Name: Oranlı metrik Floresan Mikroskopi fagosom pH ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Öğrenin, oranlı metrik floresan mikroskopi ile canlı fagositlerde fagosomal pH ölçümü yapmayı. Bu yöntem, fagozom olgunlaşmasını ve patojen etkileşimlerini anlamak için gerçek zamanlı pH değişimlerini izlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından 31003A-149566 (N.D.'ye) ve The Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust tarafından Genç Araştırmacı Sübvansiyonu (P.N.'ye) aracılığıyla mali olarak desteklenmektedir.

Etik Beyanı: Tüm hayvan manipülasyonları Cenevre Üniversitesi Hayvancılık Araştırma Komitesi kurallarına sıkı göre yapıldı. Fagositik Hedeflerinin 1. Hazırlık <ol><li> 10 ml steril fosfat tamponlu salin (PBS) kurutularak zimosan 20 mg ekleyin. 10 dakika boyunca kaynar su banyosuna Vorteks ve ısı. 5 dakika boyunca 2.000 xg&#39;de Serin ve santrifüj. </li><li> Bir su banyo sonikatörü içinde 10 dakika için supernatant, 1 ml PBS içinde tekrar süspansiyon ve sonikasyon çıkarın. Iki adet 1,5 ml&#39;lik tüplere 500 ul aktarın. 5 dakika boyunca 11.000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 500 ul PBS ile yıkama tekrarlayın. Kaynatıldı zimosan donduruldu ve -20 ° C&#39;de saklanır, bölünmüş olabilir. </li><li> Taze CO 3 0,1 M Na-2 hazırlanan 500 ul, pH 9,3, yukarıdaki (aşama 1,2) iki kez zimosan yıkayın. </li><li> Son yıkamadan sonra 490 ul süspanse. 10 mg 10 ul ekle / FITC dimetil sulfoxid içinde eritildi mle (DMSO), girdap, folyo ile kapatın ve oda sıcaklığında 4 saat boyunca çalkalanarak kuluçkalayın. </li><li> Önce 0.5 mi DMSO + 300 ul PBS, daha sonra 0.5 ml DMSO + 450 ul PBS, o zaman sadece PBS sonra + 150 ul PBS, 0.5 ml DMSO, yukarıda tanımlandığı gibi (aşama 1,2) yıkama, bağlanmamış boya kaldırın. </li><li> Bir hemositometre kullanılarak zymosan güvenin. 500 ul PBS, girdabına zimosan 1 ul ekleyin, o zaman merkezi ızgara üzerine yerleştirilen lamel karşılayan hemositometre odasına kenarına 10 ul ekleyin. 20X amacı ile donatılmış bir aydınlık alan mikroskop hemositometre monte edin. </li><li> 16 kareler içeren sol üst köşesindeki odaklanın ve bir el taksitli sayacı kullanarak bu alandaki tüm zimosan parçacıkları saymak. Sağ alt köşede tekrarlayın. = Zymosan konsantrasyon / 2 x 500 x 10 4 zymosan / ml Sayısı: aşağıdaki denklem kullanılarak zymosan konsantrasyonunu hesaplayın. Etiketli zimosan donduruldu ve -20 ° C&#39;de saklanır, bölünmüş olabilir. </li><li> Etiketli zymosan wi opsonize100 seyreltme: 1 bir tavşan anti-zimosan antikor th. Vorteks ve 37 ° C su banyosu içinde 1 saat boyunca inkübe edilir. (Adım 1.2) yukarıdaki gibi 500 ul PBS ile yıkayın. Not: zymosan sonra analiz daha zorlaştırabilir öbekler şeklinde eğilimi Sonikasyon yüksek, özellikle de opsonızasyonu sonra, tavsiye edilir. % 65 h / h sıçan ya da insan serumu ile Opsonizasyon alternatif olarak kullanılabilir. </li><li> Adımda 1,7-1,8 de tarif edildiği gibi, bir hemositometre kullanılarak zimosan Sayısı ve 100 x 10 6 parçacık / mL&#39;ye seyreltilir. Örneğin tamamlayıcı veya opsonızasyonu gibi diğer fagositik uyarıcıları ile Opsonizasyon alternatif gerçekleştirilebilir. </li></ol> 2. Canlı Video Mikroskopi <ol><li> Başka bir yerde 38 detaylı bir şekilde tarif edildiği gibi primer fare nötrofil izole edin. <ol><li> Alternatif olarak, herhangi fagositik hücre türünü kullanın. Roswell Park Memorial Institute (RPMI),% 5 fetal dana serumu (hacim / hacim), 200 U penisilin / streptomyci ile desteklenmiş 1640 ortam içinde buz üzerinde tutun nötrofillerin, 10 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda kullanıma hazır olana kadar. Diğer hücre tipleri 1-4 gün önce, tohumlanabilir. </li></ol></li><li> , 35 mm cam alt çanağın merkezine nötrofillerin 2 x 10: 5 (20 ul) ilave edilir ortam 50 ul ekleyerek damla yayılması ve hücrelerin yapışmasına izin vermek için 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde 1 mi belirli bir MPO inhibitörü 4-aminobenzoik hidrazid (4-ABH, 10 uM) ihtiva eden 37 ° C&#39;ye ısıtıldı ekleyin. Sodyum azit (5 mM) gibi Spesifik olmayan MPO inhibitörleri de kullanılabilir, ancak yakın zamanda, pH 39 ek spesifik olmayan etkiler gösterir uygulamak için önerilmiştir. </li><li> Bir 37 ° C ısıtma sistemi ve 40X petrol amacı ile donatılmış bir geniş açılı floresan mikroskop çanak monte edin. Hücreler ve ekipmanlar denge sağlamak için 10 dakika için görüntüleme hücrelere inkübe edin. </li><li> Parlak-alan iletim görüntü elde etmek için mikroskop ayarlarını yapın [phase ya da 440 nm ya da 490 nm eksitasyon ve 535 nm emisyonda, her 30 saniyede eğer varsa diferansiyel girişim kontrast (DIC)]. </li><li> Çok fazla photobleaching ve fototoksisite ve deneysel sorular bağlı olarak soruluyor önlemek için mikroskop sistemine göre pozlama süresini ve satın alma sıklığını ayarlayın. Görüntü elde etme başlayın. </li><li> 2 dakika sonra, 10 x 10 6 (50 ul), FITC-zimosan çanak merkezine opsonize ekleyin. Kullanılan fagosit ve hedefin tipine bağlı olarak hücre oranlarını: Hedef ayarlayın. </li><li> 30 dakika boyunca görüntülemeyi devam edin. 30 dakika sonra time-lapse edinimi durdurmak ve bir zamanlayıcı başlar. Sahne taşıyın ve 5 dakika içinde, görüntü diğer fagozomların bakış farklı alanlarda 10 veya daha fazla anlık yakalamak. </li></ol> 3. Kalibrasyon ve Kontrol Deneyleri <ol><li> Deney günü (tarifleri Tablo 1&#39;de tarif edilmektedir), önceki pH ayarlama solüsyonlarının hazırlanması ve 10 ml&#39;lik miktarlar halinde dondurma.Bir su banyosu içinde 37 ° C &#39;kalibrasyon çözümleri ve sıcak çözülme. Bir pH ölçer ile pH kontrol ve çözeltiler gerçek pH kaydedilir. </li><li> Önceki görüntü alımı için cam alt çanak peristaltik bir pompa monte edin ve (bölüm 2) Yukarıda açıklandığı gibi canlı video mikroskopi gerçekleştirin. </li><li> 30 dakika iktisap sürenin sonunda, yemeğin içindeki çözüm kaldırmak için pompa açın ilk kalibrasyon çözeltisinin 1 ml ekleyin ve pompayı durdurun. </li><li> Sinyal genellikle 5 dakika stabilize kadar bekleyin. Her kalibrasyon çözeltisi ile tekrarlayın. <ol><li> Deney, günde en azından bir kalibrasyon gerçekleştirin ve yüksek pH ile başlayan ve en sıralı olarak çalışma, hem de düşük pH başlayarak ve en yüksek doğru ardışık çalışma kalibre edin. </li></ol></li><li> Bir kontrol olarak, cam alt tabak içinde 900 ul HBSS içinde hücreler, HBSS içinde seyreltilmiş 100 uM NADPH oksidaz inhibitörü difenil propionium iyodür 100 ul (DPI) ekleyin ve10 dakika inkübe edilir. </li><li> Edinimi başlatın ve (adım 2.7) yukarıdaki gibi zymosan ekleyin. Fagositoz 15 dakika sonra HBSS içinde seyreltilmiş bir (conca) konkanamisin 10 uM V-ATPaz inhibitörü 10 ul ve 15 dakika daha devam görüntüleme. </li></ol> 4. Analiz <ol><li> Time-lapse film ve fagosom anlık analizi. Not: Aşağıdaki talimatlar ImageJ için özeldir. Adım adım talimatlar kullanılan yazılım bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir, ancak bu bölümde anlatılan fonksiyonlar en profesyonel görüntü analiz yazılımı mevcuttur. <ol><li> Profesyonel görüntü analiz yazılımı ile görüntüleri açın. Hiçbir hücreler vardır bir alanda kare çokgen seçim aracıyla küçük bir kare yatırım getirisi çizim ve ROI Eklentiler&gt; BG Çıkarma tıklayarak 490 kanal arka plan çıkarın. Ardından&gt; tıklayarak Düzen&gt; Seçim 440 kanalda aynı yatırım getirisini yüklemek Seçme ve tekrarı geri yükleyin. </li><li>Daha sonra Operasyonu açılır menüden &#39;Divide&#39; seçerek, ... Süreç&gt; Görüntü Hesaplama tıklayarak Image1 ve image2 açılır menülerden uygun görüntüleri seçerek 440 kanala bölünür 490 kanal 32-bit oranı görüntü olun ve 32-bit (float) sonuç check-kutusunu işaretleyerek. </li><li> &gt; Rainbow RGB Görüntü&gt; Arama Tabloları tıklayarak bir oran ile uyumlu renk kodlama renk kodlama look-up tablosu değiştirin. Eşik oranı görüntü&gt; Threshold&gt; Görüntü tıklayarak 0 ve sonsuzluk piksel ortadan Ayarlanır .... NaN onay kutusunu Set arka plan piksel seçili olduğundan emin hale o zymosan kırmızı görünür, böylece kaydırma çubuklarını ayarlayın ve Uygula&#39;yı tıklatın. </li><li> Görüntü tıklayarak bir çok kanallı kompozit içine parlak alan kanalı ile bu oran yığını birleştirin&gt; Renk&gt; Kanallar Birleştirme ve gri kanal açılır menüden parlak alan görüntü ve yeşil kanal açılır menüden oran görüntüsünü seçme ve seçmeOnay kutusunu kaynak görüntüleri tutun. Time-lapse film veya fagozomların analiz edilmelidir belirlemek için anlık tarayın. Parlak alan kanal için yararlıdır. </li><li> Ekle&gt; fagozomların etrafında oval poligon seçim aracını kullanarak ilgi (ROI) bölgelerini çiziniz ve Analiz&gt; Araçlar&gt; ROI Yöneticisi tıklayarak ROI yöneticisi ekleyebilirsiniz. Daha fazla&gt; Çok ölçün ve dilim onay kutusunun başına bir satır de-seçilerek tıklayarak kendi zymosan yoğunluk oranını ölçün. </li><li> Time-lapse film için, parça her zaman noktasını ölçmek için Ctrl + M yazarak, bir yatırım getirisi çizim ve zamanla yoğunluk değerlerini izlemek için gerektiğinde yatırım getirisi hareket ettirerek bir seferde bir fagozomların. Bir elektronik tablo yazılımı içine Sonuçları penceresinde ölçümleri kopyalayın. Not: bağımsız deneyler 15 (deney x 3 başına 5 zamanlı kurslar) Analizi ideal ama daha az ya da gözlenen değişkenlik bağlı gerekebilir olduğunu. İB&#39;leri Tasarruf her zaman tavsiye edilir. Bazı yazılım paketleri izin görüntü regiStration ve İB&#39;nin dinamik güncelleştirme, analiz bu bölümünü kolaylaştırmak. </li></ol></li><li> Floresans pH değerlerine Dönüşüm <ol><li> Bölüm 4.1&#39;de açıklandığı gibi kalibrasyon time-lapse filmlerde fagozomların için 490/440 oranını ölçün. </li><li> Elektronik tabloda zamanla oran değerlerini çizmek ve her pH kalibrasyonu karşılık gelen süre ortasında içinde 5 zaman noktalardan (5-20 arası, genellikle) görüş alanı içindeki tüm fagozomların ortalama oran değerlerini hesaplamak Çözelti. (Ayrıca Şekil 5A kırmızı kutuları bakın.) </li><li> Gerçek ölçülen pH karşı bu ortalama 490/440 oranı değerlerini çizilir. Tek bir grafiğe içine en az 3 bağımsız kalibrasyon birleştirin. Genellikle sigmoid denkleme, doğrusal olmayan regresyon (en iyi uyum eğrisi) gerçekleştirmek için bir istatistik veya sayısal bir yazılım paketi kullanın. Not: Örneğin, Şekil 5B&#39;de kullanılan denklem Boltzmann sigmoidal oldu [Y = Taban + ((Top-Taban)/ (1 + EXP ((V50-X) / Eğim)) Y değerleri 490/440 oranları], X pH değerleri ve Üst, Alt, V50 ve eğim parametreleri yazılım tarafından hesaplanır vardır. </li><li> PH oranı değerleri dönüştürmek için elde edilen denklemi kullanın. Not: Örneğin, Şekil 5B&#39;de, sodyum azid mevcudiyetinde kalibrasyon eğrisi için elde edilen denklem şöyledir 490/440 oranı = 1,103 + [(2,89-1,103) / (1 ​​+ EXP ((6,993 pH) /0.9291)] . pH Çözme aşağıdaki denklemi sağlar: pH = 6,993-0,9291 * [LN ((1,178 / (Oran-1,103)) - 1))]. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Yeung, T., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+signaling+and+the+modulation+of+surface+charge+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis.</a> Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Fairn, G. D., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+nascent+phagosomes+mature+to+become+phagolysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes.</a> Trends Immunol. 33 (8), 397-405 (2012).</li>
<li>Nunes, P., Demaurex, N., Dinauer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+NADPH+oxidase+and+associated+ion+fluxes+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Regulation of the NADPH oxidase and associated ion fluxes during phagocytosis.</a> Traffic. 14 (11), 1118-1131 (2013).</li>
<li>Binder, B., Holzhutter, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hypothetical+model+of+cargo-selective+rab+recruitment+during+organelle+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation.</a> Cell Biochem Biophys. 63 (1), 59-71 (2012).</li>
<li>Hurtado-Lorenzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V-ATPase+interacts+with+ARNO+and+Arf6+in+early+endosomes+and+regulates+the+protein+degradative+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">V-ATPase interacts with ARNO and Arf6 in early endosomes and regulates the protein degradative pathway.</a> Nat Cell Biol. 8 (2), 124-136 (2006).</li>
<li>Weisz, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidification+and+protein+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Acidification and protein traffic.</a> Int Rev Cytol. 226, 259-319 (2003).</li>
<li>Huynh, K. K., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+vacuolar+pH+and+its+modulation+by+some+microbial+species%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).</li>
<li>De Vito, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sodium%2Fhydrogen+exchanger%3A+a+possible+mediator+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity.</a> Cell Immunol. 240 (2), 69-85 (2006).</li>
<li>Moreland, J. G., Davis, A. P., Bailey, G., Nauseef, W. M., Lamb, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anion+channels%2C+including+ClC-3%2C+are+required+for+normal+neutrophil+oxidative+function%2C+phagocytosis%2C+and+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Anion channels, including ClC-3, are required for normal neutrophil oxidative function, phagocytosis, and transendothelial migration.</a> J Biol Chem. 281 (18), 12277-12288 (2006).</li>
<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+reactions+and+microbial+killing+in+the+neutrophil+phagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome.</a> Antioxid Redox Signal. 18 (6), 642-660 (2013).</li>
<li>Seredenina, T., Demaurex, N., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-Gated+Proton+Channels+as+Novel+Drug+Targets%3A+From+NADPH+Oxidase+Regulation+to+Sperm+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Voltage-Gated Proton Channels as Novel Drug Targets: From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology.</a> Antioxid Redox Signal. , (2014).</li>
<li>Kotsias, F., Hoffmann, E., Amigorena, S., Savina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+production+in+the+phagosome%3A+impact+on+antigen+presentation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species production in the phagosome: impact on antigen presentation in dendritic cells.</a> Antioxid Redox Signal. 18 (6), 714-729 (2013).</li>
<li>Grimm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-+and+macrophage-targeted+NADPH+oxidase+mediates+antifungal+host+defense+and+regulation+of+acute+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte- and macrophage-targeted NADPH oxidase mediates antifungal host defense and regulation of acute inflammation in mice.</a> J Immunol. 190 (8), 4175-4184 (2013).</li>
<li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).</li>
<li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.%22%5BJournal%5D)">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J Cell Sci.. 116 (Pt 16), 3387-3397 (2003).</li>
<li>Ramsey, I. S., Moran, M. M., Chong, J. A., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+voltage-gated+proton-selective+channel+lacking+the+pore+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain.</a> Nature. 440 (7088), 1213-1216 (2006).</li>
<li>El Chemaly, A., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+Hv1+proton+channels+regulate+the+ionic+and+redox+homeostasis+of+phagosomes%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Do Hv1 proton channels regulate the ionic and redox homeostasis of phagosomes?</a> Mol Cell Endocrinol. 353 (1-2), 82-87 (2012).</li>
<li>El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hv1+proton+channels+differentially+regulate+the+pH+of+neutrophil+and+macrophage+phagosomes+by+sustaining+the+production+of+phagosomal+ROS+that+inhibit+the+delivery+of+vacuolar+ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases.</a> J Leukoc Biol. , (2014).</li>
<li>Decoursey, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+proton+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated proton channels.</a> Compr Physiol. 2 (2), 1355-1385 (2012).</li>
<li>Ramsey, I. S., Ruchti, E., Kaczmarek, J. S., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hv1+proton+channels+are+required+for+high-level+NADPH+oxidase-dependent+superoxide+production+during+the+phagocyte+respiratory+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hv1 proton channels are required for high-level NADPH oxidase-dependent superoxide production during the phagocyte respiratory burst.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7642-7647 (2009).</li>
<li>Sturgill-Koszycki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+acidification+in+Mycobacterium+phagosomes+produced+by+exclusion+of+the+vesicular+proton-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase.</a> Science. 263 (5147), 678-681 (1994).</li>
<li>Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulent+and+avirulent+strains+of+Francisella+tularensis+prevent+acidification+and+maturation+of+their+phagosomes+and+escape+into+the+cytoplasm+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages.</a> Infect Immun. 72 (6), 3204-3217 (2004).</li>
<li>Alpuche-Aranda, C. M., Swanson, J. A., Loomis, W. P., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+activates+virulence+gene+transcription+within+acidified+macrophage+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (21), 10079-10083 (1992).</li>
<li>Lukacs, G. L., Rotstein, O. D., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+the+phagosomal+pH+in+macrophages.+In+situ+assessment+of+vacuolar+H%28%2B%29-ATPase+activity%2C+counterion+conductance%2C+and+H%2B+%27leak%27%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Determinants of the phagosomal pH in macrophages. In situ assessment of vacuolar H(+)-ATPase activity, counterion conductance, and H+ 'leak'.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24540-24548 (1991).</li>
<li>Watanabe, K., Kagaya, K., Yamada, T., Fukazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+candidacidal+activity+in+macrophages+activated+by+recombinant+gamma+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Mechanism for candidacidal activity in macrophages activated by recombinant gamma interferon.</a> Infect Immun. 59 (2), 521-528 (1991).</li>
<li>Ip, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+phagosome+acidification+are+required+for+pathogen+processing+and+MyD88-dependent+responses+to+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and phagosome acidification are required for pathogen processing and MyD88-dependent responses to Staphylococcus aureus.</a> J Immunol. 184 (12), 7071-7081 (2010).</li>
<li>Clarke, M., Maddera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocyte+meets+prey%3A+uptake%2C+internalization%2C+and+killing+of+bacteria+by+Dictyostelium+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocyte meets prey: uptake, internalization, and killing of bacteria by Dictyostelium amoebae.</a> Eur J Cell Biol. 85 (9-10), 1001-1010 (2006).</li>
<li>Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+the+phagosomal+pH+in+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Determinants of the phagosomal pH in neutrophils.</a> J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).</li>
<li>Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+burst+of+phagocytic+cells+is+associated+with+a+rise+in+vacuolar+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH.</a> Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).</li>
<li>Savina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX2+controls+phagosomal+pH+to+regulate+antigen+processing+during+crosspresentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells.</a> Cell. 126 (1), 205-218 (2006).</li>
<li>Rybicka, J. M., Balce, D. R., Chaudhuri, S., Allan, E. R., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomal+proteolysis+in+dendritic+cells+is+modulated+by+NADPH+oxidase+in+a+pH-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner.</a> EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).</li>
<li>Mantegazza, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+controls+phagosomal+pH+and+antigen+cross-presentation+in+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells.</a> Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).</li>
<li>Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-Interferon-inducible+lysosomal+thiol+reductase+%28GILT%29+maintains+phagosomal+proteolysis+in+alternatively+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages.</a> J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).</li>
<li>Sanjurjo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scavenger+protein+apoptosis+inhibitor+of+macrophages+%28AIM%29+potentiates+the+antimicrobial+response+against+Mycobacterium+tuberculosis+by+enhancing+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy.</a> PLoS One. 8 (11), e79670(2013).</li>
<li>Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Utility+of+Chloroquine+in+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Res+Opin%22%5BJournal%5D)">The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy.</a> Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).</li>
<li>Ohkuma, S., Poole, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probe+measurement+of+the+intralysosomal+pH+in+living+cells+and+the+perturbation+of+pH+by+various+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).</li>
<li>El Chemaly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSOP%2FHv1+proton+channels+sustain+calcium+entry%2C+neutrophil+migration%2C+and+superoxide+production+by+limiting+cell+depolarization+and+acidification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification.</a> J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).</li>
<li>Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HVCN1+channel+conducts+protons+into+the+phagocytic+vacuole+of+neutrophils+to+produce+a+physiologically+alkaline+pH%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH.</a> bioRxiv. , (2014).</li>
<li>Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+and+regulation+of+the+cellular+responses+to+cold+shock%3A+the+responses+in+yeast+and+mammalian+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems.</a> Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).</li>
<li>Yui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basolateral+targeting+and+microtubule-dependent+transcytosis+of+the+aquaporin-2+water+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).</li>
<li>Griffiths, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+phagosome+individuality+and+membrane+signalling+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">On phagosome individuality and membrane signalling networks.</a> Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).</li>
<li>Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+the+mitochondrial+proton+gradient+during+cytosolic+calcium+elevations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations.</a> J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Daha fazla zaman hedefleri bağlanmış bir pH duyarlı boya kullanılarak benzer bir strateji geliştirerek, ancak fagozomların bir popülasyonunun ortalama pH ölçer gibi spektroskopi ve FACS gibi alternatif yöntemler, daha zaman alıcı olmakla birlikte, mikroskopi çeşitli avantajlar sunmaktadır. İlk olarak, iç ve dış içsel bağlı değil, diğer bir deyişle, partiküllerin kolayca sırasıyla gidermek ya da dış parçacıklar etiket, örneğin tripan mavisi ya da antikorlar gibi diğer kimyasallar eklemeye gerek kalmadan bir şekilde ayırt...

Fagositoz, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin büyük parçacıkları yuttuğu, tek hücreli organizmaların yeme mekanizmasından evrimleşen ve bir hedefe bağlanmayı, onu bir zarla sarmayı ve sitozol içinde fagozom adı verilen bir vakuol oluşturmak için zarı sıkıştırmayı içeren süreç. Fagozomal zar, plazma zarından türetilirken, aktif protein ve lipit ayırmanın yanı sıra fagozom oluşumu sırasında endomembranlarla füzyon, fagozomu, yutulan materyalin öldürülmesine, nötralizasyonuna ve parçalanmasına izin veren parçalayıcı özelliklere sahip hücre içinde ayrı bir organele dönüştürür1-3. Fagozomal olgunlaşma olarak adlandırılan bu süreç, elektronları güçlü oksidan O2- ve türevi reaktif oksijen türlerini (ROS) üreten fagozomlara aktaran nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) oksidaz dahil olmak üzere bir dizi proteolitik ve mikrobisidal enzimin verilmesine dayanır 2,4. 
Fagozomların lümen pH'ı, fagozom işlevi için gerekli olan çeşitli olaylar üzerinde derin bir etkiye sahiptir. Birincisi, pH genel olarak endomembran kaçakçılığını etkiler, çünkü transmembran kaçakçılık düzenleyicilerinin pH'a bağlı konformasyonel değişiklikleri, Arfs, Rabs ve veziküler kaplama proteinleri gibi kaçakçılık belirleyicilerinin alımını değiştirir ve bu da hangi veziküllerin fagozomlarla kaynaşabileceğini tanımlar 5-8. İkincisi, fagozomal lümenin iyonik bileşimi de fagozomlar olgunlaştıkça dönüştürülür ve fagositik fonksiyonu destekleyen Na+/H+ değiştirici veya ClC ailesi Cl-/H+ antiporterleri gibi bazı iyon taşıyıcıları H+ translokasyonuna dayanır 9,10. Benzer şekilde, ROS üretimi fagozomal pH ile yakından bağlantılıdır. ROS ve toksik oksidan yan ürünleri, nötrofiller 4,11,12'de fagozomal öldürme için çok önemli olarak kabul edilmiştir ve makrofajlar, dendritik hücreler (DC'ler) ve amip 13-16 dahil olmak üzere diğer fagositlerde kritik roller oynadığı gösterilmiştir. NADPH oksidaz, NADPH tüketilirken sitozolde H+ salgılayan ve aksi takdirde enzim 17-21'in kendi kendini inhibisyonuna yol açacak büyük depolarizasyonu hafifletmek için, taşınan elektronların yanı sıra H+'nın eşlik eden HVCN1 kanallarından fagozomal lümene eşzamanlı transferini gerektiren elektrojenik bir enzimdir. Son olarak, birkaç proteolitik enzim farklı pH'ta optimal aktiviteye sahiptir, bu nedenle zamana bağlı fagozomal pH değişiklikleri hangi enzimlerin ne zaman aktif olduğunu etkileyebilir. Fagozomal pH'ın önemi, fagozomal pH 22-24'ü değiştirerek fagositik öldürmeyi en azından kısmen bozan Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis ve Salmonella typherium gibi organizmalar tarafından vurgulanmaktadır.
Memelilerde ana fagositler nötrofiller, makrofajlar ve dendritik hücrelerdir ve hücre tipine bağlı olarak, zamana bağlı fagozomal pH değişiklikleri büyük ölçüde değişebilir ve farklı roller oynuyor gibi görünebilir. Makrofajlarda, ATP'ye bağımlı proton pompası vakuolar ATPaz'ın (V-ATPaz) aracılık ettiği güçlü ve hızlı bir asitleşme, 25-27'yi öldürmeye aracılık eden anahtar faktörlerden biridir ve fagositozu bir yeme mekanizması olarak kullanan amiplerde bulunan mekanizmalara benzer 28. Bu hücrelerde asidik proteazların aktivasyonunun önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Buna karşılık, nötrofil öldürme, miyeloperoksidaz (MPO)11 tarafından üretilen HOCl'nin yanı sıra ROS'a daha fazla dayanır ve pH, ilk 30 dakika boyunca nötr veya alkali kalır, ancak daha sonra asitleşir 29,30. Nötr pH'ın, bazı katepsinler gibi oksidatif proteazların aktivitesini desteklediği öne sürülmüştür. DC'lerde fagozomal pH tartışmalıdır, bazıları asitlenme bildirirken diğerleri nötr veya alkali pH 31,32'dir, ancak ROS ve pH, bu hücrelerin ana işlevlerinden biri olan T hücrelerine antijen sunma yeteneğini derinden etkileyebilir 33. 
Daha da önemlisi, hormonlar, kemokinler ve sitokinler, olgunlaşmayı ve fagosit davranışında değişiklikleri indükleyen ve dolayısıyla fagozomal pH 34,35'i etkileyen sinyal olayları üretebilir. Benzer şekilde, ilaçlar, örneğin anti-kanser tedavileri için de düşünülen antimalaryal klorokin 36, fagozomal pH'ı ve dolayısıyla bağışıklık sonuçlarını etkileyebilir. Bu nedenle, çeşitli hücre biyologları, immünologlar, mikrobiyologlar ve ilaç geliştiricileri, belirli bir genetik bozulmanın, biyoaktif bileşiğin veya mikroorganizmanın doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık tepkileri üzerindeki etkilerinin altında yatan mekanizmaları anlamaya çalışırken fagozomal pH'ın ölçülmesiyle ilgilenebilirler. 
Burada, nötrofil fagozomal pH 19'un düzenlenmesinde HVCN1 kanalının önemini göstermemize izin veren nötrofillerde fagozomal pH'ı ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz. Yöntem, 535 nm'de floresan emisyonu 490 nm'de uyarıldığında pH'a duyarlı olan ancak 440 nm'de değil olan floresein izotiyosiyanatın (FITC) oransal özelliğine dayanmaktadır 37. Bu boya kimyasal olarak bir hedefe, bu durumda zimozana bağlandığında, hücrelerin fagositoz olurken görüntülendiği ve fagozomal pH değişikliklerinin fagozom olgunlaştıkça gerçek zamanlı olarak ölçüldüğü geniş alanlı floresan mikroskobu kullanılarak takip edilebilir. Gerçek pH daha sonra, fagosite uğramış hücrelerin, fagozomlar içindeki pH'ın harici çözelti ile hızlı bir şekilde dengelenmesine izin veren nigerisin ve monensin iyonoforlarını içeren farklı pH çözeltilerine maruz bırakıldığı bir kalibrasyon deneyi yapılarak toplanır. Oran değerleri daha sonra çözeltilerin bilinen pH değeri ile karşılaştırılır, doğrusal olmayan regresyon ile bir kalibrasyon eğrisi oluşturulur ve elde edilen denklem oran değerinden pH'ı hesaplamak için kullanılır.

<table><tbody><tr><td>Zymosan A tozu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4250</td><td>Çeşitli sağlayıcılar mevcuttur</td></tr><tr><td>Floresein izotiyosiyanat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>Çeşitli sağlayıcılar mevcuttur</td></tr><tr><td>Anti-zimosan antikoru (Zymosan A Bioparticles opsonizing reaktifi)</td> <td>Life Technologies</td><td>Z2850</td><td>Sigma-Aldrich O6637 eşdeğer bir üründür. Alternatif olarak,% 25 serum opsonize edici bir reaktif olarak kullanılabilir.</td></tr><tr><td>4-Aminobenzoik hidrazid (4-ABH)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-204107</td><td>Toksik, eldiven kullanın, çeşitli sağlayıcılar mevcuttur</td></tr><tr><td>Difenileniodonyum klorür (DPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2926</td><td>Toksik, eldiven kullanın, çeşitli sağlayıcılar mevcuttur</td></tr><tr><td>Concanamicin A (ConcA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27689</td><td>Toksik, eldiven kullanın, çeşitli sağlayıcılar var</td></tr><tr><td>Nijerya</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>Toksik, eldiven kullanın, çeşitli sağlayıcılar var</td></tr><tr><td>Monensin</td><td></td><td>Enzo ALX-380-026-G001</td><td>Toksik, eldiven kullanın, çeşitli sağlayıcılar var</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14200-075</td><td>Toksik, eldiven kullanın, çeşitli sağlayıcılar var</td></tr><tr><td>Hank'in denge tuzu çözeltisi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14025092</td><td>Ringer'ın dengeli tuz çözeltisi veya diğer berrak fizyolojik tamponlar olabilir ikame edilebilir.</td></tr><tr><td>Sodyum karbonat (Na2CO3)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795</td><td>Çeşitli sağlayıcılar mevcuttur</td></tr><tr><td>2- (N-Morfolino) etansülfonik asit (MES)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671 ve nbsp;</td><td>Çeşitli sağlayıcılar var</td></tr><tr><td>4- (2-Hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit (HEPES)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Çeşitli sağlayıcılar mevcuttur</td></tr><tr><td>N-Metil-D-glukamin (NMDG)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004 & nbsp;</td><td>Çeşitli sağlayıcılar var</td></tr><tr><td>Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N ve prime;, N ve prime; -tetraasetik asit (EGTA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>3777</td><td>Çeşitli sağlayıcılar mevcuttur</td></tr><tr><td>Tris (hidroksimetil) aminometan (Tris)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503 & nbsp;</td><td>Çeşitli sağlayıcılar var</td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Çeşitli sağlayıcılar mevcuttur</td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Çeşitli sağlayıcılar mevcuttur</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Çeşitli sağlayıcılar mevcuttur</td></tr><tr><td>Mutlak Etanol (EtOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td>Çeşitli sağlayıcılar mevcuttur</td></tr><tr><td>Cam tabanlı 35 mm petri kapları (Florodish)</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>Ibidi ve mikro;-şeffaf tabaklar veya uygun görüntüleme odalarına sahip lameller desteklenebilir</td></tr><tr><td>Sonicating su banyosu</td><td>O. Kleiner AG</td><td></td><td>Bunun yerine bir sonikatör kullanılabilir, çeşitli alet sağlayıcıları mevcuttur</td></tr><tr><td>Heamocytometer</td><td>Marienfeld GmbH</td><td></td><td>Çeşitli alet sağlayıcıları mevcuttur</td></tr><tr><td>Geniş alan canlı görüntüleme mikroskobu</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Çeşitli cihaz sağlayıcıları mevcuttur, ancak mikroskop 440/535 ve 490/535 uyarma/emisyona duyarlı görüntüleme yapabilmelidir. Parlak alan özelliklerine sahip dönen disk konfokal kurulumları ikame edilebilir, ancak zymosan daha sık odak dışına çıkma eğilimindedir. &nbsp;</td></tr><tr><td>Peristaltik pompa (Dynamax RP-1)</td><td>Rainin</td><td></td><td>Çeşitli cihaz sağlayıcıları mevcuttur</td></tr><tr><td>pH metre</td><td>Schott Gerate GmbH</td><td></td><td>Çeşitli cihaz sağlayıcıları mevcuttur</td></tr><tr><td>Manuel</td><td>Sayaç Milian SA</td><td></td><td>Çeşitli cihaz sağlayıcıları mevcuttur</td></tr></tbody></table>

oranlı metrik floresan mikroskopi fagosom ph ölçümü

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Fagositoz doğuştan gelen bağışıklık hücreleri öldürmek veya etkisiz yutulur malzeme veya antijen olarak sunmak ve adaptif immün yanıtları başlatmak için bakteri, apoptotik hücreler veya diğer yabancı partikülleri yutmak hangi aracılığıyla temel süreçtir. Fagozomların pH endomembranes ve proteolitik enzimler, fagositik vakuol bir parçalayıcı organele içine olgun izin olaylar aktivasyonu ile fizyon ya da füzyon düzenleyen kritik bir parametredir. Buna ek olarak, H + translokasyon diğer konakçı dokulara etkili bir öldürme için önemli ve sinyal olan reaktif oksijen türlerinin (ROS), yüksek seviyelerinin üretimi için gereklidir. Birçok hücre içi patojenler, phagosomal asitlenmesine sınırlayıcı fagosom biyoloji pH önemini vurgulayarak fagositik öldürmeyi yıkmak. Burada floresein izotiosiyanat (FITC) kullanılarak nötrofillerde phagosomal pH ölçmek için bir yöntem tarif rasyometrik fagositik targ olarak zimosan -etiketliets ve canlı hücre görüntüleme. Deney 490 nm&#39;de uyarıldığında, ancak tek bir boyanın, yerine mutlak floresandan daha, bir pH bağımlı oranının sayılmasına olanak tanıyan, 440 nm&#39;de uyarıldı olmadığında asidik pH ile söndürülür FITC, floresan özelliklerine dayanır. In situ boya kalibrasyonu ve gerçek pH değerlerine oranı dönüştürme gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol, aynı zamanda temin edilmektedir. Onlar böyle ağartma olarak tedirginlikler daha az duyarlı olarak tek boya rasyometrik yöntemleri genellikle tek dalga boyu veya çift boya sözde rasyometrik protokollere üstün kabul edilir, ölçülen sinyali tahrif değişiklikleri, lazer varyasyonları ve düzensiz etiketleme, odak. Bu yöntem, kolaylıkla diğer fagositik hücre tiplerinde pH ölçmek için modifiye edilebilir ve zymosan atıl tanelerden canlı mikroorganizmalara, diğer herhangi bir amin içeren bir parçacık ile ikame edilmiş olabilir. Son olarak, bu yöntem, farklı pH aralıklarında ya da diğer phagosom karşı duyarlı olan diğer floresan probları faydalanmak için adapte edilebiliral faaliyetleri, bu fagozomların fonksiyonel görüntüleme için genel bir protokol yaparak.

Aşağıda bir deney için temsili sonuçlar olduğu takdirde burada yabani tip ya da kemik-iliğinden izole edilmiş primer fare nötrofil phagosomal pH Hvcn1 - / - farenin karşılaştırıldı. Başarılı bir deneme için, daha sonra görüntü analizi sırasında segmente daha zor olacaktır çok fagozomların, kaçınarak, time-lapse film tüm süresince görüş alanı içinde yeterli fagozomların elde etmek önemlidir. Şekil 1&#39;de görüldüğü gibi İyi ve kötü confluencies örnekleri. Zamana bağlı ve a...

Fagozomal pH, fagozom olgunlaşmasını, oksidan üretimini, fagozomal öldürmeyi ve antijen sunumunu etkiler. Burada, floresan mikroskobu kullanarak canlı fagositlerdeki bireysel fagozomlardaki zaman-seyri ve son nokta pH değişikliklerini ölçmek için bir oransal yöntemi açıklıyoruz.

Oranlı metrik Floresan Mikroskopi fagosom pH ölçümü

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Bu deney setinin genel amacı, rasyometrik floresan mikroskopi kullanarak canlı hücrelerde fagosomal pH'ı ölçmektir. Bu yöntem, patojen etkileşimlerindeki temel moleküllerin belirlenmesi veya genetik bozulmaların ya da ilaçların fagositoz üzerindeki etkisi gibi fagosit biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, FACS veya spektroskopi gibi popülasyon tabanlı yöntemlerin aksine, partikül bağlanma migrasyonundaki değişiklikler veya bireysel fagosomların heterojenliği gibi etkilerin tespit edilebilmesidir.Bu tekniğin etkileri, patojenik kimyasal organizmalara karşı geliştirdiğimiz tedavilere kadar uzanmaktadır; çünkü bu mikroorganizmaların çoğu, fagozomlar içindeki yıkımdan kaçınmak için fagozomal pH değerini değiştirebilmektedir. Bu prosedüre başlamak için, 10 mL steril PBS içine 20 mg kurutulmuş Xan ekleyin, vorteksleyin ve kaynayan su banyosunda 10 dakika boyunca ısıtın. Ardından soğutun ve 2000 Gs hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından, süpernatantı uzaklaştırın ve Xan'ı bir mililitre PBS içinde yeniden süspanse edin. Bir su banyosunda 10 dakika boyunca sonikasyon uygulayın. Sonikasyon sonrası, yeniden süspanse edilen Xan'dan 500 mikrolitreyi iki adet 1,5 mililitrelik tüpe aktarın ve bunları 11.000 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Yıkama işlemini 500 µL PBS ile tekrarlayın. Ardından Xan'ı, pH 9.3 değerine sahip taze hazırlanmış 0,1 M sodyum karbonat çözeltisinin 500 µL'si ile iki kez yıkayın ve son yıkamanın ardından 490 µL sodyum karbonat çözeltisi içerisinde yeniden süspanse edin. Sonrasında, 10 mg/mL konsantrasyonunda DMSO içinde çözünmüş 10 µL FZ'yi Xan'a ekleyip vorteksleyin.Folyo ile kapatın ve oda sıcaklığında dört saat boyunca çalkalayarak inkübe edin. Bağlanmamış kısımları uzaklaştırmak için önce, yıkama adımları arasında sonikasyon uygulayarak, 0,5 mililitre DMSO artı 150 mikrolitre PBS ile yıkayın. Ardından 0,5 mililitre DMSO artı 300 mikrolitre PBS ile yıkayın, sonra 0,5 mililitre DMSO artı 450 mikrolitre PBS ile yıkayın ve son olarak sadece PBS ile yıkayın. Bundan sonra, 500 mikrolitre PBS'e bir mikrolitre Xan ekleyin ve vorteksleyin.Ardından, seyreltilmiş xma kumundan 10 µL'yi, hemositometre haznesinin lamel ile birleştiği kenara ekleyin; hemositometreyi 20x objektif donanımlı bir parlak alan mikroskobuna yerleştirin. 16 kare içeren sol üst köşeye odaklanın ve bu alandaki tüm xma kum partiküllerini sayın. El sayacı kullanarak işlemi sağ alt köşede tekrarlayın.Ardından, Xan konsantrasyonunu bu denklemle hesaplayın. Sonrasında, işaretlenmiş Xan'ı 1/100 dilüsyon oranında rabid anti Xan antikoru ile opsonize etmek için vorteksleyin ve örneği 37 °C'lik bir su banyosunda bir saat boyunca inkübe edin. Takiben, hemositometre kullanarak Xan parçacıklarını sayın ve ardından 100 × 10⁶ parçacık/mL olacak şekilde dilüye edin.Primer fare nötrofilleri izole edildikten sonra, 35 mm'lik cam tabanlı bir kaba iki x 10⁵ nötrofil ekleyin. Ardından, hücrelerin yapışmasını sağlamak için 50 µL besiyeri ekleyerek damlayı yayın ve 37 °C'de beş dakika inkübe edin. Sonrasında, miyeloperoksidaz inhibitörü içeren 37 °C'ye ısıtılmış 1 mL HBSS ekleyin.Kabı, 37 °C ısıtma sistemi ve 40x yağlı objektif ile donatılmış geniş alan floresan mikroskobuna yerleştirin. Hücrelerin ve ekipmanın dengelenmesi için görüntüleme yapmadan 10 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, her 30 saniyede bir 440 nm veya 490 nm eksitasyon ve 535 nm emisyon ile parlak alan transmisyon görüntüsü elde etmek için mikroskop ayarlarını düzenleyin.İki dakika sonra, kabın merkezine 10 kat 10 şeklinde altı adet fitzy zy kum ekleyin ve görüntülemeye 30 dakika boyunca devam edin. 30 dakika sonra, zaman atlamalı çekimi durdurun ve bir zamanlayıcı başlatın. Beş dakika içinde diğer vaga bölgelerini görüntülemek için sahneyi hareket ettirin ve farklı görüş alanlarından 10 veya daha fazla anlık görüntü yakalayın.Bu prosedürde, kalibrasyon çözeltilerini çözdürün ve bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın. pH değerini bir pH metre ile kontrol edin ve kaydedin. Ardından, görüntüleme öncesinde cam tabanlı kaba bir peristaltik pompa monte edin.Ardından, 30 dakikalık veri toplama süresinin sonunda canlı video mikroskopisi gerçekleştirin. Kapta bulunan çözeltiyi uzaklaştırmak için pompayı çalıştırın. Sonrasında, bir mililitre birinci kalibrasyon çözeltisi ekleyin ve pompayı durdurun.Sinyal stabilize olana kadar beş dakika bekleyin. İşlemi her bir kalibrasyon çözeltisi ile tekrarlayın. Time-lapse videolarını ve fagozom anlık görüntülerini analiz etmek için görüntüleri Image J ile açın. Hücre bulunmayan bir alana küçük bir kare ROI çizerek 490 kanalındaki arka planı çıkarın.Kare poligon seçim aracı kullanın ve ardından eklentilere (plugins) tıklayın. Sonrasında arka plan (BG) çıkarma işlemini gerçekleştirin. Düzenle (edit) seçeneğine tıklayarak aynı ROI'yi 440 kanalına yükleyin.Ardından seçimi yapın, seçimi geri yükleyin ve arka plan çıkarma işlemini tekrarlayın. Önce "process" (işlem) seçeneğine, ardından "image calculator" (görüntü hesaplayıcı) seçeneğine tıklayarak, 490 kanalının 440 kanalına bölünmesiyle elde edilen 32 bitlik bir oran görüntüsü oluşturun.Ardından, görüntü bir ve görüntü iki açılır menülerinden uygun görüntüleri seçin. İşlem açılır menüsünden divide seçeneğini belirleyin ve 32 bit result onay kutusunu işaretleyin. Daha sonra, image ve ardından up tables seçeneklerine tıklayarak renk kodlama arama tablosunu oran uyumlu bir renk kodlamasıyla değiştirin.Ardından gökkuşağı RGB'yi seçin. Sıfır ve sonsuz pikselleri temizlemek için görüntüye tıklayarak oran görüntüsü için bir eşik değeri belirleyin. Ardından ayarları yapın ve eşik değerini belirleyin.Xan kırmızı renkte görünecek şekilde kaydırma çubuklarını ayarlayın ve uygula (apply) butonuna tıklayın; "set background pixels to nan" onay kutusunun seçili olduğundan emin olun. Arka plan ve Xan sinyal değerleri çok benzer oran değerleri üreterek gürültülü bir oran görüntüsüne neden olursa, işlem (process) butonuna tıklayarak 440 kanalına küçük bir miktar arka plan ekleyin. Ardından matematik (math) sekmesine geçin.Ardından ekleme yapın ve daha temiz bir sonuç elde etmek için oran görüntüsünü yeniden oluşturun. Alternatif olarak, 440 kanalı arka plan çıkarma işlemini atlayın. Sonrasında, görüntü rengine tıklayarak bu oran yığınını bir brightfield kanalı ile çok kanallı bir kompozitte birleştirin.Ardından kanalları birleştirin. Gri kanal açılır menüsünden parlak alan (brightfield) görüntüsünü ve yeşil kanal açılır menüsünden oran (ratio) görüntüsünü seçin. Daha sonra kaynak görüntüleri koru onay kutusunu seçin.Ardından, hangi fagozomların analiz edileceğini belirlemek için parlak alan ve oran kanallarını karşılaştırarak zaman atlamalı videoları veya anlık görüntüleri tarayın, oval poligon seçim aracını kullanarak fagozomların etrafına bir ROI çizin ve analiz araçlarına tıklayarak bunları ROI yöneticisine ekleyin. Sonra ROI yöneticisinden ek seçeneğini takip edin, ardından daha fazla çoklu ölçüm seçeneğine tıklayarak ve dilim başına bir satır onay kutusundaki seçimi kaldırarak Xan yoğunluk oranlarını ölçün. Zaman atlamalı videolar için.Her bir zaman noktasını ölçmek için M tipinde bir ROI kontrolü çizerek FGA bölgelerini tek tek takip edin ve zaman içindeki yoğunluk değerlerini izlemek için gerektiğinde ROI'yi taşıyın. Ardından, floresan değerlerini pH değerlerine dönüştürmek için sonuçlar penceresindeki ölçümleri bir hesap tablosuna kopyalayın. Kalibrasyon zaman atlamalı videolarındaki fagozomlar için 490/440 oranını bir hesap tablosunda ölçtükten sonra, oran değerlerini zamana göre grafiğe dökün.Ardından, her bir pH kalibrasyon çözeltisine karşılık gelen zaman diliminin ortasındaki beş zaman noktasında, görüş alanı içindeki tüm fagozomlar için ortalama oran değerlerini hesaplayın. En az üç bağımsız kalibrasyonu tek bir grafikte birleştirerek, bu ortalama 490/440 oran değerlerini gerçek ölçülen pH değerlerine karşı grafiğe dökün. Daha sonra, oran değerlerini pH değerine dönüştürmek için bir denklem elde etmek amacıyla doğrusal olmayan bir regresyon analizi gerçekleştirin.Bu şekil, fagosomların ve yutulmuş Xan'ın nasıl ayırt edildiğini göstermektedir. Sol panel, birleştirilmiş bir brightfield görüntüsü ile 490'dan 440'a Fitz zy ve oranı göstermektedir. Sağ panel ise yalnızca brightfield görüntüsünü göstermektedir.Fagozomlar, hücrelerle birlikte yerleşmeyen veya floresansı gösterilen brightfield görüntüsünde fagozomların karakteristik özelliği olan parlak bir halkayla çevrili koyu bir merkezle eşleşmeyen dış partiküllerden ayırt edilebilir. Burada, vahşi tip ve HV CN one knockout nötrofillerin tipik zaman seyirleri yer almaktadır. Vahşi tip nötrofillerde fagozom pH'ı, erken zaman noktalarında nötr veya hafif alkalidir. Yutmayı takiben, HV CN one knockout nötrofillerin fagozomları alkali veya asidik olabilir. Hedeflerin eklenmesinden 30 ila 35 dakika sonra alınan anlık görüntüler, burada gösterilen Fitz Xan oranlarının histogramlarından büyük bir fagozom sayısı kullanılarak ortalama popülasyon pH'ının hesaplanmasına olanak tanır.Vahşi tip ve HVCN1 nakavt nötrofiller arasındaki küçük pH farklarını görebildik. Uzmanlaşıldığında, bu teknik altı saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, optimizasyon adımından başlayarak görüntüleme koşullarını optimize etmeyi hatırlamak önemlidir. İlk olarak, bu prosedürün ardından güçlü bir fagositoz sağlamak için optimizasyon adımında antikor konsantrasyonunun optimize edilmesi de yardımcı olabilir.Küçük ROS üretimi veya bakterilerin öldürülme oranının ölçülmesi gibi diğer yöntemler, fagozom gelişimi sonrası pH ile birlikte küçük ROS'un veya fagozomun bakterileri öldürme yeteneğinin değişip değişmediği gibi ek soruları yanıtlamak için uygulanabilir. Bu teknik, fagosit biyolojisi alanındaki araştırmacıların, fagositik hücrelerin yutulan materyalleri öldürme veya daha ileri bağışıklık yanıtlarını tetiklemek için işleme yeteneğini hangi faktörlerin etkilediğini keşfetmelerine yol açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, canlı hücrelerde fagozomların fizyolojik parametrelerini gerçek zamanlı olarak ölçmek için geometrik floresan mikroskopisinin nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.UNIFOR inhibitörleri ve canlı hücrelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü uygularken eldiven takmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

measuring-phagosome-ph-by-ratiometric-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, bir cam tabanlı çanağın yüzeyine tutturulmuş IgG-opsonize kırmızı kan hücrelerinin (RBC'ler) makrofaj aracılı fagositozu sırasında fagozom oluşumunun ve kapanmasının gerçek zamanlı görselleştirilmesi için yüksek çözünürlüklü bir toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu tekniğini göstermektedir. Makrofajlar, RBC'lerin etrafına psödopodia uzatır ve onları fagozomların içine sokar ve onları cam yüzeyden ayırır.

Fagozom Oluşumu ve Kapanışının TIRF Mikroskobu Tabanlı Görselleştirilmesi

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Canlı Makrofagların içinde Phagolysosome Biogenesis&#39;den Çalışması

Hücre içi pH'ı ölçmek için çeşitli yöntemler mevcuttur, ancak bunların çok azı sitoplazmik ve organel pH'ın aynı anda ölçülmesine izin verir. Burada, canlı hücrelerin oransal görüntülemesi ile sitoplazmik ve veziküler pH'ı aynı anda ölçmek için hızlı ve doğru bir metodolojiyi ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Konfokal mikroskopi kullanılarak Yaşayan hücreler içinde endositik ve Sitosolik Bölümleri eşzamanlı pH Ölçümü

Burada, florometrik bir yöntem kullanarak yapışık makrofaj hücre hattı ile floresan parçacıkların fagositozunu ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, partikül içselleştirmesinin yanı sıra ortaya çıkan aktin polimerizasyonunun yüksek verimli bir miktar tayinini kolaylaştırır.

Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

Toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak, canlı makrofajlarda eşi benzeri görülmemiş yüksek çözünürlüklü fagozom oluşumunu ve kapanışını üç boyutta görselleştirmek için bir deney düzeneği tanımlıyoruz. Fagositik kabın tabanının, uzayan psödopodların ve ayrıca fagozom kesilmesinin kesin yerinin izlenmesine izin verir.

&quot;Fagozomun Kapatma Deneyi&quot; kullanma Üç Boyutta fagozomun Formasyonu Visualize&#39;a Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM)

Bu yazıda phagosomal pH ve alan olarak rasyometrik göstergesi seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, ya da S-1 kullanılarak, insan ve fare nötrofillerin sitoplazmik pH'ını ölçmek için basit bir yöntem tarif etmektedir. Bu canlı hücre konfokal floresan mikroskop ve görüntü analizi kullanılarak elde edilir.

Nötrofil fagozomun Görüntüleme ve Sitoplazma bir oranlı metrik pH Göstergesi kullanma

pH'ya duyarlı bir florofor ile bir membran proteinin hücre dışı alanını Etiketleme, superecliptic pHluorin (SEP), hücre içi lokalizasyonu, sentezleme ve trafik saptanmasına olanak sağlamaktadır. Görüntüleme toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) proteinleri Eylül-etiketli periferal ER ve plazma membranı protein seviyelerinin ölçümü sağlar.

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Efferocytosis, apoptotik hücreler, fagositik kaldırılması homeostazı korumak için gerekli ve reseptörleri ve tanıma, engulfment ve apoptotik hücreler içselleştirilmesi için izin sinyal yollar tarafından yönetilir. Burada, biz efferocytosis miktar ve efferocytic sinyal yolları etkinlik için bir floresans mikroskobu Protokolü mevcut.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Nörodejeneratif hastalıklar düzensiz mikroglia fonksiyonları ile ilişkilidir. Bu makalede, iPSC-makrofajlar tarafından nöroblastom hücrelerinin fagositozunun in vitro bir tahlili özetlenen bir makale verilmiştir. Nicel mikroskopi okumaları hem canlı hücre zaman atlamalı görüntüleme hem de sabit hücreli yüksek içerikli görüntüleme için açıklanmıştır.

İPSC-Makrofajlar tarafından Ölü Nöroblastom Hücrelerinin Fagositozu için İn vitro Nicel Görüntüleme Tahlili

Burada sunulan, pH'a duyarlı bir floresan moleküle konjuge edilen opsonize olmayan maya (zymosan) parçacıklarının makrofaj (MΦ) fagositozunun mezenkimal kök hücre (MSC) aracılı regülasyonunun dinamik görüntülerini ölçmek ve üretmek için bir protokol sunulmaktadır.

Makrofaj Fagositozun Mezenkimal Kök Hücre Regülasyonu; Nicellik ve Görüntüleme

Canlı hücrelerdeki bireysel makropinozomlarda pH, oksidatif olaylar ve protein sindirimi ölçümü için protokolleri açıklıyoruz. Çift florofor oranmetrik mikroskopiye ve nüfusa dayalı tekniklere göre sunduğu avantajlara vurgu yapılır.

Çift Florofor Oranımetrik Mikroskopi kullanılarak Makropinozomların pH, Redoks Kimyaları ve Bozunabilir Kapasitesinin Ölçülmesi

Öğrenin, oranlı metrik floresan mikroskopi ile canlı fagositlerde fagosomal pH ölçümü yapmayı. Bu yöntem, fagozom olgunlaşmasını ve patojen etkileşimlerini anlamak için gerçek zamanlı pH değişimlerini izlemenizi sağlar.

Oranlı metrik Floresan Mikroskopi fagosom pH ölçümü

Daha fazla video keşfet