Aksonal Dejenerasyon ve Beyaz Cevher Nörobiyoloji Çalışması Çok Yönlü Fare Modeli subkortikal beyaz madde İnme

Bu prosedürün genel amacı, subkortikal beyaz cevher inmesinin bu yaygın formunu modellemek için fare beyaz cevheri içinde küçük bir inme bölgesini doğru bir şekilde belirlemektir. Bu yöntem; aksonal hasar mekanizmaları, subkortikal inmeye karşı nöronal yanıt ve beyaz cevherin hücresel bileşenlerinin inmenin hem akut hem de onarım evreleri sırasında nasıl tepki verdiği gibi inme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, inmenin beyaz cevherde hassas bir şekilde lokalize edilmesine olanak sağlaması ve çok çeşitli fare modelleriyle birlikte kullanılabilmesidir.

Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, beyaz cevher miktarının azlığı nedeniyle inmenin yanlış konumlandırılmasıyla karşılaştıkları için zorlanacaklardır. Her fare suşu için enjeksiyon açısında veya stereotaktik koordinatlarda ya da stereotaktik kurulumda küçük ayarlamalar yapılması gerekebilir. İlk olarak, çekilmiş bir cam pipeti vakum hattına bağlı bir hortuma sabitleyerek başlayın.

Çekilen ucu L-Nio solüsyonuna veya L-Nio artı floresan izleyiciye daldırın. Vakumu başlatın ve pipetin 0,5 milimetre çapındaki kısmının en az iki milimetresi dolana kadar emiş uygulayın. Dolan pipeti bir kenara koyun.

Ardından fareyi, stereotaktik mikroskop ile donatılmış bir stereotaktik aparata yerleştirin. Fareyi onaylanmış prosedürlere göre anestezi altında cerrahiye hazırladıktan sonra, anestezinin derinliğini ayak parmağı sıkıştırma testiyle kontrol edin. Herhangi bir tepki görülmemelidir.

Ardından, enjeksiyon kolunu 36 dereceye ayarlayın. Çekilmiş bir cam pipet tutucuyu, düşük hacimli bir basınçlı enjeksiyon sisteminin distal ucuna sabitleyin ve bunu enjeksiyon koluna takın. Kafatasını açığa çıkarmak için 1,5 santimetre uzunluğunda orta hat kafa derisi insizyonu yaptıktan sonra, kafatası yüzeyini bir pamuklu çubukla kurulayın.

Ardından, bir stereotaktik mikroskop altında, bir ila üç kat büyütmede, üstteki periostal dokuyu temizlemek için bir mikro uçlu alet kullanın. Bregmayı ince uçlu bir markörle işaretleyin. Daha sonra, ince uçlu bir cerrahi matkap ucuyla donatılmış bir cerrahi matkap kullanarak, bregmada posterior olarak başlayan ve orta hattın hemen solunda anterior olarak uzanan iki milimetrelik eliptik bir kraniyotomi gerçekleştirin.

Serebral korteksin görüntülenebilmesi için kemik fragmanlarını ve üzerindeki yumuşak dokuyu temizleyin. Steril salin damlalarını aralıklarla uygulayarak kortikal yüzeyin nemli kalmasını sağlayın. Ardından, doldurulmuş pipeti injektör koluna sabitleyin.

Pipetin distal ucunu bregma ile hizalayın ve stereotaktik koordinatları sıfırlayın. Tablo bir'de listelenen anterior, posterior ve medial-lateral koordinatları kullanarak pipeti birinci enjeksiyon noktasına ilerletin. Ardından, pipeti kortikal yüzeye kadar ilerletin ve dorsal-ventral ölçümünü sıfırlayın.

Pipeti dorsal-ventral koordinatlara doğru yavaşça indirin. Stereotaktik mikroskop büyütmesinin 3X olarak ayarlandığından ve kalibre edilmiş retikülün net bir şekilde görülebildiğinden emin olun. Hava-sıvı menisküsü sagital görünümde olacak şekilde açılı pipete yandan bakın.

Menisküs, pipetin hem iç hem de dış duvarının aynı odak düzleminde görünmelidir. Şimdi, 20 ms'lik darbeler için 20 PSI'ya ayarlanmış bir lokal basınç enjeksiyon sistemi kullanarak, beyne 100 nanolitre L-Nio enjekte edin. Toplam hacmi enjekte ettikten sonra, pipet kanalından geri akışı önlemek için beş dakika bekleyin.

Ardından, pipeti geri çekin ve birinci tabloda verilen ikinci ve üçüncü koordinat kümeleri için enjeksiyon prosedürünü tekrarlayın. Son enjeksiyondan sonra, pipeti çıkarın ve kraniyotomi bölgesini dolduracak kadar kemik mumu yerleştirin. Son olarak, saçlı deri yarasının kenarlarını birbirine yaklaştırın ve dermal yapıştırıcı ile bağlayın.

Postoperatif analjezi uygulandıktan sonra, hayvanı temiz bir kafese yerleştirin. İçme suyunda beş gün boyunca veya sakrifiye süresi beş günden kısaysa sakrifiye edilene kadar postoperatif antibiyotikler sağlayın. Fare, onaylanmış prosedürlere göre sakrifiye edilip desite edildikten sonra, kafatasını arkadan açmak için steril makas kullanın ve ardından üstteki kafatası kemiğini nazikçe kaldırmak için bir spatula kullanın.

Ardından, olfaktör bulbu ve optik sinirleri kesmek için beynin ön kısmına steril dört milimetrelik bir spatula yerleştirin. Daha sonra beyni nazikçe kalvaryumdan çıkarın ve buz gibi soğuk diseksiyon tamponuna yerleştirin. Bir beyin bloğu ve steril jiletler kullanarak, etkilenen bölgeyi içeren iki ila üç milimetrelik dilimler kesin ve soğuk diseksiyon tamponuna yerleştirin.

Bir disseksiyon mikroskobu altında, enjekte edilen hemisferdeki motor korteksin altında kalan beyaz maddeyi tanımlayın. İnme sonrası erken aralıklarda, fast green gibi yaygın laboratuvar boyalarıyla karıştırılmış L-Nio enjeksiyonu, inmenin görsel olarak tanımlanmasına olanak tanıyabilir. İnme sonrası daha uzun aralıklarda, bölge fokal nekroz ve miyelin solgunluğu ile görsel olarak tanımlanabilir.

Belirlendikten sonra, felç bölgesini içeren beyaz cevher bölgesini dikkatlice diseke etmek için bir skalpel kullanın. İsteğe bağlı olarak, üstteki korteksi ve alttaki striatumu çıkarın. Burada gösterildiği gibi, kırmızı renkte gösterilen nöral filamentler için yapılan immünofloresan işaretleme, medial yaklaşım kullanılarak felçten yedi gün sonraki aksonal kayıp derecesini göstermektedir.

Posterior açılı yaklaşım kullanılarak, beyaz madde inme lezyonu lateral ventrikülün hemen üzerine hedeflenmiş olup IBA-1 immunolekelenmesi ile tespit edildiği üzere yoğun mikroglial reaktivite göstermektedir. İki astrosit ara filaman markörü olan kırmızıyla gösterilen vimentin ve yeşille gösterilen glial fibrillary acidic protein, inme sonrası beyaz madde astrositlerinin morfolojisindeki değişiklikleri ortaya koymaktadır. İnme indüksiyonu sırasında floresan dekstran aminin eş zamanlı enjeksiyonu, aksonları inme nedeniyle hasar görmüş bireysel nöronların tanımlanmasına olanak tanır.

Etiketlemenin çoğu, inme bölgesinin üzerindeki primer sensörimotor kortekslerdeki beşinci ve altıncı katman nöronları içindeki aksonlarda gerçekleşir. Bu görüntü, inmeden yedi gün sonrasını temsil etmektedir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde 45 dakika içinde tamamlanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, bir farede fokal beyaz cevher inmesi nasıl oluşturulacağı ve inme ile nöro-onarım konusundaki önemli soruları yanıtlamak için yararlı olan çeşitli alt işlem süreçleri için beyin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.