Oranlı metrik Floresan Mikroskopi fagosom pH ölçümü

Bu deney setinin genel amacı, oran metrik floresan mikroskobu kullanarak canlı hücrelerde fakozomal pH'ı ölçmektir. Bu yöntem, fagosit biyolojisi alanında, patojen etkileşimlerindeki anahtar moleküllerin tanımlanması veya genetik bozulmanın veya ilaçların fagositoz üzerindeki etkisi gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, parçacıkların bağlanma göçündeki değişiklikler veya bireysel fagozomların heterojenliği gibi gerçekler veya spektroskopi etkileri gibi popülasyon temelli yöntemlerin aksine, tespit edilebilmesidir.

Bu tekniğin anlamı, patojenik kimyasal organizmalara karşı tedavilerimize kadar uzanır, çünkü bu mikroorganizmaların çoğu, fagozomlar içinde dikkatin dağılmasını önlemek için fragoso pH'ını değiştirebilir. Bu işleme başlamak için, 10 mililitre steril PBS girdabına 20 miligram kurutulmuş Xan ekleyin ve 10 dakika kaynar su banyosunda ısıtın. Daha sonra soğutun ve 2000 Gs'de beş dakika santrifüjleyin.

Bundan sonra, süpernatanı çıkarın ve Xan'ı bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Bir su banyosunda 10 dakika boyunca sonikleştirin. Sonicate daha sonra yeniden askıya alınan Xan'ın 500 mikrolitresini iki adet 1.5 mililitrelik tüpe aktarın ve beş dakika boyunca 11.000 G'de santrifüjleyin.

Yıkamayı 500 mikrolitre PBS ile tekrarlayın. Daha sonra Xan'ı pH 9.3'te 500 mikrolitre taze hazırlanmış 0.1 molar sodyum karbonat çözeltisinde iki kez yıkayın ve son yıkamadan sonra 490 mikrolitre sodyum karbonat çözeltisinde YENİDEN SÜSPANSE EDİN. Daha sonra, Xan girdabına mililitre başına 10 miligramda DMSO'da çözülmüş 10 mikrolitre FZ ekleyin.

Folyo ile örtün ve oda sıcaklığında dört saat boyunca çalkalama ile inkübe edin Bağlanmamış gözü çıkarmak için önce yıkama adımları arasındaki sonikasyon da dahil olmak üzere 0,5 mililitre DMSO artı 150 mikrolitre PBS ile yıkayın. Daha sonra 0,5 mililitre DMSO artı 300 mikrolitre PBS ile yıkayın, ardından 0,5 mililitre DMSO artı 450 mikrolitre PBS ve ardından tek başına PBS ile yıkayın. Bundan sonra, 500 mikrolitre PBS ve girdaba bir mikrolitre Xan ekleyin.

Daha sonra, hemo sitometre odasının kapak kayması ile buluştuğu kenarına 10 mikrolitre seyreltilmiş xma kumu ekleyin, hemo sitometreyi 20 x objektif ile donatılmış bir parlak alan mikroskobuna monte edin. 16 kare içeren sol üst köşeye odaklanın ve bu alandaki tüm Noel kumu parçacıklarını sayın. Bir el uyarı sinyali sayacı kullanarak, sağ alt köşedeki işlemi tekrarlayın.

Daha sonra bu denklemi kullanarak Xan konsantrasyonunu hesaplayın. Daha sonra, etiketli Xan'ı kuduz anti Xan antikoru ile bir ila 100 seyreltme girdabında opsonize edin ve numuneyi 37 santigrat derece su banyosunda bir saat inkübe edin. Daha sonra, bir hemo sitometre kullanarak xmas kumunu sayın, daha sonra mililitre başına 10 ila altıncı parçacık olmak üzere 100 kez seyreltin.

Birincil fare nötrofillerini izole ettikten sonra, 35 milimetrelik bir cam tabanlı kabın ortasına iki kez 10 ila beşte bir nötrofil ekleyin. Daha sonra 50 mikrolitre ortam ekleyerek damlayı yayın ve hücrelerin yapışmasını sağlamak için beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, miyelo peroksidaz inhibitörü içeren 37 santigrat dereceye kadar bir mililitre HBSS ılık ekleyin.

Çanağı, 37 santigrat derece ısıtma sistemi ve 40 x yağ objektifi ile donatılmış geniş alanlı bir floresan mikroskobuna monte edin. Hücrelerin ve ekipmanın dengelenmesine izin vermek için hücreleri görüntüleme olmadan 10 dakika inkübe edin. Ardından, her 30 saniyede bir 440 nanometre veya 490 nanometre uyarma ve 535 nanometre emisyon ile parlak alan iletim görüntüsü elde etmek için mikroskop ayarlarını yapın.

İki dakika sonra, tabağın ortasına altı ized fitzy zy kumuna 10 kez 10 ekleyin ve 30 dakika boyunca görüntülemeye devam edin. 30 dakika sonra, hızlandırılmış çekimi durdurun ve bir zamanlayıcı başlatın. Sahneyi hareket ettirin ve beş dakika içinde diğer vaga bölgelerini görüntülemek için farklı görüş alanlarında 10 veya daha fazla anlık görüntü yakalayın.

Bu prosedürde, kalibrasyon çözeltilerini çözün ve bir su banyosunda 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. PH'ı bir pH metre ile kontrol edin ve kaydedin. Ardından, görüntü almadan önce cam alt tabağa bir peristaltik pompa monte edin.

Ardından, 30 dakikalık çekim süresinin sonunda canlı video mikroskobu gerçekleştirin. Tabaktaki çözeltiyi çıkarmak için pompayı açın. Ardından, ilk kalibrasyon çözeltisinden bir mililitre ekleyin ve pompayı durdurun.

Sinyal stabilize olana kadar beş dakika bekleyin. Prosedürü her kalibrasyon çözeltisi ile tekrarlayın. Hızlandırılmış filmleri ve fagozom anlık görüntülerini analiz etmek için, görüntüleri J ile açın. Hücresiz bir alanda küçük bir kare ROI çizerek 490 kanalındaki arka planı çıkarın.

Kare çokgen seçim aracını kullanma ve eklentileri tıklama. Ardından KŞ çıkarma. Düzenle'yi tıklayarak aynı YG'yi 440 kanalına yükleyin.

Ardından seçim ve ardından seçimi geri yükleyin ve arka plan çıkarma prosedürünü tekrarlayın. İlk tıklama işlemi ile 490 kanalın 440 kanalına bölünen 32 bit oranlı bir görüntüsünü yapın. Sonra görüntü hesap makinesi.

Bundan sonra, birinci resim ve ikinci resim açılır menülerinde uygun görüntüleri seçin. İşlem açılır menüsünde böl'ü seçin ve 32 bit sonuç onay kutusunu işaretleyin. Bundan sonra, görüntüye ve ardından tablolara tıklayarak renk kodlaması arama tablosunu oran uyumlu bir renk kodlamasına değiştirin.

Sonra gökkuşağı RGB. Görüntüyü tıklatarak sıfır ve sonsuz pikselleri ortadan kaldırmak için oran görüntüsü için bir eşik ayarlayın. Ardından eşiği ve ardından ayarlayın.

Kaydırma çubuklarını, Xan kırmızı görünecek şekilde ayarlayın ve uygula'ya tıklayın ve arka plan piksellerini nan olarak ayarla onay kutusunun seçili olduğundan emin olun. Arka plan ve Xan sinyal değerleri, gürültülü bir oran görüntüsüne neden olan çok benzer oran değerleri üretiyorsa, işleme tıklayarak 440 kanalına az miktarda arka plan ekleyin. Sonra matematik.

Ardından ekleyin, ardından daha temiz bir sonuç elde etmek için oran görüntüsünü yeniden oluşturun. Alternatif olarak, 440 kanal arka plan çıkarmasını atlayın. Ardından, görüntü rengini tıklatarak bu oran yığınını bir parlak alan kanalıyla çok kanallı bir bileşik halinde birleştirin.

Ardından kanalları birleştirin. Gri kanal açılır menüsünde parlak alan görüntüsünü ve yeşil kanal açılır menüsünde oran görüntüsünü seçin. Ardından kaynak görüntüleri sakla onay kutusunu seçin.

Daha sonra, hangi fagozomların analiz edileceğini belirlemek için parlak alan ve oran kanallarını karşılaştıran hızlandırılmış filmleri veya anlık görüntüleri tarayın, oval poligon seçim aracını kullanarak fagozomların etrafına bir ROI çizin ve analiz araçlarına tıklayarak bunları ROI yöneticisine ekleyin. Ardından ROI yöneticisi, ardından daha fazla çoklu ölçüme tıklayarak Xan yoğunluk oranlarını ölçün ve dilim başına bir satır onay kutusunun seçimini kaldırın. Zaman atlamalı filmler için.

Her bir zaman noktasını ölçmek için bir ROI tipi kontrol M çizerek ve zaman içindeki yoğunluk değerlerini izlemek için gerektiğinde ROI'yi hareket ettirerek FGA bölgelerini birer birer izleyin. Ardından, floresanı pH değerlerine dönüştürmek için sonuçlar penceresinden ölçümleri bir elektronik tabloya kopyalayın. Bir elektronik tablodaki kalibrasyon zaman atlamalı filmlerinde fagozomlar için 490 ila 440 oranını ölçtükten sonra, oran değerlerini zaman içinde çizin.

Ardından, her bir pH kalibrasyon çözeltisine karşılık gelen zaman periyodunun ortasındaki beş zaman noktasında görüş alanı içindeki tüm fagozomlar için ortalama oran değerlerini hesaplayın. En az üç bağımsız kalibrasyonu tek bir grafikte birleştirerek bu ortalama 490 ila 440 oran değerlerini, ölçülen gerçek pH değerine göre çizin. Ardından, oran değerlerini pH'a dönüştürmek için bir denklem elde etmek için doğrusal olmayan bir regresyon analizi gerçekleştirin.

Bu şekil, fagozomların ve yutulan Xan'ın nasıl ayırt edildiğini göstermektedir. Sol panel, birleştirilmiş bir parlak alan görüntüsü ve 490 ila 440 Fitz zy ve oranını gösterir. Sağ panel ise yalnızca parlak alan görüntüsünü gösterir.

Fagozomlar, hücrelerle birlikte lokalize olmayan veya floresansı, gösterilen parlak alan görüntüsünde fagozomların daha parlak bir halka karakteristiği ile çevrili karanlık bir merkezle eşleşmeyen dış parçacıklardan ayırt edilebilir. İşte vahşi tip ve HV CN'nin tipik zaman rotaları vahşi tip nötrofillerde bir nakavt nötrofil FGA omal pH, erken zaman noktalarında pH'ın nötr veya hafif alkali Yutulmasının ardından, HV CN bir nakavt nötrofillerin fagozomları alkali veya asidik derleme olabilir. Hedeflerin eklenmesinden 30 ila 35 dakika sonra alınan anlık görüntüler, burada gösterilen Fitz Xan oranlarının histogramlarındaki çok sayıda fagozomdan ortalama popülasyon küçük pH'ının hesaplanmasına olanak tanır.

Yabani tip ile HVCN arasındaki küçük pH farklarını görebiliriz bir nakavt nötrofiller Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik altı saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken optimizasyon adımından başlayarak, görüntüleme koşullarını optimize etmeyi unutmamak önemlidir. İlk olarak, optimizasyon adımı için antikor konsantrasyonunun optimize edilmesi, bu prosedürü takiben sağlam fagositoz sağlamak için de yardımcı olabilir.

Ross üretiminin ölçülmesi veya bakteri öldürmenin ölçülmesi gibi diğer yöntemler, küçük Ross'un veya fagozomun bakterileri öldürme yeteneğinin, gelişiminden sonra pH ile birlikte değişip değişmediği gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Bu teknik, fagosit biyolojisi alanındaki araştırmacıların, fagositik hücrelerin daha fazla bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmak için yutulan materyalleri öldürme veya işleme yeteneğini hangi faktörlerin etkilediğini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, canlı hücrelerde fagozomların fizyolojik parametrelerini gerçek zamanlı olarak ölçmek için geometrik floresan mikroskobunun nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.

UNIFOR inhibitörleri ve canlı hücrelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman eldiven giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.