Aksonal Dejenerasyon ve Beyaz Cevher Nörobiyoloji Çalışması Çok Yönlü Fare Modeli subkortikal beyaz madde İnme

Bu prosedürün genel amacı, bu yaygın subkortikal beyaz madde inme formunu modellemek için murin beyaz cevheri içindeki küçük bir inmeyi doğru bir şekilde bulmaktır. Bu yöntem, aksonal yaralanma mekanizmaları, subkortikal inmeye nöronal yanıt ve beyaz cevherin hücresel elemanlarının inmenin hem akut hem de onarım fazlarında nasıl yanıt verdiği gibi inme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, bir konturu beyaz maddeye hassas bir şekilde lokalize etmek için kullanılabilmesi ve çok çeşitli murin fare modelleriyle kullanılabilmesidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, inmenin yanlış lokalizasyonuna yol açan az miktarda beyaz madde nedeniyle mücadele edecektir. Her fare türü için enjeksiyon açısında veya stereotaktik koordinatlarda küçük ayarlamalar veya stereotaktik kurulum gerekebilir. Önce çekilmiş bir cam pipeti bir vakum hattına bağlı boruya yapıştırarak başlayın.

Çekilen ucu L-Nio solüsyonuna veya L-Nio plus floresan izleyiciye yerleştirin. Vakumu başlatın ve pipetin 0,5 milimetre çapındaki kısmının en az iki milimetresi dolana kadar emme uygulayın. Doldurulmuş pipeti bir kenara koyun.

Ardından fareyi stereotaktik mikroskop ile donatılmış stereotaktik bir aparata yerleştirin. Fareyi onaylanmış prosedürlere göre uyuşturduktan ve ameliyata hazırladıktan sonra, anestezi derinliğini bir ayak parmağı tutamıyla kontrol edin. Yanıt verilmemelidir.

Ardından, enjeksiyon kolunu 36 dereceye ayarlayın. Düşük hacimli basınçlı enjeksiyon sisteminin distal ucuna çekilmiş bir cam pipet tutucu takın ve enjeksiyon koluna takın. Kafatasını ortaya çıkarmak için 1,5 santimetrelik orta hat kafa derisi kesisi yaptıktan sonra, yüzey kafatasını pamuklu çubukla kurulayın.

Daha sonra, stereotaktik bir mikroskoptan bakarken, bir ila üç X büyütmede, üstteki periosteal dokuyu çıkarmak için bir mikro nokta aleti kullanın. Bregma'yı ince nokta işaretleyici ile işaretleyin. Ardından, iki milimetrelik eliptik bir kraniotomi delmek için ince uçlu bir cerrahi matkap ucu ile donatılmış bir cerrahi matkap kullanın, bregmadan posteriordan başlayın ve orta hattın hemen solunda öne doğru uzanın.

Serebral korteksin görüntülenebilmesi için kemik parçalarını ve üstteki yumuşak dokuyu çıkarın. Aralıklı olarak steril tuzlu su damlaları uygulayarak kortikal yüzeyi nemli tutun. Ardından, doldurulmuş pipeti enjektör koluna takın.

Pipetin distal ucunu bregma ile hizalayın ve stereotaktik koordinatları sıfırlayın. Tablo bir'de listelenen ön, arka ve medial-lateral koordinatları kullanarak pipeti ilk enjeksiyon noktasına ilerletin. Ardından, pipeti kortikal yüzeye ilerletin ve dorsal-ventral ölçümü sıfırlayın.

Pipeti yavaşça dorsal-ventral koordinatlara indirin. Stereotaktik mikroskop büyütmesinin üç X'e ayarlandığından ve kalibre edilmiş retikülün net bir şekilde görülebildiğinden emin olun. Hava sıvısı menisküsünün sagital bir görünüme sahip olması için açılı pipeti yandan görüntüleyin.

Menisküs, pipetin hem iç hem de dış duvarının aynı odak düzleminde görünmelidir. Şimdi, 20 milisaniyelik darbeler için 20 PSI'ye ayarlanmış yerel bir basınç enjeksiyon sistemi kullanarak, beyne 100 nanolitre L-Nio enjekte edin. Toplam hacmi enjekte ettikten sonra, pipet izinin geri akışını önlemek için beş dakika bekleyin.

Ardından pipeti geri çekin ve enjeksiyon prosedürünü tablo bir'de verilen ikinci ve üçüncü koordinat setinde tekrarlayın. Son enjeksiyondan sonra, pipeti çıkarın ve kraniyotomi bölgesini dolduracak kadar kemik mumu yerleştirin. Son olarak, kafa derisi yarasının kenarlarını yaklaşık olarak inceleyin ve dermal yapıştırıcı ile bağlayın.

Postoperatif analjezi uygulandıktan sonra, hayvanı temiz bir kafese yerleştirin. Ameliyat sonrası antibiyotikleri içme suyunda beş gün, az ise kurban oluncaya kadar veriniz. Fareyi onaylanmış prosedürlere göre feda ettikten ve kafasını kestikten sonra, kafatasını arkaya doğru açmak için steril makas kullanın ve ardından üstteki kafatasını nazikçe çıkarmak için bir spatula kullanın.

Daha sonra, koku soğancığını ve optik sinirleri kesmek için beynin önüne dört milimetrelik steril bir spatula yerleştirin. Ardından, beyni yavaşça kalvaryumdan kaldırın ve buz gibi soğuk diseksiyon tamponuna yerleştirin. Bir beyin bloğu ve steril tıraş bıçağı kullanarak, etkilenen bölgeyi içeren iki ila üç milimetrelik dilimler kesin ve soğuk diseksiyon tamponuna yerleştirin.

Diseksiyon mikroskobu altında, enjekte edilen hemisferdeki motor korteksin altında yatan beyaz maddeyi tanımlayın. İnme sonrası daha erken aralıklarda, hızlı yeşil gibi yaygın laboratuvar boyaları ile karıştırılmış L-Nio enjeksiyonu, inmenin görsel olarak tanımlanmasına izin verebilir. İnme sonrası daha uzun aralıklarla, bölge fokal nekroz ve miyelin solgunluğu ile görsel olarak tanımlanabilir.

Tanımlandıktan sonra, felci içeren beyaz madde bölgesini dikkatlice incelemek için bir neşter kullanın. Üstteki korteksi ve alttaki striatumu istediğiniz gibi çıkarın. Burada gösterildiği gibi, kırmızı ile gösterilen nöral filamentler için immünofloresan etiketleme, medial yaklaşımı kullanarak inmeden yedi gün sonra aksonal kayıp derecesini gösterir.

Posterior açılı yaklaşım kullanılarak, beyaz cevher inme lezyonu lateral ventrikülün hemen üzerinde hedeflenir ve IBA-1 için immünoetiketleme ile tespit edildiği gibi yoğun mikroglial reaktivite gösterir. İki astrosit ara filament markörü, kırmızı ile gösterilen vimentin ve yeşil ile gösterilen glial fibriler asidik protein, inme sonrası beyaz cevher astrositlerinin morfolojisindeki değişiklikleri ortaya koymaktadır. İnme indüksiyonu sırasında floresan dekstran aminin koenjeksiyonu, inme ile yaralanan aksonlarla bireysel nöronların tanımlanmasına izin verir.

Etiketlemenin çoğu, inmenin üzerindeki primer sensorimotor kortekslerdeki beşinci ve altıncı nöronlar içindeki aksonlarda meydana gelir. Bu görüntü inme sonrasındaki yedi günü temsil eder. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 45 dakika içinde yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, bir farede fokal beyaz madde strokunun nasıl üretileceğini iyi anlamalı ve beyni, inme ve nöro onarımdaki önemli soruları yanıtlamak için yararlı olan çeşitli aşağı akış işlemlerine hazırlamalısınız.