak. Thal amin yönlü kuplaj burada gösterilecektir. Bu protokol, sistin içeren proteinlerin, p meli fenil bütirat veya SMPB için SUL süksinil kullanılarak amin ile işlevselleştirilmiş polimer boncuklara bağlanması için uygundur Çapraz bağlama ajanı olarak, boncuk aktivasyonu prosedürüne başlamak için protokol metninde açıklandığı gibi kullanımdan hemen önce gerekli tüm reaktifleri hazırlayın.

Bir boncuk süspansiyonunu hafifçe ters çevirerek karıştırın ve ardından gerekli miktarda boncuk süspansiyonunu steril 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Bir mililitre steril PBS pH 7.0 içeren, boncukları ve peletleri bir mikro santrifüjde santrifüjleme ile yıkamak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Büyük, snat'ı bir pipet ve bir yara izi ile dikkatlice çıkarın.

Reese, boncuk peletini bir mililitre taze steril PBS'ye askıya alır ve yıkama adımını tekrarlayın. Boncuk peletini yeniden askıya alın. 0.8 mililitre PBS'ye 200 mikrolitre taze hazırlanmış 10 milimolar SFO SMPB ekleyin.

İki milimolar nihai konsantrasyon vermek için, boncuklar inkübe edilirken boncuk süspansiyonunu dönen bir tekerlek üzerinde 25 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Proteini bir sonraki birleştirme adımı için hazırlayın, böylece aktive edilmiş boncuklara hemen eklenebilir. Protein konsantrasyonunu kontrol edin ve birleştirme reaksiyonu için gereken son konsantrasyona ayarlayın. Altı.

Protein ve PBS'nin mikromolar ve bir mililitrelik hacmi genellikle protein indirgemesi için kullanılır. Beş milimolarlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için bir TEP stok çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi 30 dakika inkübe edin Oda sıcaklığında, ilk protein konsantrasyonunu belirlemek ve birleştirme verimliliğinin hesaplanması için birkaç mikrolitre protein çözeltisi tutun.

Aktive edilmiş boncukları peletleyerek ve peleti yıkayarak protein birleştirme prosedürünü başlatın. Bir mililitre taze, steril PBS'de bir kez, istenen protein konsantrasyonunu vermek için peleti hazırlanan protein çözeltisinde tekrar süspanse edin. Protein boncuk süspansiyonunu dönen bir tekerlek üzerinde 25 santigrat derecede iki saat inkübe edin İki saat sonra, 50 milimolar nihai konsantrasyona bir Sistine stok çözeltisi ekleyerek ve dönen bir tekerlek üzerinde 25 santigrat derecede 30 dakika boyunca süspansiyona inkübe ederek boncuklar üzerinde kalan aktif grupları devre dışı bırakın.

Boncukları santrifüjleme ile tuttu. Protein konsantrasyonunu belirlemek ve birleştirme verimliliğinin hesaplanması için snat'ı saklayın. Boncuk peletini bir mililitre PBS ve Resus bend ve bir mililitre taze PBS ile iki kez yıkayın, böylece nihai ürünü yarışma tahlilinden bir gün önce verin, 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna mililitre başına 150.000 hücre konsantrasyonunda bir mililitre hela hücresi ile tohumlayın.

Bu, hücrelerin deneye başlamadan önce yaklaşık% 80 co akıcılığına ulaşmasını sağlayacaktır. Beş mililitrelik bir deniz LB kültürünü taze bir V para hemolitik kolonisi ile aşılayın ve gece boyunca 30 santigrat derecede çalkalayarak büyütün. Daha önce gösterildiği gibi yeterli boncuk bağlı çok değerlikli yapışma molekülü hazırlayın.

Yarışma tahlilinin yapıldığı gün kuyucuk başına 100 mikrolitre 10 x boncuk stoğuna veya nihai konsantrasyonda 500 nanomolar proteine izin verin. Bakteri kültürünün OD 600'ünü ölçün. Bakteri kültürlerini katkı maddesi olmadan renksiz DMM'ye seyrelterek enfeksiyon ortamı hazırlayın.

%10 hacim içeren 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın, süspansiyonu yendi. 10'luk bir MOI vermek için, oyuk başına bir mililitre ve numune başına% 10 ila 20 fazla hacim hazırlayın. Eski ortamı kuyulardan çıkarın ve kültürlüyü yıkayın.

Her bir oyuğa bir mililitre steril PBS ekleyerek hücreleri iyileştirin, 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. PBS'yi çıkarın ve oyuk başına bir mililitre enfeksiyon ortamı ekleyin. Pozitif kontroller olarak kontrol boncukları ve bakteriler içeren çözeltiler ve negatif olarak bakteri içermeyen yapışma boncukları ekleyin. Denetim.

Lizis kontrolleri olarak% 0.1 TRITTON X 100 içeren DMM ekleyin. Kontroller de dahil olmak üzere her deneysel koşulu üç kez ayarlayın. Plakayı, istenen süre boyunca 37 santigrat derecede bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edin.

Sitotoksisite değerlendirilir. Enfeksiyondan dört saat sonra. 24 oyuklu plakada kullanılan her kuyucuktan 200 mikrolitre çıkarın ve yeni bir 96 oyuklu plakaya aktarın.

96 oyuklu plakayı 1.500 G'de beş dakika döndürün ve her oyuktan 100 mikrolitreyi yeni bir 96 oyuklu plakaya aktarın. Enfeksiyon deneyleri sırasında kullanılan 100 mikrolitre besiyerini, boşluk olarak kullanılacak 96 oyuklu plakanın üç yeni kuyusuna ekleyin. Laktat dehidrojenaz salım testini bir LDH Sitotoksisite tespit kiti kullanarak ve üreticinin talimatlarını izleyerek gerçekleştirin.

İlk olarak, ihtiyaç duyulan reaktif miktarını 25'lik artışlarla hesaplayın. Örneğin, 100 numune için. 11.25 mililitre reaktif A'yı 250 mikrolitre reaktif B ile karıştırın, köpürmeyi önlemek için ters çevirin, girdap yapmayın.

Sonra, karışımı bir rezervuara koyun. Daha sonra her numuneye 100 mikrolitre reaktif karışımı ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 10, 20 ve 30 dakika inkübe edin. Bir plaka okuyucuda 490 nanometrede absorbansı okuyun.

Daha sonra, el yazmasında tarif edildiği gibi yüzde sitotoksisiteyi hesaplayın, bakteriyel yapışma ölçümleri enfeksiyondan bir saat sonra yapılır. Ortamı hücre katmanından çıkarın ve bağlanmamış hücreleri çıkarmak için hücre katmanını steril ön ısıtma PBS ile iyice yıkayın. PBS'de Triton X 100 çözeltisinin her bir kuyucuğuna bir mililitre steril hacimce hacimce Triton X 100 çözeltisi ekleyerek, her seferinde bir mililitre bir mililitre PBS ile bir mililitre PBS ile yıkayın, plakayı 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin.

Her bir kuyucuğun içeriğini aktarmadan önce her numuneyi birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. 1.5 mililitrelik tüpler. Numunelerin on kat seri seyreltmelerini steril PBS plakasına, her numuneden 100 mikrolitre deniz LB agarına hazırlayın ve bu deney düzeneği için bakteri suşlarına ve zaman noktasına bağlı olarak plakaya seyreltmeyi optimize eden bir hücre yayıcı kullanarak yayın.

10 ila beşinci veya 10 ila altıncı kat seyreltme, uygun sayıda CFU verecektir. Plakaları ertesi gün gece gece 37 santigrat derecede inkübe edin, bakterileri koloni sayımına göre sayın. Yarışma testlerinde, topuk hücreleri V para hemolitik suş ile enfekte edildi.

Zayıf olan, pozitif ile gösterilen veya farklı rakip varlıkların varlığında enfekte olmayan bırakılmıştır. Zayıf olanla in vitro enfeksiyon, MAM yedi bağlı boncuk tarafından inhibe edilen, ancak MA'bir bağlı veya GST bağlı boncuklar tarafından inhibe edilmeyen çok yüksek seviyelerde hücre lizizi ile sonuçlandı. Tedavi edilmemiş HELOC hücrelerine veya MAM ile inkübe edilen hücrelere bağlı v paralitik sayımı.

Yedi MAM bir veya GST kontrol boncuğu MAM olduğunu ortaya çıkardı. Yedi boncuk, ancak MAM bir veya GST Kontrol boncukları değil. Konak hücre yüzey reseptörlerine bağlanma için v para hemolitik ile rekabet edin.

Floro ile birleştirilmiş yapışıklıklar. Dört Etiketli boncuk, konakçı hücrelere bakteri yapışmasını taklit edebilir ve hücresel görüntüleme için güçlü araçlardır. Sağdaki tüp, floresan mavi biyomimetik boncuklardan oluşan bir süspansiyon içerir. Mam.

Epitel hücrelerine MAM yedi aracılı bağlanma sürecini karakterize etmek için yedi birleştirilmiş floresan mavi boncuk kullanıldı. MAM yedi'nin konakçı hücrelere bağlanması, aktin yeniden düzenlemelerine ve f aktin için boyama yapmak için Rumine Phin kullanılarak birlikte görüntülenen stres liflerinin oluşumuna neden oldu. Bu prosedürü takiben, bakteri bağlanmasının akış aşağısındaki sinyalleme süreçlerinde hangi konakçı hücresel faktörlerin yer aldığı gibi ek soruları yanıtlamak için proteomik veya western blot ile birleştirilmiş afinite saflaştırma gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.