Name: Bakteri-konak Etkileşimleri karakterize etmek Biyomimetik Malzemeler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Keşfedin bakteri-konak etkileşimlerini biyomimetik malzemeler kullanarak. Bu yöntem, rekombinant adezinleri polistiren boncuklara kovalent bağlayarak bakteri tutunmasını ve sitotoksisiteyi analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, makaleyi eleştirel bir şekilde okudukları için Krachler grubu üyelerine teşekkür eder. DHS, DV ve, Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BB/L007916/1), FA, Irak Cumhuriyeti Yüksek Öğretim ve Bilimsel Araştırma Bakanlığı Bursu ve NPS, CONICYT Bursu tarafından finanse edildi.

Polimer Beads Proteinlerin 1. Kimyasal Birleştirme <ol><li> Tiol-amin yönlü birleştirme Not: Bu protokol, proteinler Sülfosukinimidil 4- (p -maleimidophenyl) bütirat, çapraz bağlama maddesi olarak (Sülfo-SMPB) (Şekil 1) kullanılarak, polimer boncukları işlevselleştirilmiş amin içeren sistein bağlanması için uygundur. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig1.jpg" /> Şekil 1. Çapraz bağlama polimer taneleri proteinlerin yön tiyol-amin bağlanması için kullanılan stratejiyi. Amin modifiye polistiren boncuklar Sulfo-SMPB ile aktive edilir. Maleimid boncuk çift proteinleri yönlü ücretsiz sistein ile reaksiyona girer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol><li> Reaktiflerin hazırlanması: <ol><li> PBS (100 mM sodyum fosfat, 150 mM NaCI, pH 7.0) ve otoklav hazırlayın. </li&gt; <li> Kullanımdan hemen önce bir 100x stok TCEP içinde (PBS içinde 0.5 M veya 287 mg / ml) (tris (2-karboksietil) fosfin) hazırlayın. </li><li> 5x stok Sülfo-SMPB ve (dH 10 mM ya da 4.58 mg / ml 2 O) kullanımdan hemen önce hazırlayın. </li><li> 10x stok (500 mM veya 88 mg / ml PBS içinde, pH 7.0) kullanımdan hemen önce sisteinin hazırlayın. </li></ol></li><li> Boncuk aktivasyon: <ol><li> Hafifçe ters çevirerek boncuk süspansiyonu karıştırın ve 1 ml steril PBS, pH 7.0 ihtiva eden bir steril 1.5 ml&#39;lik bir tüp içine boncuk süspansiyonu (örneğin, 12 mi) gerekli miktarda aktarın. </li><li> Yavaşça bir mikrosantrifüj (16.000 x g&#39;de 2 dakika) santrifüj boncuk ve pelet yıkamak için aşağı yukarı pipet ve. </li><li> Dikkatle bir pipet ve ıskarta ile süpernatant kaldırmak. Taze steril 1 ml PBS boncuk pelletini ve yıkama adımı tekrar edin. PBS 0,8 ml damla pelletini. </li><li> , Taze hazırlanmış 10 mM Sulfo-SMPB 200 ml ekleyin nihai concent vermek2 mM oranı. </li><li> Dönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C&#39;de 1 saat boyunca boncuk süspansiyonu inkübe edin. </li></ol></li><li> Protein azaltma: <ol><li> Aktivasyon aşaması kuluçka süresi boyunca, bu nedenle hemen aktif boncuklara ilave edilebilir, aşağıdaki birleştirme adımı için protein hazırlamak. Not: Bu indirgeme aşaması, her zaman GST (glutation-S-transferaz) füzyon proteinleri için gerekli değildir, ancak bu yüksek bağlanma özelliğine sağlamak için önerilir. <ol><li> Protein konsantrasyonu kontrol edin ve birleştirme reaksiyonu için gerekli olan son konsantrasyona göre ayarlayın. Not: PBS içinde 6 mM proteini ve 1 ml&#39;lik bir hacim genellikle kullanılır. </li><li> 5 mM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek TCEP stokları ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çözelti inkübe edin. Not: Reaksiyon karışımı, doğrudan aşağıdaki birleştirme reaksiyonu için kullanılabilir. </li><li> Pro belirlemek için, protein çözeltisine küçük bir miktar (bir kaç mi) koru<html> tein konsantrasyon ve bağlanma verimliliği hesaplanması (bakınız bölüm 2). </li></ol></li></ol></li><li> Protein birleştirme aşaması: <ol><li> Santrifüjlemeden sonra (2 dk, bir mikrosantrifüj 16.000 x g) aktive boncuklar Pelet ve taze, steril 1 ml PBS içinde bir kez pelet yıkayın. </li><li> Istenilen protein konsantrasyonu verecek şekilde, hazırlanan protein solüsyonu (örneğin, 1 ml) içinde pelletini. Not: bağlanma adımı sırasında protein konsantrasyonu ortalama bağlanma verimliliğiyle (bağlanma etkinliği belirlenmesi için bakınız bölüm 2) ve (1.1.4.3 hesaplanan) istenen bağlanma yoğunluğuna bağlı olacaktır. Birleştirme adımı sırasında protein konsantrasyonu yaklaşık 6 mM olmalıdır, böylece etkinliği, yaklaşık% 85, 10x boncuk süspansiyonu, istenen nihai konsantrasyon 5 mM. </li><li> Aşağıdaki formülü kullanarak bağlama yoğunluğu hesaplayın: jpg &quot;/&gt; Burada ρ c bağlama yoğunluğu [protein moleküllerinin sayısı / nm 2], Protein konsantre protein konsantrasyonu [mg / ml], Protein M protein molekül ağırlığı [Da] w boncuk boncuk kons konsantrasyonu [boncuk sayısı / L], d boncuk çapı [nm 2] Avogadro sayısı </li><li> Ortalama ligand aralığı hesaplamak için birleştirme yoğunluğu kullanın: <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq2.jpg" /></li><li> Dönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C &#39;de 2 saat süre ile, protein-boncuk süspansiyonu inkübe edin. Not: Bazıproteinler, oda sıcaklığında stabil olmayabilir. Bu gibi durumlarda, reaksiyon 4 ° CO / N üzerinden gerçekleştirilebilir. </li><li> 50 mM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar sistein stok ekleyerek boncuklar üzerinde kalan aktif gruplar devre dışı bırakın ve dönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C&#39;de 30 dakika boyunca bir süspansiyon inkübe edin. Santrifüj (2 dk, bir mikrosantrifüjde 16.000 xg) boncuk pelet. </li><li> Protein konsantrasyonunu ve bir bağlanma verimliliğiyle hesaplanmasını belirlemek için süpernatan tutun (bakınız bölüm 2). </li><li> Son ürünü vermek üzere, taze PBS, 1 ml 1 ml PBS ve tekrar süspansiyon ile iki kez kordon pelet yıkayın. Not: Yukarıdaki protokol, tipik olarak, daha sonraki deneyler (bakınız bölüm 3) için 10x stoklar olarak kullanılabilir 5 mM bir son protein konsantrasyonu, önceki, birleştirilmiş proteinin 1 ml verecektir. </li><li> Protokol bölüm 3 devam etmek için, boncuk stoğu 100 ml / ml çalışma ya da 500 nM proteinin bir nihai yoğunlukta yürütüldüler. Not: Bu prosedüründe için iyi bir başlangıç ​​noktasıe 2 nm 3 x 10 -4 protein / ml&#39;lik bir ortalama bağlanma yoğunluğu ya da 2 mm çapa sahip olan bir boncuk 57 nm&#39;lik bir ortalama mesafe ile sonuçlanan, 2 x 10 12 boncuk / ml olacaktır. </li></ol></li></ol></li><li> Tiol-karboksi yönlü birleştirme Not: Bu protokol, karboksil işlevselleştirilmiş polistiren boncuklara proteinler içeren sistein bağlanması için uygundur. Karboksil yarımı, ilk olarak, değiştirilmiş amin ve daha sonra çapraz bağlı Sülfo-SMPB (Şekil 2) ile 1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC) / N-hidroksisukinimid (NHS) kullanılarak aktive edilir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53400/53400fig2.jpg" /> Şekil 2. Çapraz bağlama polimer boncuklara proteinler yönlü tiol, karboksil bağlanması için kullanılan stratejiyi. Karboksillenmiş polistiren taneleri, ilk EDC aktive edilen ve yarı-kararlı NHS-esteri oluşturmak için NHS ile modifiye edilir. Ethylenedi sonradan amin birleştirmeSülfo-SMPB ile reaksiyona giren bir serbest amin grubu, amin oluşur. Maleimid boncuklar sonra. Boncuk çift proteinleri yönlü ücretsiz sistein ile reaksiyona girebilen aktif <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol><li> Reaktiflerin hazırlanması: <ol><li> PBS (100 mM sodyum fosfat, 150 mM NaCI, pH 7.0) ve otoklav hazırlayın. </li><li> Kullanımdan hemen önce TCEP içinde (PBS içinde 0.5 M veya 287 mg / ml), bir 100 x stok hazırlayın. </li><li> 10x stok kullanımdan hemen önce EDC (PBS içinde 20 mM ya da 4 mg / ml) (1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid) hazırlayın. </li><li> 10x stok NHS (PBS içinde 50 mM ya da 6 mg / ml) (N-hidroksisukkinimid) kullanımdan hemen önce hazırlayın. </li><li> 5x stok Sülfo-SMPB ve (dH 10 mM ya da 4.58 mg / ml 2 O) kullanımdan hemen önce hazırlayın. </li><li> Hemen b sistein 10x stok (500 mM veya 88 mg / ml&#39;lik son yoğunluğa seyreltildi, pH 7.0) hazırlamakefore kullanımı. </li></ol></li><li> Boncuk aktivasyon: <ol><li> Hafifçe ters çevirerek boncuk süspansiyonu karıştırın ve 1 ml steril PBS, pH 7.0 ihtiva eden bir steril 1.5 ml&#39;lik bir tüp içine boncuk süspansiyonu (örneğin, 12 mi) gerekli miktarda aktarın. </li><li> Yavaşça bir mikrosantrifüj (16.000 x g&#39;de 2 dakika) santrifüj boncuk ve pelet yıkamak için aşağı yukarı pipet ve. </li><li> Dikkatle bir pipet ve ıskarta ile süpernatant kaldırmak. </li><li> Taze steril 1 ml PBS boncuk pelletini ve yıkama adımı tekrar edin. </li><li> PBS 0,8 ml damla pelletini. </li><li> 10x EDC stokunun 100 ml (2 mM nihai konsantrasyon) ve boncuk süspansiyonuna 10x NHS stok çözeltisi (5 mM nihai konsantrasyon) hemen 100 ml ekleyin. </li><li> Dönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C&#39;de 30 dakika boyunca boncuk süspansiyonu inkübe edin. </li><li> 0,8 ml taze, steril PBS PBS ve tekrar süspansiyon 1 ml&#39;lik bir kez boncuk yıkayın. </li><li> 200 ml etilendiamin ekleyin ve incdönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C&#39;de 1 saat boyunca boncuk süspansiyonu Ubate. </li><li> 1 ml PBS ile bir kez boncuk yıkayın ve taze PBS 0.8 ml içinde yeniden süspanse boncuklar. </li><li> Bölüm 1.1.2.4 (Sulfo-SMPB ile boncuk aktivasyon) Bölüm 1.1.2 altında anlatılan itibaren devam ve bölüm 1.1 (Tiyol-amin yönlü kavrama) tarif protokol kalanını izleyin. Bölüm 1.1 de tarif edilenlere benzer bir şekilde proteinin hazırlanması ve protein bağlama işlemleri gerçekleştirin. Not: (. Yaklaşık% 75) Bu protokol kullanılarak, tipik bağlanma randımanı, bu nedenle, aynı birleştirme yoğunluğu elde etmek için uygun şekilde, ilk protein konsantrasyonunu ayarlamak bölüm 1.1 ile karşılaştırıldığında, biraz daha düşüktür. </li></ol></li></ol></li></ol> Kavrama Etkinliğinin Belirlenmesi 2. Not: aşağıda Bradford reaktifi 10 ve kolorimetrik tahlilleri, protein konsantrasyonu belirlemek kullanmak için: <ol><li> Yavaşça e Bradford Reaktifini ters<html> reaktifin şekilde almalarının sağlanması homojenliği. </li><li> Tampon maddesi içinde 0.1 ila 1.5 mg / ml BSA konsantrasyonları kapsayan protein standartlarının hazırlanması, 10 mg / ml BSA stok solüsyonu kullanılması. </li><li> Bir 96-kuyulu plakanın kuyularına Bradford reaktifi 250 ml ekleyin. Tüm örneklerde, Protein standartlarının ve negatif kontroller (sadece tampon) için yeterli kuyu hazırlayın. </li><li> 96-çukurlu plaka içinde reaktifi (negatif kontrol için Protein standartlarının veya tamponu), protein örneğinin 5 ml ekleyin. </li><li> 10 dakika boyunca oda sıcaklığında orbital bir karıştırıcı üzerinde plaka inkübe edin. </li><li> Bir plaka okuyucusu kullanılarak 595 nm&#39;de absorbansı ölçülür. </li><li> A595 nm&#39;ye karşı BSA konsantrasyonu standart bir eğri oluşturmak ve ilk ve süpernatan numuneler içindeki protein yoğunluklarının belirlenmesi için kullanabilir. </li><li> Şöyle bağlanmış protein konsantrasyonu hesaplanır: <img alt="Denklem 3" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq3.jpg" /></li><li> Bağlanma verimliliğini olarak hesaplayın: 00eq4.jpg &quot;/&gt; </li></ol> Rekabet tahlilleri Boncuk-bağlanmış adezinlerin 3. <ol><li> Hazırlık: <ol><li> Tohum, 24 oyuklu bir plakaya 150,000 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda bir rekabet deneyinde bir gün önce de Hela hücreleri, oyuk başına 1 mi, hücreler önce, deney başlamadan yaklaşık% 80 birleşik duruma ulaştılar izin vermek. </li><li> Üçlü olarak her deneysel koşul ayarlayın. Negatif kontroller için kuyular (rekabet deneyleri sırasında eklenen hiçbir bakteri), pozitif kontroller ve (sitotoksisite deneyleri için) lizis kontrolleri (sadece yarışma deneyleri sırasında eklenen füzyon etiketi bağlanmış kontrol boncuk) ekleyin. </li><li> V. taze bir kolonisi olan 5 ml deniz LB (MLB) kültür aşılamak parahaemolyticus ve sallayarak, 30 ° C&#39;de O / N büyür. </li><li> Bölüm 1. (Kuplaj) &#39;de tarif edildiği gibi, yeterli bir kordon ile birleştirilmiş MY hazırlayın. 10x boncuk stoğu 100 ml Veren ile sabitleştirilir. </li></ol></li><li> Rekabet deneyi: <ol><li> Competit günündeiyon deneyi, bakteri kültürü OD 600 ölçün. </li><li> Katkı maddesi olmadan, renksiz bir DMEM içinde bakteri kültürleri seyreltilmesi ile enfeksiyon ortamı hazırlanır,% 10 v / v boncuk süspansiyonu (her iki adezin-bağlanmış taneleri veya kontrol tanesi), 10 MOl&#39;de 1 ml hazırlayın vermek üzere ihtiva eden 37 ° C önceden ısıtılmış / oyuk ve örnek başına 10-20% -fazla hacmi. Not: Yukarıda belirtilen koşullar altında (24 oyuklu plaka, V. parahaemolyticus, 10 İB), O / N kültürü gerekli hacim için kültür 3 / OD 600 olarak hesaplanır oyuk (ml / ml) başına eklenmelidir. Örneğin, enfeksiyon ortamı, 1 ml tipik haliyle, bakteri kültürü, birkaç ml 100 mi boncuk süspansiyonu içerecek ve renksizdir, katkısız DMEM 1 ml&#39;ye kadar yapılır. </li><li> Kuyulardan eski orta çıkarın ve her bir 37 ° C, steril PBS önceden ısıtılmış 1 ml ekleyerek kültürlenmiş Hela hücreleri yıkayın. </li><li> PBS çıkarın ve oyuk başına enfeksiyon ortamı 1 ml. Ayrıca çözümler cont ekleyerek, kontrolleri kurmak% 0.1 Triton X-100 (sitotoksisite ölçümleri için, sadece gerekli liziz kontrol) içeren kontrol boncuklar ve bakteriler (pozitif kontrol) ya da adezin boncuk ve hiçbir bakteri (negatif kontroller) veya DMEM Tahliye. </li><li> Istenen süre (örneğin, sitotoksisite ölçümleri için 4 saat ya da yapışma ölçümleri için 1 saat) 37 ° C &#39;de, bir doku kültürü inkübatörü içinde, plaka inkübe edin. Not: konakçı hücreler bakteriyel yapışma ve sitotoksisite Hem inhibisyon etkinliği için okuma-çıkışları olarak kullanılabilir. Sitotoksiklik ve yapışma ölçümlerinin zaman noktaları uyuşuyorlarsa sitotoksisite kültür süpernatanı ve bağlanma tahlilleri, kalan hücre katmanı elde edilen numuneleri kullanmak kullanılarak tespit edilir, çünkü her iki çalışma, aynı kaynaktan örnekler kullanılarak gerçekleştirilebilir. </li></ol></li><li> Sitotoksisite ölçümleri: <ol><li> Belirtilen zaman noktalarında (örn 4 saat sonrası enfeksiyon), her 24 kuyu ve transfer için üç kez 200 ml kaldırmakBir 96-yuvalı plaka. </li><li> De yeni bir 96 oyuklu bir plakaya, 1500 x g&#39;de, her 5 dakika ve transfer 100 ml, 96 gözlü levhalar dönerler. Üç kopya halinde 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına taze enfeksiyon deneyleri sırasında kullanılan ortamın 100 ml (bu boş olarak kullanılacaktır) ekleyin. </li><li> Laktat dehidrogenaz (LDH) salım deneyi bir LDH sitotoksisite belirleme kiti kullanılarak ve üreticinin yönergeleri izleyerek gerçekleştirin. <ol><li> Kısaca, 25 artışlarla ihtiyaç duyulan reaktif miktarını hesaplamak (62 numune ölçülecek ise, örneğin, 75 vs. için yeterli reaktif karışımı makyaj). </li><li> Örneğin, 100 numune için, reaktif B Invert 250 ul reaktif A 11,25 ml karışımı, köpük önlemek için girdap yok. </li><li> Çok kanallı bir pipet ile pipetleme edebilmek için bir hazne karışımı koyun. Her bir örnek için reaktifi karışımı 100 ul ekle. </li><li> Oda sıcaklığında inkübe ve plaka 10, 20, 30 dakika sonra, bir plaka okuyucusu üzerinde 490 nm&#39;de absorbans okunur. </li&gt; <li> Liziz kontrol numunesinin absorpsiyonunu yüksek ama yine plaka okuyucu (tipik haliyle, 2-3 absorbans birimi) lineer aralığında olduğu veri kümesi analiz edin. </li><li> Dönüşüm için aşağıdaki formül kullanılarak,% sitotoksisite gibi sonuçları Express: <img alt="Denklem 5" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq5.jpg" /></li></ol></li></ol></li><li> Bakteriyel yapışma ölçümü: <ol><li> Belirtilen zaman noktalarında (örn 1 saat sonrası enfeksiyon) olarak, hücre tabakasından ortamı çıkarın. </li><li> İyice herhangi bir un bağlı hücreleri çıkarmak için, steril, önceden ısıtılmış PBS (1 ml PBS her birinin en az 3-4 yıkama) hücre tabakası yıkayın. </li><li> PBS içinde Triton X-100 çözeltisi h steril% 1 v 1 ml / eklenerek göz başına Lyse konakçı hücreler sunar. 5 dakika boyunca 37 ° C &#39;de plaka inkübe edin. </li><li> 1.5 ml tüpler ayırmak için de her içeriğini aktarmadan önce her bir örnek yukarı ve aşağı birkaç kez pipetle. Örneklerin 10 kat seri dilüsyonları hazırlayınsteril PBS içine (örneğin, numune 100 ml PBS 900 ml kullanım). </li><li> Levha 100 MLB agarı üzerinde her bir numunenin mi ve bir hücre dağıtıcı kullanılarak yayıldı. Bakteri suşları ve zaman noktasına bağlı olarak plaka sulandırmalarda hangi optimize edin. Not: Açıklanan deney düzeneği için, 10 5 ya da 10 6 kat seyreltme CFU sayısını uygun bir sayı verir. </li><li> 37 ° CO / N plakaları inkübe ve koloni sayımı ile bakteri numaralandırma. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivalent+Adhesion+Molecule+7+clusters+act+as+signaling+platform+for+host+cellular+GTPase+activation+and+facilitate+epithelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction.</a> PLoS Pathog. 10 (9), e1004421(2014).</li>
<li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+adhesion+factor+multivalent+adhesion+molecule+7+initiates+host+cell+binding+during+infection+by+gram-negative+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).</li>
<li>Krachler, A. M., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+interaction+between+bacterial+adhesin+multivalent+adhesion+molecule+7+%28MAM7%29+protein+and+its+host+cell+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands.</a> J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).</li>
<li>Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+specificities+of+the+staphylococcal+and+streptococcal+fibronectin-binding+microbial+surface+components+recognizing+adhesive+matrix+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules.</a> Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).</li>
<li>Bingham, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+fibronectin-binding+sites+from+Staphylococcus+aureus+FnBPA+in+complex+with+fibronectin+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).</li>
<li>Ensenberger, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interactions+between+F1+adhesin+of+Streptococcus+pyogenes+and+N-terminal+modules+of+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).</li>
<li>Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+MAM7+peptide-based+inhibitor+of+Staphylococcus+aureus+adhesion+does+not+interfere+with+in+vitro+host+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function.</a> PLoS One. 8 (11), e81216(2013).</li>
<li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnabout+is+fair+play%3A+use+of+the+bacterial+Multivalent+Adhesion+Molecule+7+as+an+antimicrobial+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent.</a> Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).</li>
<li>Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+multivalent+adhesion+molecule+7-based+inhibition+of+multidrug-resistant+bacteria+isolated+from+wounded+military+personnel%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel.</a> Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada, sırasıyla amin- akuple tiol içeren proteinler için kullanılan veya karboksilat ile modifiye edilmiş polistiren boncuklar gibi iki protokol, tarif eder. İşleme bağlı kolaylığı, tiol-amin birleştirme tercih edilir, ancak arzu edilen boncuk tarifnamede (çap, flüoresan özellikleri) bağlı olarak, bir amin-işlevselleştirilmiş boncuk kullanılması mümkün olmayabilir ve bu nedenle karboksilat dönüştürecek bir protokol dahil ettik - Bir amin kısma Araştırmacı iskele seçiminde mümkün olan en büyük esnekliği sağlamak için. Protein, yönlü kavrama ihtiva eden herhangi bir sistein hem tiyol-amin ve tiol, karboksil birleştirme çalışmaları (yani, N-terminusunda başına protein, yüzey görüntüsünü taklit immobilizasyonu) sistein artıklarının olmayan bir protein gerektirir, ancak, bu bir GST füzyon olarak üretilir Protein ya da bu site tarafından tanıtılan tek bir terminal sistein kalıntısı mutagenezini yönetti içerir. Birden çok reaktif sistein ihtiva edilmesi halindeprotein içinde, bu proteinin fonksiyonunu engelleyebilir rastgele immobilizasyon yol açacaktır. Pek çok bakteriyel adezin doğal sistein içermez. Bu yerel yapısı ve fonksiyonu mutant korunur sağlamak için kapsamlı deneyler gerektirecektir, ancak diğerleri için, bu, bir yere yöneltilmiş mutagenesis ile ayrılabilmektedir. GST füzyon proteinleri için, boncuklara bağlanmış saflaştırılmış GST-eklentisi uygun bir negatif kontrol olarak da kullanılabilir. Bu genellikle bir araya gelme veya non-spesifik olarak hücrelere bağlı için daha yüksek bir eğilimi olduğu gibi, bir kontrol olarak bağlanmamış boncuklar kullanılarak, kaçınılmalıdır. Ancak EDC kullanılarak protokol 1,2. Basitleştirilmiş bir versiyonu, bu durumda, bağlantı yönlü bağlantıyı garanti etmez, bu nedenle protein, birincil aminler ile gerçekleşir ve bununla birlikte in, karboksil işlevselleştirilmiş polimer boncuklara birkaç proteinlere kullanılabilir. Bir indirgeme maddesi olarak TCEP gibi dithiothr gibi diğer ticari olarak temin edilebilir ve yaygın olarak kullanılan indirgeme maddeleri ile ikame edilmesi gerekmezeitol (DTT) ya da 2-merkaptoetanol (BME), içlerindeki tioller tiol maleimid bağlama adımında, protein bağlama ile rekabet edecek şekilde. PBS diğer tamponlar ile ikame edilebilir, ancak aşağıdaki hususlar ile: Tamponlar birincil aminler içermeyebilir (nedenle Tris ihtiva eden tamponlar uygun değildir). Çok düşük (&lt;10 mM) tuzu konsantrasyonlarını ihtiva eden tampon maddeler kullanılması topaklanma boncuk yol açar ve de kaçınılmalıdır. Protein saflığı da önemli bir faktör, bu işlem sırasında dikkate ve yüksek kaliteli veri elde etmek için olan, saf proteinler, kullanılmalıdır. Rutin olarak, en az bir afinite arıtma ve jel filtrasyon aşaması da dahil olmak üzere, birden fazla adımda proteinleri saflaştırmak ama değiştirme kromatografisi, iyon bazı durumlarda, bir üçüncü adım olarak yapılır. SDS-PAGE ile değerlendirildiği gibi bir sonucu olarak bağlamak için kullanılan proteinler saflığı genellikle% 90 veya daha fazladır. Bu inci gibi, ilk reaksiyon karışımında hem protein konsantrasyonlarını belirlemek için önerilirReaksiyon tamamlandıktan sonra e süpernatant. Bu bariz Boncuk bağlanmış protein konsantrasyonunu ve dolayısıyla bağlanma yoğunluğu belirlemek için yardımcı olacaktır. Her iki değerin belirlenmesi, aynı zamanda bağlanma randımanı hesaplanmasına izin verir. Istenen son konsantrasyon ve bağlanma yoğunluğu elde etmek için, daha sonraki reaksiyonlarda ilk protein çözeltisinin hazırlanması, bu göz önüne alınabilir. Reaksiyonun maddelerin yok kullanılan konsantrasyonlarda boya kompleksi oluşumu ile karışabilir Bradford reaktifi, özellikle, önce ve birleştirme reaksiyonundan sonra protein konsantrasyonu belirlenmesi için uygundur. Düşük protein konsantrasyonu kullanılacak ise, bu yöntem, daha hassas bir saptama yöntemi ile ikame edilmesi gerekebilir, ancak ilgi bu birleştirme reaksiyonu içinde ihtiva edilen maddeler ile uyumlu olması gerekir için ödenmesi gereken yer alır. Aynı zamanda özenle toz reaktifleri taze hazırlanmış reaktifleri kullanmak ve işlemek için tavsiye edilir (örneğin, mağazakapalı bir kap içinde ve silis boncuklar kullanarak birleştirme etkinliğini olumsuz etkileyecektir reaktifler kalitesi yana nem çekme reaktifler) önlemek için. Bağlanma verimliliği beklenenden daha düşük ise, olası çözümler başlangıç ​​kordon ve protein artan konsantrasyonlarda içerir. Daha yüksek konsantrasyonlar kullanılıyorsa, eşleme reaktif konsantrasyonu, orantılı olarak artırılacaktır için yeterli molar fazlalığı temin etmelidir. Boncuk / protein konsantrasyonlarını değiştirerek genellikle daha iyi bir optimizasyon yolunda adım ziyade tepki süreleri artmaktadır. Boncuk bağlanması için protokoller uzun olduğundan, biz bunlara malzemenin büyük bir toplu hazırlar. Süspansiyon örnekleri, sıvı nitrojen içinde hızlı bir şekilde dondurulup birkaç ay boyunca -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. Çözülmüş alikotları refrozen olmamalıdır ve 4 ° C &#39;de tutulur ve 1-2 gün içinde kullanılmalıdır. Bununla birlikte, bu ilk olarak küçük bir parti test edilmelidir olarak kullanılan protein maddelerinin tabiatına ve stabilitesine bağlı olarak değişecektir. <p clasAşağıda ele alındığı gibi s = &quot;jove_content&quot;&gt; Boncuk bağlanmış adhesinler, bir çok uygulama için kullanılabilir. Bu protokol, genellikle konakçı hücreler bakteri bağlanma ve patojen aracılı sitotoksisite inhibisyonunu ölçmek için kullanılan bir deneyi tarif. Analiz genellikle konukçu hücrelere bakteriyel ek bir düşüş kullanılarak, rekabetçi deniz gıda kaynaklı patojen Vıbrıo parahaemolyticus ile Hela epitel hücrelerin enfeksiyonunu inhibe etmek için, boncuk bağlanmış MAM kapasitesinin ölçülmesi için yapıldı ya da okuma olarak sitotoksisite azalır . Her iki durumda da, hazırlanması ve rekabet analizleri aynı protokolü uygulayın. V. okuma bağlı olarak, farklı suşlar parahaemolyticus kullanılmaktadır: POR1 sitotoksisite ölçümleri için kullanılan sitotoksik suşu, sitotoksik olmayan streyn POR2 bakteriyel yapışmayı ölçmek için kullanılır ise, hücre ölümü ve hücre dekolmanı bağlı bakteri miktarının belirlenmesi için prosedür ödün yana. Başlangıçta, yetYarışmaları&#39;na deneyleri konakçı hücreler bakteriler eklenmesinden önce boncuklar ile önceden inkübe edildi, ilk adım adım bir protokol gibi oluşturulmuştur. V için parahaemolyticus ve ikinci topuk kısmı özellikleri (MAM7 bağlanmış 2 um boncuk), her iki boncuk ve bakteri elde edilen sitotoksisite değişiklik olmaksızın, aynı anda ilave edilebilir. Yani, bu deney sisteminde, taneler konakçı hücre bağlama bakterileri outcompete. Kullanılan bakteri türleri ve boncuk geometrisine bağlı olarak, iki ayrı adımlar olarak boncuk yapışma ve bakteriyel enfeksiyonu korumak için iyi nedenler olabilir. Örneğin, hareketsiz bakteri hücreleri enfekte etme plakalar genel olarak enfeksiyonun ortam ilave edildikten sonra santrifüje tabi tutulur. Bu hücre tabakası boncuk yüksek ölçüde düzensiz dağılımına yol açar Bununla birlikte, kordon süspansiyonlar ihtiva eden plakalar santrifüj kaçınılmalıdır. Daha küçük parçacık boyutları kullanılıyorsa, boncuk, hücre yüzeyindeki yerleşmek uzun sürer durumda su içindefficient süresi enfeksiyondan önce kordon bağlanması için izin verilmelidir. Bakteriyel yapışma üzerinden oku olarak kullanıldığında, konakçı hücreler önemli ölçüde enfekte eden soyun zarar görmezler burada numuneler bağlı bakterilerin miktarının tehlikeye hücre kopması ve yok edilmesi olarak, zaman noktalarında alınır. Bunun yerine seyreltme plaka ile bakteriyel yapışmayı sıralandıran örnekler alternatif görüntüleme (Şekil 5) işlenebilir. Bu durumda, doku kültürü hücreleri, daha çok, doğrudan kuyulara daha cam kapak slipleri üzerine ekildi edilmelidir. Buna ek olarak, bir flüoresan proteini ifade flüoresan boncuklar ve bakteri enfeksiyonu özel konakçı hücre işaretleri ile birlikte kullanılabilmektedir. Örneğin, rekabet deneyleri genellikle konakçı hücrelerinin aktin hücre iskeleti leke ve floresan mavi boncuk ve floresan ile birlikte, enfeksiyondan kaynaklanan morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için floresan kırmızı rodamin-Phalloidin kullanarak görüntülüYeşil (GFP ifade veya SYTO18 lekeli) bakteriler. Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes ve Streptococcus F1 FUD ve Vibrio parahaemolyticus MAM de dahil olmak üzere topuk kısmı çiftli adezinler bir dizi, yapışma, yapışma inhibisyonu ve yapışma katkı çalışma biomimetik malzemeleri olarak kullanılmıştır patojen aracılı sitotoksisite 1, 7, 8. iskeleler olarak kullanılan polimer taneleri renk (örneğin, mavi, kırmızı flüoresan, mavi, yeşil, turuncu) geniş bir aralığında kullanılabilir, çünkü bu yaklaşımı kullanmanın avantajlarından biri, bağlanma etkinlikleri görselleştirme kolaylığıdır. Bu durumda, işlev müdahale edebilir doğrudan protein etiketleme, önlenebilir. Buna ek olarak, bu şekilde çözünür proteinler ile karşılaştırıldığında fizyolojik olarak daha uygun bir yapıyı yansıtan birleştirme taklit eder bakteriyel yüzey üzerindeki adezinlerin değerlikli görüntü yüzey. Bozulmamış bakteri veya bacteri kullanıldığı çalışmalarda karşılaştırıldığındaal mutantlar, boncuk yaklaşımı bakteriyel büyüme ile ilgili sorunları circumvents. Olumsuz konak hücrelerini etkiler büyüme ortamı ve besin tüketme asitlenme ve bakteri çoğaltma sonunda ödün - Örneğin, uzun vadeli (örneğin, O / N) sağlam bakterileri kullanarak hücrelerin barındırmak için bakteriyel yapışma çalışmalar genellikle bakteri gelişimini eşlik olayların tarafından tehlikeye görüntü kalitesi. Daha yakın zamanda, boncuk çiftli adezinlerin kullanımı bakteriyel eklenme alt sinyalleme işlemlerinin rol oynayan konak hücre faktörlerinin meyil saflaştırılması için bir araç olarak kullanımını içerecek şekilde genişletilmiştir. V. parahaemolyticus MAM7 konakçı hücre zarında fosfatidik asitler bağlanarak, RhoA aktivasyonu ve aktin yeniden düzenlemeleri 1, 3 tetikler. MAM çiftli taneler arındırmak ve MAM-konakçı hücre bir sonucu olarak bir araya toplanan sinyal platformları katılan proteinleri tanımlamak için kullanılmaktadır bağlama. Boncuklar can berikolayca kısa santrifüjleme aşaması süpernatanından ayrılması ve ilgili protein kovalent bağlanan, bu tür proteomik veya Western gibi alt uygulamalar için kullanılabilir, ilgili protein kompleksleri kirletici proteinlerden ayrılmasını sağlamak ve zenginleştirmek için iyi bir yöntem olup, Kurutma.

Konak-patojen arayüzünde bakteriyel adhezinler ve konak yüzey reseptörleri arasındaki etkileşimleri incelemek, bakteriyel yapışmayı yönlendiren altta yatan mekanizmaları anlamamız için önemli bir adımdır. Sonuç olarak, bu, enfeksiyonlar sırasında bu süreçlere müdahale etmek için stratejiler belirlememize yardımcı olacaktır. Bu tür çalışmaları yürütürken, genellikle bir ikilemle karşı karşıya kalırız: Adhezin bağlanmasının moleküler mekanizmalarının biyokimyasal ve biyofiziksel analizi, yapışma olaylarına müdahale edebilecek diğer hücre duvarı bileşenlerinden ayrılmalarını gerektirir. Öte yandan, rekombinant çözünür proteinlerin kullanılması, bakteri hücre duvarındaki protein ankrajını ve bakteri yüzey gösterimi yoluyla elde edilen bağlanmanın çok değerliliğini göz ardı ederek yapışma olayını aşırı basitleştirir. Aynı şekilde, konak hücrenin bakış açısından, tek adezin molekülleriyle karşılaşma ve bağlanma, plazma zarı organizasyonu, zar akışkanlığı ve reseptör kümelenmesi1 açısından her zaman aynı etkiye sahip değildir ve bu, sonuçta, yapışmanın konak hücresel sinyalizasyonu üzerindeki etkisini ve bakteri-konak etkileşimlerinin sonucunu değerlendirmeyi zorlaştırır. 
Son zamanlarda, rekombinant saflaştırılmış adezinlerin veya adezin fragmanlarının, bakteri yüzeyine benzer boyutta polimer partiküllerine yönlü ve kovalent olarak bağlandığı, böylece bakteri yüzey görüntüsünü taklit ettiği bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yaklaşım, Gram-negatif Çok Değerlikli Adezyon Moleküllerinden (MAM'lar)2, 3, Staphylococcus aureus fibronektin bağlayıcı protein (FnBPA)4, 5 ve Streptococcus pyogenes F1 6, 7 dahil olmak üzere Gram-pozitif adezinlere kadar bir dizi farklı adezin üzerinde kullanılmıştır. Bu yöntem, konak hücre bağlanması için önemli olan adhezin fragmanlarının diseksiyonuna, konak yüzey reseptörlerinin tanımlanmasına ve konak hücre yüzeyindeki davranışlarının belirlenmesine izin verirken, hem bağlanma afinitesi hem de aviditeyi dikkate almıştır 1, 8. Ek olarak, bu yaklaşım, konak-patojen etkileşimlerinin inhibitörleri olarak hareketsizleştirilmiş adezinlerin ve türevlerinin etkinliğini araştırmak için kullanılmıştır 8, 9. Vibrio parahaemolyticus Çok Değerlikli Adezyon Molekülü (MAM) 7'nin yüzey bağlantılı türevlerinin, Acinetobacter baumannii ve metisiline dirençli S. aureus (MRSA) 7, 9 gibi çoklu ilaca dirençli patojenlerin neden olduğu enfeksiyonlar da dahil olmak üzere bir dizi bakteriyel enfeksiyonu in vitro olarak zayıflatmak için kullanılabileceği gösterilmiştir. 
Burada, adhezinleri ticari olarak temin edilebilen işlevselleştirilmiş polistiren parçacıklarına hareketsiz hale getirmek için kullanılabilecek farklı kimyaları açıklıyoruz. Çok çeşitli mevcut yüzey işlevleri, etiketler ve partikül boyutları nedeniyle, bunlar adhezin-konak etkileşimlerini araştırmak için bakteriyomimetik malzemelerin üretimi için yararlı bir iskeledir. Birleştirme reaksiyonunun ilk karakterizasyonu ve elde edilen malzemelerin önemli özelliklerinin hesaplanması için yöntemleri daha ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Son olarak, in vitro bakteriyel enfeksiyonların rekabetçi inhibitörleri olarak boncuk bağlı adezinlerin kullanımı, uygulamalarının bir örneği olarak ve bu yaklaşımın gelecekteki kapsamı ve sınırlamaları olarak tartışılmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Reaktifler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP)</td> <td>Sigma</td><td>646547</td><td>Tehlike; aşındırıcı çözelti olarak veya taze hazırlanmış olarak satın alınabilir</td></tr><tr><td>Sülfosüksinimidil 4- (p-maleimidofenil) bütirat (Sulfo-SMPB)</td> <td>Fisher</td><td>PN22317</td><td>Tehlike; toksik</td></tr><tr><td>L-sistein</td><td>Sigma</td><td>30089</td><td>Tehlike; toksik</td></tr><tr><td>Lateks boncuklar, amin modifiyeli polistiren, floresan mavi - sulu süspansiyon, 2.0&nbsp; &mu; m ortalama parçacık boyutu</td><td>Sigma</td><td>L0280</td><td>zararlı; bir dizi alternatif parçacık boyutu ve rengi mevcuttur:</td></tr><tr><td>1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC)</td> <td>Termo bilimsel</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hidroksisüksinamid (NHS)</td> <td>Termo bilimsel</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>Karboksilat modifiyeli polistiren boncuklar</td><td>Sigma</td><td>CLB9</td><td>zararlı; bir dizi alternatif parçacık boyutu ve rengi mevcuttur</td></tr><tr><td>Etilendiamin</td><td>Sigma</td><td>E26266</td><td>Tehlike; yanıcı, aşındırıcı, toksik, hassaslaştırıcı</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA)</td><td>Promega</td><td>W3841</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reaktifi</td><td>Sigma</td><td>B6916</td><td>Tehlike; aşındırıcı ve toksik</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta - yüksek glikoz - 4.500 mg/L glikoz ve sodyum bikarbonat içeren, içermeyen&nbsp; L-glutamin, sodyum piruvat ve fenol kırmızısı, sıvı, steril filtreli, hücre kültürü için uygun</td><td>Enfeksiyon deneyleri için</td><td>Sigma</td><td>D1145</td></tr><tr><td>Kültürlenmiş konak hücrelerin bakımı için</td><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, ısıyla inaktive</td> edilmiş <td>Sigma</td><td>F9665</td><td>doku kültürü ortamı</td></tr> <tr><td>için takviyePenisilin-Streptomisin - Çözelti, 10.000 ünite penisilin ve 10&nbsp ile stabilize edilmiştir; mg streptomisin/mL, steril filtreli, BioReagent, hücre kültürü için uygun</td><td>Doku kültürü ortamı için</td><td>Sigma</td><td>F9665</td> takviyesi</tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>LDH Sitotoksisite tespit kiti</td><td>Takara</td><td>MK401</td><td></td></tr><tr><td>Plastik malzeme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>reaktif rezervuarları (25ml)</td><td>SLS</td><td>F267660</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu plakalar</td><td>Greiner</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plakalar</td><td>Greiner</td><td>655182</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekipmanları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hemositometre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikrosantrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>plaka okuyucu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>doku kültürü tesisleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>çok kanallı pipet</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bakteri-konak etkileşimleri karakterize etmek biyomimetik malzemeler

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Konak hücrelere bakteri bağlanması, konak dokuların bakteri kolonizasyonu sırasındaki en erken olaylardan biridir ve bu nedenle enfeksiyon sırasında önemli bir adımdır. Bu ilk bakteri-konak etkileşimlerine aracılık eden adezinlerin biyokimyasal ve fonksiyonel karakterizasyonu, genellikle analize müdahale eden hücre duvarı bileşenleri veya salgılanan moleküller gibi diğer bakteriyel faktörlerin varlığı ile tehlikeye girer. Bu protokol, bireysel bakteriyel adhezinler ve konak hücre reseptörleri arasındaki biyokimyasal ve fonksiyonel etkileşimleri incelemek için başarıyla kullanılan, ticari olarak temin edilebilir, işlevselleştirilmiş polistiren boncuklara kimyasal olarak bağlanmış saf rekombinant adezinlerden oluşan biyomimetik malzemelerin üretimini ve kullanımını tanımlar. Polimer iskeleler üzerinde rekombinant adezinlerin yönlü immobilizasyonuna izin veren ve elde edilen "bakteriyomimetik" malzemelerin birleştirme verimliliğinin değerlendirilmesi için farklı birleştirme kimyaları için protokoller de tartışılmaktadır. Bu materyallerin patojen aracılı sitotoksisiteyi inhibe etmek için bir araç olarak nasıl kullanılabileceğini daha ayrıntılı olarak açıklıyoruz ve bakteri-konak etkileşimlerinin incelenmesinde bu yaklaşımın kapsamını, sınırlamalarını ve diğer uygulamalarını tartışıyoruz.

V. parahaemolyticus adezinin MAM7 konak yüzey reseptörleri tanınması katılan yedi tandem memeli hücre girişi (MCE) etki içerir. Bu V ile rekabet etmek için, bu malzemelerin kabiliyetini test etmek için yedi ardışık MCE etki (MAM7) ya da sadece ilk MCE alanını (MAM1) ya da polistiren kapsayan rekombinant bağlanmış boncuklar, saflaştırılmış fragmanlar kullanılır bağlama konakçı hücre için parahaemolyticus ve yapışma inhibitörleri olarak, bu maddelerin elde edilen etkinlik. Hela hücreleri V. ile enfekte edildi in vitro enfeksiyonundan kaynaklanan parahaemolyticus streyn POR1 ve sitotoksisite 4 saat (Şekil 3) sonra değerlendirilmiştir. % 0.1 Triton X-100 (pozitif liziz kontrol) Hela hücrelerinin tedavisi tam hücre lizizi ile sonuçlanmıştır, enfekte olmamış hücreler POR1 ile muamele edilmemiş olan hücreler üzerinde in vitro enfeksiyonu hücre lizizi çok yüksek seviyelerine yol açtı. Sitotoksisite, çok düşük seviyelerde gösterilir ve bu MAM7-co ile inhibe edilmiştirboncuklar upled ancak MAM1-bağlanmış olmayan ya da GST-bağlanmış kontrol tanesi (Şekil 3). <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53400/53400fig3.jpg" /> Vibrio parahaemolyticus Şekil 3. Karakterizasyonu rekabet deneyleri sırasında epitel hücrelerinde sitotoksisitesine neden olmuştur. Hücreler, V ile tedavi edildi parahaemolyticus (Vp), (+) ile gösterilir, ya da bakteriler (-) farklı rakip öğeler (. bileşik) mevcudiyetinde gösterildiği gibi. Bunlar ya hiç comp dahil. (-), MAM7 boncukları (MAM7), MAM1 boncukları (MAM1) ya da GST kontrol tanesi, (GST). Kontroller olarak, hücreler Triton X-100 (triton, liziz kontrolü) ya da muamele edilmiş ya da enfekte edilmeden (uninf) kalmıştı. Bölüm 3&#39;te tarif edildiği gibi 4 saat sonra LDH salınımı ölçüldü ve sonuçlar Triton kontroller (% 100) ve yukarıda tarif edildiği gibi boşlukları (% 0) normalize edilmiş. Sonuçlar üçlü deneylerden elde edilen ortalama ± SEM araçlardır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> V. numaralandırma MAM7-, MAM1-, ya da GST Kontrol taneleri ile inkübe muamele edilmemiş Hela hücreleri, ya da hücrelerin ya da bağlı parahaemolyticus MAM7 boncuklar fakat MAM1- olmayan ya da GST kontrol tanesi, V outcompete ortaya eki için parahaemolyticus hücre yüzey reseptörleri (Şekil 4) ev sahipliği yapacak. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53400/53400fig4.jpg" /> Yarışma deneyler sırasında bakteriyel ekin Şekil 4. Karakterizasyonu. Hela hücreleri V ile enfekte edildi parahaemolyticus yokluğunda POR2 (Vp +), (-) ya da birim rekabet mevcudiyeti aşağıdaki gibi MAM7 boncukları (MAM7), MAM1 boncukları (MAM1) ya da GST kontrol tanesi, (GST) (blş.). Bakteriyel yapışma olarak 1 saat sonra ölçülmüştür<html> bölümünde anlatılan 3. Sonuçlar üçlü deneyler ± SEM araçlardır. Araçlar (CFU / ml FLTR) 2,3010 6, 1,5310 5, 2,0510 6, 2,1210 6 bulunmaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Fluorofor etiketli boncuklara bağlanmış adhesinler konukçu hücrelere bakteriyel yapışmayı taklit ve hücresel görüntüleme (Şekil 5) güçlü araçlardır maddelerin oluşumuna yol açar. MAM7-birleştiğinde floresan mavi boncuk kullanarak, epitel hücrelerine MAM7 aracılı eki sürecini karakterize. Konukçu hücrelere MAM7 bağlanması yeniden düzenlenmesi ve birlikte görüntülenmiştir F-aktine (Şekil 5B) için leke rodamin Phalloidin kullanıyorlardı stres elyafların biçimlendirilmesine aktin ile sonuçlanmıştır. _upload / 53400 / 53400fig5.jpg &quot;/&gt; Hela için MAM7-birleştiğinde boncuk Şekil 5. hazırlanması ve floroforun kullanımı floresan mavi biomimetic boncuk (A) Süspansiyon (sağ tüp, 10x stok). Görüntüleme amaçlı biomimetic boncuk etiketli ve kontrol (sol tüp) tampon. (B) Ek aktin düzenlenmeleri ve stres lif oluşumu hücreler sonuçları. (Rodamin-Phalloidin ile boyanmış kırmızı) floresan mavi boncuk Bağlanma ve elde edilen aktin stres lifleri mikroskobu ile görüntülendi. Bar, 10 um. Panel B Görüntüler Lim ve ark. 1 uyarlanmıştır ve Creative Commons Attribution lisansı altında yeniden üretildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Konak hücrelere bakteri bağlanması, konak kolonizasyonu ve enfeksiyonu sırasında önemli bir adımdır. Bu protokol, diğer bakteriyel faktörlerden bağımsız olarak, bireysel adezinlerin bu süreçlere katkısının analizine izin veren biyomimetik malzemeler olarak polimere bağlı rekombinant adezinlerin üretilmesini tanımlar.

Bakteri-konak Etkileşimleri karakterize etmek Biyomimetik Malzemeler

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Bu prosedürün genel amacı, polistiren boncuklara bağlanmış saf rekombinant adhezinlerden oluşan biyomimetik materyaller üretmek olup; bunlar daha sonra bireysel bakteriyel adhezinler ile konak hücre reseptörleri arasındaki biyokimyasal ve fonksiyonel etkileşimleri incelemek için kullanılabilir. Bu yöntem, konak hücre sinyallemesi üzerindeki etkilerin ölçülmesi ve patojen kaynaklı sitotoksisitenin inhibisyonu gibi, konak patojen etkileşimleri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, saflaştırılmış adhezinlerin (AEAs), boyut olarak bakterilere benzer olan ve böylece bakteriyel yüzey sergilemesini taklit eden polimer partiküllere yönlü ve kovalent olarak bağlanmış olmasıdır.Prosedürü benimle birlikte laboratuvarımızdan doktora öğrencisi TU A-C-E-D-A uygulamalı olarak gösterecek. Burada tiyol-amin yönlü eşleşme gösterilecektir. Bu protokol, çapraz bağlayıcı ajan olarak SMPB (suksinil fenil bütirat) kullanılarak, sistin içeren proteinlerin amin fonksiyonlu polimer boncuklara bağlanması için uygundur. Boncuk aktivasyon prosedürüne başlamak için, protokol metninde açıklandığı şekilde gerekli tüm reaktifleri kullanımdan hemen önce hazırlayın.Boncuk süspansiyonunu nazikçe altüst ederek karıştırın ve ardından gerekli miktardaki boncuk süspansiyonunu steril 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Bir mililitre steril PBS pH 7,0 içeren tüpte, boncukları yıkamak için nazikçe pipetle yukarı-aşağı çekme işlemi yapın ve mikro santrifüjde santrifüjleyerek çöktürün. Süpernatanı bir pipet ve dikkatle uzaklaştırın.Boncuk peletini bir mililitre taze steril PBS içinde yeniden süspande edin ve yıkama adımını tekrarlayın. Boncuk peletini yeniden süspande edin. 0.8 mililitre PBS'ye, taze hazırlanmış 200 mikrolitre 10 millimolar SFO SMPB ekleyin.İki milimolar son konsantrasyon sağlamak için boncuk süspansiyonunu, boncuklar inkübe olurken bir döner tekerlek üzerinde 25 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Proteini, aktive edilmiş boncuklara hemen eklenebilmesi için bir sonraki kenetleme adımına hazırlayın. Protein konsantrasyonunu kontrol edin ve kenetleme reaksiyonu için gerekli olan son konsantrasyona ayarlayın. Altı.Protein indirgenmesi için genellikle mikromolar düzeyde protein ve PBS ile bir mililitre hacim kullanılır. Son konsantrasyon beş milimolar olacak şekilde TEP stok çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin; başlangıç protein konsantrasyonunun belirlenmesi ve kenetlenme verimliliğinin hesaplanması için protein çözeltisinden birkaç mikrolitre ayırın.Aktive edilmiş boncukları çöktürerek ve çökeleği yıkayarak protein bağlama prosedürüne başlayın. Bir mililitre taze, steril PBS içerisinde bulunan çökeleği, istenen protein konsantrasyonunu elde etmek için hazırlanan protein çözeltisinde yeniden süspande edin. Protein boncuk süspansiyonunu, döner bir tekerlek üzerinde 25 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. İki saat sonra, nihai konsantrasyonu 50 mM olacak şekilde bir Sistin stok çözeltisi ekleyerek ve süspansiyonu döner bir tekerlek üzerinde 25 °C'de 30 dakika inkübe ederek boncuklar üzerindeki kalan aktif grupları etkisiz hale getirin.Boncuklar santrifüjle çöktürüldü. Protein konsantrasyonunun belirlenmesi ve kenetlenme veriminin hesaplanması için süpernatan saklayın. Boncuk peletini iki kez 1 mL PBS ile yıkayın ve yeniden süspansiyon haline getirin. Yarışma analizinden bir gün önce nihai ürünü hazırlamak için, 24 kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa 150.000 hücre/mL konsantrasyonda 1 mL HeLa hücresi ekleyin.Bu, hücrelerin deney başlamadan önce yaklaşık %80 konfluense ulaşmasını sağlayacaktır. Beş mililitrelik denizel LB kültürüne taze bir V para hemolytic kolonisi inoküle edin ve 30 °C'de çalkalamalı olarak gece boyunca büyütün. Daha önce gösterildiği şekilde yeterli miktarda boncukla eşleşmiş çok değerli adhezyon molekülü hazırlayın.Yarışma deneyi gününde, kuyu başına 100 µL 10 x boncuk stok veya 500 nM protein nihai konsantrasyonu sağlayın. Bakteriyel kültürün OD 600 değerini ölçün. Bakteriyel kültürleri katkısız, renksiz DMM içinde seyrelterek enfeksiyon ortamını hazırlayın.Hacimce %10'luk vuruş süspansiyonu içeren ortamı 37 °C'ye ön ısıtmaya tabi tutun. 10'luk bir MOI sağlamak için kuyuk başına bir mililitre ve örnek başına %10 ila %20 fazla hacim hazırlayın. Kuyulardaki eski besiyerini uzaklaştırın ve kültürleri yıkayın.Her bir kuyucuğa 37 °C'ye önceden ısıtılmış bir mililitre steril PBS ekleyerek hücreleri iyileştirin. PBS'yi uzaklaştırın ve kuyucuk başına bir mililitre enfeksiyon ortamı ekleyin. Pozitif kontroller olarak kontrol boncukları ve bakteri içeren çözeltileri, negatif kontroller olarak ise adhezyon boncukları içeren ve bakteri bulunmayan çözeltileri ekleyin.Liz kontrolü olarak %0.1 TRITTON X 100 içeren DMM ekleyin. Kontroller dahil olmak üzere her bir deneysel koşulu üç tekrarlı olarak hazırlayın. Plakayı, doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de istenen süre boyunca inkübe edin.Sitotoksisite değerlendirilir. Enfeksiyondan dört saat sonra, 24 kuyucuklu plakadaki her kuyucuktan 200 µL alınır ve yeni bir 96 kuyucuklu plakaya aktarılır.96 kuyucuklu plakayı 1, 500 G'de beş dakika boyunca santrifüj edin ve her kuyucuktan 100 microliter'ı yeni bir 96 kuyucuklu plakaya aktarın. Kör örnek olarak kullanılmak üzere, 96 kuyucuklu plakanın üç yeni kuyucuğuna enfeksiyon deneyleri sırasında kullanılan ortamdan 100 microliter ekleyin. Bir LDH Sitotoksisite tespit kiti kullanarak ve üretici talimatlarını izleyerek laktat dehidrogenaz salınım analizini gerçekleştirin.Öncelikle, gereken reaktif miktarını 25'lik artışlarla hesaplayın. Örneğin, 100 örnek için; 11,25 mililitre reaktif A'yı 250 mikrolitre reaktif B ile karıştırın; köpürmeyi önlemek için ters çevirerek karıştırın, vortekslemeyin.Ardından, karışımı bir rezervuara koyun. Daha sonra, her örneğe 100 µL reaktif karışımı ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 10, 20 ve 30 dakika boyunca inkübe edin. Absorbansı bir plaka okuyucuda 490 nm'de okuyun.Ardından, sitotoksisite yüzdesini makalede açıklandığı şekilde hesaplayın; bakteriyel adezyon ölçümleri enfeksiyondan bir saat sonra yapılır. Bağlanmamış hücreleri uzaklaştırmak için besiyerini hücre tabakasından alın ve hücre tabakasını steril, önceden ısıtılmış PBS ile iyice yıkayın. Her seferinde bir mililitre PBS ile en az üç ila dört kez yıkayın; her kuyucuğa PBS içinde steril %1 hacim/hacim Triton X 100 çözeltisinden bir mililitre ekleyerek konak hücreleri lize edin ve plakı 37 °C'de beş dakika inkübe edin.Her kuyunun içeriğini ayrı 1.5 mililitrelik tüplere aktarmadan önce, her örneği pipetle birkaç kez aşağı yukarı çekerek karıştırın. Örneklerin steril PBS içerisinde on katlı seri dilüsyonlarını hazırlayın; her örnekten 100 mikrolitreyi marine LB agar plaklarına aktarın ve bir hücre yayma çubuğu kullanarak yayın. Bu deneysel düzenek için hangi dilüsyonun plaklanacağını bakteriyel suşlara ve zaman noktasına bağlı olarak optimize edin.10⁵ veya 10⁶ katlı bir seyreltme, uygun sayıda CFU sağlayacaktır. Plakaları 37 °C'de gece boyunca inkübe edin ve ertesi gün koloni sayımıyla bakterileri belirleyin. Rekabet analizlerinde, HeLa hücreleri V. parahaemolyticus suşu ile enfekte edildi.Farklı rakip varlıkların varlığında, pozitif olarak belirtilen veya enfekte edilmemiş olan zayıf olan. Zayıf olan ile in vitro enfeksiyon, MAM seven kuplü boncuklar tarafından inhibe edilen ancak MA'AM one kuplü veya GST kuplü boncuklar tarafından inhibe edilmeyen çok yüksek düzeylerde hücre lizisi ile sonuçlanmıştır. İşlem görmemiş HELOC hücrelerine veya MAM ile inkübe edilmiş hücrelere tutunan v paralitiklerin sayımı.Yedi MAM bir veya GST kontrol boncukları, MAM yedi boncuklarının, ancak MAM bir veya GST kontrol boncuklarının, konak hücre yüzey reseptörlerine tutunma konusunda v parahemolitiği rekabet ederek engellediğini ortaya koymuştur.Florokroma eşleşmiş adezyonlar. Etiketlenmiş dört boncuk, bakterilerin konak hücrelere adezyonunu taklit edebilir ve hücresel görüntüleme için güçlü araçlardır. Sağdaki tüp, floresan mavi biyomimetik boncukların bir süspansiyonunu içermektedir.MAM.MAM seven aracılı epitel hücrelere tutunma sürecini karakterize etmek için birbirine bağlanmış yedi adet floresan mavi boncuk kullanılmıştır. MAM seven'in konak hücrelere tutunması, aktin yeniden düzenlenmelerine ve stres liflerinin oluşumuna yol açmış olup, bunlar f-aktini boyamak için Rumine Phin kullanılarak birlikte görselleştirilmiştir. Bu prosedürün ardından, bakteriyel tutunmanın altındaki sinyal iletim süreçlerinde hangi konak hücresel faktörlerin yer aldığı gibi ek soruları yanıtlamak için proteomik ile birleştirilmiş afinite saflaştırması veya western blot gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

biomimetic-materials-to-characterize-bacteria-host-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Stones, D. H., et al. Bakteri-konak etkileşimlerini karakterize etmek için biyomimetik malzemeler. J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, rekabetçi koşullar altında konakçı epitel hücrelerine bakteriyel yapışmayı ölçmek için bakteriyomimetik boncukların kullanımını göstermektedir. Hücrelerin işlenmesi, parçalanması ve koloni oluşturan birimleri ölçmek için seri seyreltmelerin kaplanması ile ilgili adımları ana hatlarıyla belirtir.

Biyomimetik boncuklar kullanılarak bakteri-konak hücre etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Bu videoda, anaerobik patojenik bir bakteri olan Porphyromonas gingivalis'in insan göbek damarı endotel hücrelerine (HUVEC'ler) yapışma ve istila etme yeteneğini değerlendirmek için bir teknik gösterilmektedir. Konakçı hücreleri bakterilerle enfekte ettikten sonra, konakçı hücreler hem yapışmış hem de içselleştirilmiş bakterileri serbest bırakmak için parçalanır. Lizat uygun bir ortamda kaplandığında, kolonilerin varlığı başarılı bakteri-konak hücre etkileşimlerini gösterir.

Anaerobik Bakteri-Konak Hücre Etkileşimlerini İncelemek İçin Bir Bakteriyel Enfeksiyon Testi

Bu makale iki protokol sunar: biri konakçıyı başarılı bir şekilde istila edebilen ve hayatta kalabilen anaerobik bakterileri ölçmek, diğeri ise konakçı hücrelerle etkileşime giren anaerobik bakterileri görselleştirmek için. Bu çalışma, yetiştirilebilir herhangi bir anaeroba ve herhangi bir ökaryotik hücre tipine uygulanabilir.

Ana Hücreleri ile Anaerobik Bakteriler Etkileşim değerlendirilmesi için bir model organizma olarak Porphyromonas gingivalis

Bu protokolde sunulan ortak kültür etkileşimi tahlilleri ucuz, yüksek iş ortası ve basittir. Bu tahliller, ortak kültürdeki mikrobiyal etkileşimleri gözlemlemek, etkileşim kalıplarını belirlemek ve insan ve çevresel patojenlere karşı mikrobiyal bir ilgi nin önleyici potansiyelini karakterize etmek için kullanılabilir.

Mikrobiyal Etkileşimlerin İncelemi için Yüksek İş-İş Ortağı Tahlilleri

Bu canlı-bakteriyel hücre görüntüleme protokolü zaman içinde tek hücre düzeyinde birden fazla bakteri türü arasındaki etkileşimlerin görselleştirilmesiiçin izin verir. Hızlandırılmış görüntüleme, tek tek kültür veya ortak kültürdeki her bakteri türünün gözlemlenmesine olanak sağlar ve bireysel hücre hareketliliği ve canlılığı da dahil olmak üzere çok türler arası bakteri topluluklarındaki türler arası etkileşimleri sorgular.

Tek Hücreli Türler Arası Bakteri Etkileşimlerinin Kinetik Görselleştirilmesi

Bu kolaylaştırılmış protokol, karmaşık doku örneklerindeki bakterileri tespit etmek ve görüntülemek için, dokuyu sabitlemekten floresan in situ hibridizasyonlu mikropları boyamaya kadar bir iş akışını detaylandırıyor.

Floresan In Situ Hibridizasyon, Lectin Boyama ve Görüntüleme Yoluyla Gut Mikrobiyota-konak Etkileşimlerinin Görselleştirilmesi

Otomatik istatistiksel analiz yöntemleri ile birlikte yüksek verimli floresan etiketleme görüntüleme kullanılarak fenotipik yapışma esas alınarak konak-bakteriyel patojen etkileşimlerinin tespiti, konak hücrelerle potansiyel bakteriyel etkileşimlerin hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.

Konak Hücrelere Bakteriyel Yapışmanın Otomatik, Yüksek Verimli Tespiti

Matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonizasyon görüntüleme kütle spektrometrisi ile agara bazlı, bakteriyel makrokolonilerin analizi için yeni bir numune hazırlama yöntemi gösterilmiştir.

Enfeksiyon Sırasında Agar ve Dokuda Yetişen Bakteri Kolonilerinin Görüntüleme Kütle Spektrometrisi Analizi Yoluyla Mikrobiyal İşbirliğinin İncelenmesi

Mevcut protokol, in vitro olarak konak-patojen etkileşimlerini araştırmak için organotipik doku modellerinin uygulanmasını özetlemektedir. Spesifik olarak, açıklanan model sistemi, ağız sağlığına karşı hastalık bağlamında biyofilmlerle (diş plağı) ilişkili mikroorganizmalara maruz kalan çok katmanlı bir ağız epiteli kullanır.

Konak-Patojen Etkileşimlerinin İn Vitro Araştırılması için Organotipik Doku Model Sistemleri

İnsan papillomaviri gibi lokalize enfeksiyonlara neden olan patojenlerin T-hücresi epitoplarının karakterizasyonu, dolaşımdaki T hücresi sayısının sınırlı olması nedeniyle zorludur. Nadir T hücrelerinin, çok az sayıdaki hücreden başlanarak izole edildiği ve karakterize edildiği bir yöntem açıklanmıştır.

Human Papillomavirüs Roman T hücre epitopları Karakterizasyonu için interferon-γ Enzim bağlı immünospot Assay Kullanımı

Keşfedin bakteri-konak etkileşimlerini biyomimetik malzemeler kullanarak. Bu yöntem, rekombinant adezinleri polistiren boncuklara kovalent bağlayarak bakteri tutunmasını ve sitotoksisiteyi analiz etmenizi sağlar.

Bakteri-konak Etkileşimleri karakterize etmek Biyomimetik Malzemeler

Daha fazla video keşfet