Name: Aksonal Dejenerasyon ve Beyaz Cevher Nörobiyoloji Çalışması Çok Yönlü Fare Modeli subkortikal beyaz madde İnme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Keşfedin fare beyaz cevherinde fokal inme modellemesi için stereotaktik L-Nio enjeksiyon tekniğini. Bu yöntem aksonal hasar ve mikroglial yanıtları inceleyerek inme nörobiyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SN ve MDD NIH K08 NS083740 ve Nöroloji UCLA Bölümü&#39;nden destek aldı. AJG Dr. Miriam ve Sheldon G. Adelson Tıbbi Araştırma Vakfı ve Larry L. Hillblom Vakfı tarafından destek onaylar. KLN minnetle Amerikan Kalp Derneği 14BFSC17760005 ASA-Bugher İnme Merkezi&#39;nden destek kabul eder. ILL, EGS ve STC NIH R01 NS071481 tarafından desteklendi. JDH NIH K08 NS083740 destek kabul eder.

Bu protokolde hayvanların kullanımı Kaliforniya Los Angeles Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanan prosedürlere uygun olarak yapılmıştır. Not: Hedef fare nüfusu belirleyerek başlayın. Önceki çalışmalarda, sadece erkek doğal tipte C57 / BL6 fareleri, ancak çeşitli transgenik ya nakavt fareleri de kullanılabilir, kullanılmıştır. stereotaktik koordinatlar C57 / BL6 anatomi dayalı olduğunu unutmayın. Her kullanıcı başlangıçta beyaz cevher inme lokalizasyonu doğrulamak tavsiye edilir. 1. Beyaz Matter İnme İndüksiyon - medial Açılı Yaklaşım <ol><li> Distal çapı 15-25 um, 11 arasında olacak şekilde 0.5 mm kapiler tüp kullanılarak çekilen cam pipet hazırlanmasıyla başlar. </li><li> steril% 0.9 normal tuzlu su içinde 27.4 mg / ml (130 uM) de - L-NIO bir steril 10 ul alikosu ((1) -iminoethyl-L-ornitin HCI N- (5)) hazırlamak. </li><li> çekti cam pipet Ön doldurmakcam pipet sabitlenmesiyle, L-NIO (2-5 | il), küçük bir hacme sahip bir vakum hattına bağlı boruya. tezgah üstünde pipet düz Lay ve L-Nio çözeltisi içine çekti ucunu. <ol><li> Pipet 0.5 mm&#39;lik bölümünün en az 2 mm dolana kadar vakum uygulanır. Vakumu kapatın ve pipet çekin. Adım 1.12 kadar bir kenara koyun. </li></ol></li><li> Indüksiyon odasında fare yerleştirin ve standart% 32 izofluran kullanarak fare anestezi neden bir buharlaştırıcı akan (5 L / dk 5 L / dk oksijen ve 0,5 L / dk ile inhale N2) 1 dakika boyunca ya da derin anesteziye kadar. stereotaktik mikroskop ile donatılmış bir stereotaktik aparatı fareyi aktarın. Bir buharlaştırıcı akan% 32 izofluran kullanarak bakım anestezi sağlamak ve bir burun konisi (2 L / dk 5 L / dk oksijen ve 0.5 L / dak N 2 ile inhale). Bir ayak tutam anestezi derinliğini kontrol edin. </li><li> 36 ° enjeksiyon kolunu ayarlayın. </li><li> Affixa düşük hacimli basınçlı enjeksiyon sistemi uzak ucuna cam pipet tutucu çekti ve stereotaktik kurulum enjeksiyon koluna takın. </li><li> Coat iki gözün üstünde vazelin ve yer suni gözyaşı merhemi ile anestezi hayvanın bıyık. başının üzerinde bir 5-10 cm açıklığı olan hayvanın başının üzerinde steril örtüyü koyarak steril cerrahi alanında hazırlayın. kafatası örten kürk tıraş tarafından aspetic cerrahi yüzey hazırlayın. alternatif betadin ve% 70 alkol bezlerden ile kafa derisi temizleyin. </li><li> kafatası yüzeyi ortaya çıkarmak için steril ince makas ile 1,5 cm orta hat kafa derisi kesi olun. Steril bir pamuklu çubukla kafatası kurutun ve 1-3X büyütme stereotaktik mikroskop kullanılarak, steril bir mikro nokta aracını kullanarak herhangi bir üstte periost doku kaldırmak. </li><li> ince bir nokta kalem kullanarak bir referans noktası olarak Bregma işaretleyin. </li><li> steril ince stip cerrahi matkap ucu kullanarak 2 mm ellipitical kraniotomi Matkap0; bregma posterior başlayan ve öne sadece orta hat sol uzanan. kemik parçaları çıkarın ve serebral korteks görüntülenmiştir böylece yumuşak doku örten. </li><li> aralıklı steril serum fizyolojik damla uygulayarak cerrahi alan ve nemli kortikal yüzey tutun. </li><li> Stereotaktik aparatın enjektör koluna çekti cam pipet yapıştırın. Bregma ile pipet distal ucunu hizalayın ve stereotaktik koordinatlar sıfır. </li><li> İlk ön / arka (A / P) pipet ilerlemek ve / Tablo 1&#39;de verilmiştir koordinatları (M / L) yanal medial. </li><li> kortikal yüzeye pipet ilerlemek ve dorsal / ventral (D / V) ölçümü sıfır. </li><li> Yavaş yavaş ilk D / V Tablo 1&#39;de koordinat ulaşana kadar beyin içine pipet geçmektedir. </li><li> beyne L-NIO 100 nl enjekte ve reflü önlemek için 5 dakika bekleyin, 20 msn bakliyat için 20 psi ayarlanmış bir düşük hacimli basınçlı enjeksiyon sistemi kullanarakPipet parça yukarı. <ol><li> Stereotaktik mikroskop mercek ve 3X bir büyütme kalibre reticle kullanın. </li><li> Buna uygun olarak, koordinat her biri için çekilen cam pipet (100 NL karşılık gelen 0.5 mm çapında bir pipet 0.5 mm uzunluğunda), 0.100 mm&#39;lik toplam 3 yerinden. Bir el çantası kullanarak, ölçmek ve her kullanılan büyütme ve ölçekler bağlı olarak değişir kurmak beri standardize. </li><li> hava-sıvı menisküs bir sagital görünümü vardır, böylece her enjeksiyon sırasında doğru hacim ölçümü için, yan mikroskopla açılı pipet yaklaşım. Menisküs pipet iç ve dış duvarın hem aynı odak düzlemi görünmelidir. </li></ol></li><li> Yavaşça pipet çekilme ve adımları tekrarlayın 1.13-1.16.3 Tablo 1&#39;de verilen koordinatlar ikinci ve üçüncü sette de. </li><li> Son enjeksiyondan sonra, pipet kaldırmak ve kraniyotomi sitesini dolduracak kadar kemik mumu yerleştirin. birKafa derisi yara kenarlarını pproximate dermal yapıştırıcı ile bağlanır. </li><li> Kafa derisi kesi ile ilişkili yerel ağrıyı önlemek için önlemek için steril bir 30 G iğne kullanılarak yara marjları içine% 0.5 marcaine 0.1 ml enjekte edilir. </li><li> 5 gün boyunca içme suyu konut ve arz post-operatif antibiyotik hayvan (0.48 mg / ml trimetoprim-sulfametoksazol veya 0.5 mg / ml Levofloksasin) döndürür. </li></ol> 2. Beyaz Matter İnme İndüksiyon - Posterior Açılı Yaklaşım <ol><li> posterior anterior odaklı 45 dereceye stereotaktik kurulum enjeksiyon kolunu ayarlamak dışında, medial açılı yaklaşım protokolünde olduğu gibi adımları 1.1-1.12 gerçekleştirin. </li><li> İlk A / P pipet ilerlemek ve M / L Tablo 2&#39;de verilmiştir koordinatları. </li><li> Komple kalan adımları yanal açılı yaklaşım protokolde olduğu gibi 1,14-1,20. </li></ol> 3. Retrograd Sinir Etiketleme <ol><li> 10 steril hazırlanması% 0.9 normal serum fizyolojik içinde 54.8 mg / ml L-NIO ul alikosu. </li><li> % 0.9 normal serum fizyolojik içinde% 20 Fluororuby (veya% 20, biyotinlenmiş dekstran amin ya da% 2 Fluorogold) steril bir kısım hazırlayın. </li><li> 27.4 mg / ml L-Nio ve% 10 Fluororuby nihai konsantrasyonları için 1: Birlikte: 1 seyreltin. </li><li> adımlarda 1,3-1,23 olarak yukarıdaki vuruş protokolü gerçekleştirin. </li><li> Daha önce 8 açıklandığı gibi perfüzyon fiksasyon, cryosectioning ve mikroskopi ile doku bölümünde doğal floresan tracer gözünüzde canlandırın. </li></ol> İmmünofloresan 4. Doku İşleme <ol><li> 3 saat dan inme sonrası 14 gün arasında değişen uygun bir inme sonrası aralıklarla, izofluran doz aşımı ya da yerel IACUC üzerinden fareler prosedür onaylı euthanize. </li><li> açılı makas kullanarak göğüs boşluğu açın ve sol ventrikül içine bir 23 G kelebek iğne takın. </li><li> perfüzyon sıvısı için bir çıkış izini izin ince makas kullanarak sağ atrium küçük bir kesim yerleştirin. </li><li> Transkardiyal oda sıcaklığında, 10 ml / dk&#39;lık bir oranda soğuk% 4 paraformaldehit 30-40 ml ve ardından soğutulmuş fosfat tamponlu tuz 30-40 ml serpmek. </li><li> fare başını kesmek ve posterior kafatası açmak için steril makas kullanarak beyin kaldırmak ve sonra yavaşça 24 saat süreyle soğuk% 4 PFA halinde beyin, bir spatula ile örten kafatası kaldırmak yerleştirin ve daha sonra 48 saat süreyle PBS içinde% 30 sakaroz transfer . </li><li> Bir kriyostat kullanarak devre mikron kayan kesitler hazırlamak ve daha önce 6-8 tarif edildiği gibi, antikor işlemi gerçekleştirir. Bu çalışmada aşağıdaki antikorların kullanımı: tavşan anti-sinir lifi 200 (1: 500 seyreltme); tavşan anti-vimentin (1: 500); keçi anti-GFAP (1: 500); tavşan anti-IBA-1 (1: 1000). </li></ol> Protein veya RNA Analizi 5. Doku İşleme <ol><li> 3 saat dan inme sonrası 14 gün arasında değişen uygun bir inme sonrası aralıklarla, izofluran doz aşımı yoluyla euthanize ya da yerel IACUC prosedürü onayladı. </li><li> başını kesmekFare posteriora kafatası açmak için steril makas kullanarak beyin kaldırmak ve daha sonra bir spatula ile hafifçe örten kafatası kaldırmak ve. </li><li> Koku ampul ve optik sinirleri koparmaya beynin ön kısmında steril 4 mm spatula yerleştirin. Yavaşça calvarium üzerinden beyin kaldırın ve (1x Hank Dengeli Tuz Çözeltisi, 25 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 35 mM glukoz, 4 mM sodyum bikarbonat, ve 0.01 mg / ml cyclohexamide) buz soğukluğunda tahlil tamponuna içine koyun. </li><li> Bir beyin blok ve steril yeni Jilet kullanarak, soğuk diseksiyon tampon içine inme ve yeri içeren 2-3 mm döşeme hazırlamak. </li><li> bir mikroskop altında enjekte yarımkürede beyaz cevher altta yatan motor korteksin tespit. uzun inme sonrası aralıklarla, bölge görsel fokal nekroz ve miyelin solukluk tarafından tespit edilebilir. (Daha önce inme sonrası aralıklarla,% 10 1 ul ile karıştırılmış L-NIO enjeksiyonu ise Hızlı Yeşil inme görsel kimlik izin verebilir: Not <strong&gt; Şekil 4A). </li><li> Bir mikroskop rehberliğinde ve taze bir neşter kullanılarak altında, dikkatle Hızlı Yeşil etiketleme ya da doku kaybı ya tarafından belirlenen inme içeren beyaz cevher bölgeyi incelemek. istediğiniz gibi örten korteks ve altta yatan striatum çıkarın. </li></ol>

<ol><li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2014+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 129, 28-292 (2014).</li>
<li>Saini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+stroke%3A+not+listened+to+rather+than+silent%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Silent stroke: not listened to rather than silent.</a> Stroke. 43, 3102-3104 (2012).</li>
<li>Koton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+and+outcome+of+prevalent+ischemic+brain+disease+in+a+national+acute+stroke+registry%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Burden and outcome of prevalent ischemic brain disease in a national acute stroke registry.</a> Stroke. 44, 3293-3297 (2013).</li>
<li>Jiwa, N. S., Garrard, P., Hainsworth, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+vascular+dementia+and+vascular+cognitive+impairment%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Experimental models of vascular dementia and vascular cognitive impairment: a systematic review.</a> J Neurochem. 115, 814-828 (2010).</li>
<li>Sozmen, E. G., Hinman, J. D., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+that+matter%3A+white+matter+stroke+models%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Models that matter: white matter stroke models.</a> Neurotherapeutics. 9, 349-358 (2012).</li>
<li>Sozmen, E. G., Kolekar, A., Havton, L. A., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+white+matter+stroke+model+in+the+mouse%3A+axonal+damage%2C+progenitor+responses+and+MRI+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A white matter stroke model in the mouse: axonal damage, progenitor responses and MRI correlates.</a> J Neurosci Methods. 180, 261-272 (2009).</li>
<li>Rosenzweig, S., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+exacerbation+of+white+matter+stroke+outcomes%3A+a+role+for+oxidative+damage+and+inflammatory+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Age-dependent exacerbation of white matter stroke outcomes: a role for oxidative damage and inflammatory mediators.</a> Stroke. 44, 2579-2586 (2013).</li>
<li>Hinman, J. D., Rasband, M. N., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+the+axon+initial+segment+after+focal+cortical+and+white+matter+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Remodeling of the axon initial segment after focal cortical and white matter stroke.</a> Stroke. 44, 182-189 (2013).</li>
<li>McCall, T. B., Feelisch, M., Palmer, R. M., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+N-iminoethyl-L-ornithine+as+an+irreversible+inhibitor+of+nitric+oxide+synthase+in+phagocytic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+j+pharmacol%22%5BJournal%5D)">Identification of N-iminoethyl-L-ornithine as an irreversible inhibitor of nitric oxide synthase in phagocytic cells.</a> Brit j pharmacol. 102, 234-238 (1991).</li>
<li>Gadea, A., Aguirre, A., Haydar, T. F., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1+regulates+oligodendrocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1 regulates oligodendrocyte development.</a> J Neurosci. 29, 10047-10062 (2009).</li>
<li>Dean, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+%28pulling%29+of+needles+for+gene+delivery+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+prot%22%5BJournal%5D)">Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection.</a> CSH prot. , (2006).</li>
<li>Hughes, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+lesions+in+the+rat+central+nervous+system+induced+by+endothelin-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Focal lesions in the rat central nervous system induced by endothelin-1.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 62, 1276-1286 (2003).</li>
<li>Whitehead, S. N., Hachinski, V. C., Cechetto, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+a+rat+model+of+cerebral+ischemia+and+beta-amyloid+toxicity%3A+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Interaction between a rat model of cerebral ischemia and beta-amyloid toxicity: inflammatory responses.</a> Stroke. 36, 107-112 (2005).</li>
<li>Frost, S. B., Barbay, S., Mumert, M. L., Stowe, A. M., Nudo, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+animal+model+of+capsular+infarct%3A+endothelin-1+injections+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">An animal model of capsular infarct: endothelin-1 injections in the rat.</a> Behav Brain Res. 169, 206-211 (2006).</li>
<li>Horie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+focal+cerebral+ischemia+using+endothelin-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Mouse model of focal cerebral ischemia using endothelin-1.</a> J Neurosci Methods. 173, 286-290 (2008).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+deficits+and+delayed+neuronal+loss+in+a+mouse+model+of+multiple+microinfarcts%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cognitive deficits and delayed neuronal loss in a mouse model of multiple microinfarcts.</a> Neuroscience. 32, 17948-17960 (2012).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+smallest+stroke%3A+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nat Neurosci. 16, 55-63 (2013).</li>
<li>Jung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelin+receptor+A+during+myelination+of+developing+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Korean+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of endothelin receptor A during myelination of developing oligodendrocytes.</a> J Korean Med Sci. 26, 92-99 (2011).</li>
</ol>

Subkortikal inme örneksiz bir dizi sıçan 12-14 ve fare 6,15 iç kapsüle endotelin-1 fokal enjeksiyonlar subkortikal beyaz madde ve striatum içeren tarif edilmiştir. Küçük odak vuruşları daha yeni modeller kolesterol mikroemboli karotis arter 16 enjeksiyon ve tek delici arteriole 17 Fototrombotik tıkanıklığı kullanmışlardır. Bu modellerin her biri avantaj ve dezavantajları 5 hem de sahiptir. Şu anda açıklanan model aksonal anormallikler ve zarar, miyelin bozulması, fo...

Subkortikal beyaz cevheri etkileyen inme, ABD'de yıllık klinik inmelerin %25'ini oluşturan yaygın bir klinik durumdur 1. Beyaz cevhere iskemik hasar da sessizce önemli ölçüde daha yüksek bir oranda meydana gelir ve vasküler demans gelişimine katkıda bulunur 2,3. Halen, bu serebral iskemi formuna sahip hastalar, herhangi bir tedavi seçeneği varsa, çok azdır. Bu hastalığın klinik önemine rağmen, klinik olarak anlamlı az sayıda hayvan modeli mevcuttur 4,5. 
Bu protokolün amacı, murin beyaz cevheri içinde fokal iskemik bir lezyon oluşturmaktır. İnsan hastalığının bu murin modeli, inmeye aksonal yaralanma tepkisinin ve beyaz cevherin hücresel elemanlarının, yani aksonlarla birlikte oligodendrositler ve astrositlerin, inme sonrası nasıl tepki verdiğini ve onarıldığını spesifik olarak incelemeye izin verir.
Önceki raporlar, burada tarif edilene benzer bir endotelin-1 (ET-1) 6 kullanan bir subkortikal beyaz cevher inme modelini tanımlamıştır. Deney protokolünde birkaç önemli değişiklik yapılmış ve bu nedenle bu modelin potansiyel kullanımları genişlemiştir 7,8. Bu protokol, fare beyni beyaz cevheri içinde bir odak vuruşu üretmek için güvenilir ve değiştirilebilir bir strateji sağlar. 
Bu modelin en büyük avantajları, kimyasal bir endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS) inhibitörü olan N(5)-(1)-iminoetil-L-ornitin HCl (L-Nio) 9'un kullanılmasıdır, bu da endotelin-1 10 kullanan modellerin bir komplikasyonu olan beyaz cevherin hücresel elemanları üzerinde bilinen hiçbir parakrin etkisi yoktur. Ek olarak, faredeki beyaz cevherin stereotaktik hedeflemesi, inmenin beyin beyaz cevheri üzerindeki etkisini belirlemek için mevcut araçları büyük ölçüde genişleterek, her türlü transgenik veya nakavt suşun kullanılmasına izin verir. Burada, bu tekniğin iki varyasyonu açıklanmış ve aksonal ve beyaz cevher hasarının anlaşılmasını ve inme sonrası onarımını geliştirmek için kullanılabilecek bazı ek varyasyonları göstermiştir.

<table><tbody><tr><td>L-N5- (1-İminoetil) ornitin, Dihidroklorür</td><td>Calbiochem</td><td>400600-20MG</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Phoenix İlaç A.Ş.</td><td>NDC 57319-559-06</td><td></td></tr><tr><td>Kılcal borular</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>50-821-807</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Enstrümantasyon</td><td>Picospritzer II</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktik kurulum</td><td>Kent Scientific</td><td>KSC51725</td><td></td></tr><tr><td>Pipet çektirme</td><td>KOPF</td><td>Model 720</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop SZ51</td><td>Olympus</td><td>88-124</td><td></td></tr><tr><td>İnce makas</td><td>İnce Bilimsel Aletler</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Harvard Aparatı</td><td>PY2 72-8547</td><td></td></tr><tr><td>Kavisli Forseps</td><td>Harvard Aparatı</td><td>PY2 72-8598</td><td></td></tr><tr><td>Künt diseksiyon aleti</td><td>İnce Bilimsel Aletler</td><td>10066-15</td><td></td></tr><tr><td>Matkap</td><td>Dremel</td><td>8220-1/28</td><td></td></tr><tr><td>Matkap uçları</td><td>İnce Bilimsel Araçlar</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marcaine</td><td>HOSPIRA</td><td>NDC 0409-1610-50</td><td></td></tr><tr><td>Trimetoprim-Sülfametaksol</td><td>STI Eczane</td><td>NDC 54879-007-16</td><td></td></tr><tr><td>Flororuby</td><td>Florokrom Inc</td><td>30 mg</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Fisher</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Fisher</td><td>BP220-10</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica CM3050 S</td><td></td><td></td>14047033518</tr><tr><td>Cam kaydıraklar</td><td>Fisher</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Yeşil&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>23 G kelebek iğne</td><td>Fisher</td><td>14-840-35</td><td></td></tr><tr><td>10x Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES-KOH, pH 7.4</td><td>Affymetrix</td><td>16924</td><td></td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sikloheksamit</td><td>Sigma</td><td>01810</td><td></td></tr></tbody></table>

aksonal dejenerasyon ve beyaz cevher nörobiyoloji Çalışması Çok yönlü fare modeli subkortikal beyaz madde İnme

A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology

İnme klinik inme sunumlar% 25&#39;e kadar beyaz madde hesaplarını etkileyen, 5-10 kat daha büyük olabilir fiyatla sessizce gerçekleşir ve vasküler demans gelişmesine önemli ölçüde katkıda bulunur. fokal beyaz cevher inme birkaç model var ve uygun modellerin bu eksikliği inme bu tip sonra yaralanma tepki ve onarımında yer alan nörobiyolojik mekanizmaları anlaşılmasını engelliyordu. diğer subkortikal inme modellerinin ana sınırlama fokal beyaz cevher infarkt kısıtlamak değil ya da öncelikle olmayan fare türlerinde valide edilmiş olmasıdır. Bu beyaz cevher inme nörobiyolojisini incelemek için fare araştırma araçları çok çeşitli uygulama becerisi sınırlar. Burada geri dönüşü olmayan bir eNOS inhibitörü bir lokal enjeksiyonu kullanılarak fare beyaz cevherde fokal inme güvenilir üretimi için bir metodoloji sunuyoruz. Biz de iki benzersiz stereotaktik dahil olmak üzere genel protokol üzerinde çeşitli varyasyonlar mevcutvaryasyonlar, büyük ölçüde bu tekniğin potansiyel uygulamalarını genişletmek retrograd nöronal izleme yanı sıra taze doku etiketleme ve diseksiyonu. Birden fazla yaklaşımlar inme bu ortak ve ilgili yeterli formun nörobiyolojik etkilerini analiz etmek için bu varyasyonlar izin verir.

sunulan modeli kullanarak, beyaz cevher altta yatan ön ayakları sensorimotor korteks güvenilir hedeflenebilir. Tipik olarak insan laküner infarkt görüldüğü gibi kimyasal olarak bağlı kontur modeli, fokal aksonal ve miyelin kaybı, astrositoz ve microgliosis (Şekil 1) üretir. Üç iğne kullanarak, klinik olarak faydalı model ön ayakları, motor görevleri 7 erken yetmezliği ve beyin dokusu deneyimleri küçük ama önemli bir kısmı ile kurulan immünohistokimyasal, immun...

Burada, geri dönüşümsüz bir endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS) inhibitörünün (L-Nio) lokal enjeksiyonu ile murin beyaz cevherinde fokal inme üretimi için metodoloji sunuyoruz. Bu tekniğin potansiyel uygulamalarını genişleten iki stereotaktik varyasyon, retrograd nöronal izleme ve taze doku etiketleme ve diseksiyon sunulmaktadır.

Aksonal Dejenerasyon ve Beyaz Cevher Nörobiyoloji Çalışması Çok Yönlü Fare Modeli subkortikal beyaz madde İnme

Stroke affecting white matter accounts for up to 25% of clinical stroke presentations, occurs silently at rates that may be 5-10 fold greater, and ...

Bu prosedürün genel amacı, subkortikal beyaz cevher inmesinin bu yaygın formunu modellemek için fare beyaz cevheri içinde küçük bir inme bölgesini doğru bir şekilde belirlemektir. Bu yöntem; aksonal hasar mekanizmaları, subkortikal inmeye karşı nöronal yanıt ve beyaz cevherin hücresel bileşenlerinin inmenin hem akut hem de onarım evreleri sırasında nasıl tepki verdiği gibi inme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, inmenin beyaz cevherde hassas bir şekilde lokalize edilmesine olanak sağlaması ve çok çeşitli fare modelleriyle birlikte kullanılabilmesidir.Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, beyaz cevher miktarının azlığı nedeniyle inmenin yanlış konumlandırılmasıyla karşılaştıkları için zorlanacaklardır. Her fare suşu için enjeksiyon açısında veya stereotaktik koordinatlarda ya da stereotaktik kurulumda küçük ayarlamalar yapılması gerekebilir. İlk olarak, çekilmiş bir cam pipeti vakum hattına bağlı bir hortuma sabitleyerek başlayın.Çekilen ucu L-Nio solüsyonuna veya L-Nio artı floresan izleyiciye daldırın. Vakumu başlatın ve pipetin 0,5 milimetre çapındaki kısmının en az iki milimetresi dolana kadar emiş uygulayın. Dolan pipeti bir kenara koyun.Ardından fareyi, stereotaktik mikroskop ile donatılmış bir stereotaktik aparata yerleştirin. Fareyi onaylanmış prosedürlere göre anestezi altında cerrahiye hazırladıktan sonra, anestezinin derinliğini ayak parmağı sıkıştırma testiyle kontrol edin. Herhangi bir tepki görülmemelidir.Ardından, enjeksiyon kolunu 36 dereceye ayarlayın. Çekilmiş bir cam pipet tutucuyu, düşük hacimli bir basınçlı enjeksiyon sisteminin distal ucuna sabitleyin ve bunu enjeksiyon koluna takın. Kafatasını açığa çıkarmak için 1,5 santimetre uzunluğunda orta hat kafa derisi insizyonu yaptıktan sonra, kafatası yüzeyini bir pamuklu çubukla kurulayın.Ardından, bir stereotaktik mikroskop altında, bir ila üç kat büyütmede, üstteki periostal dokuyu temizlemek için bir mikro uçlu alet kullanın. Bregmayı ince uçlu bir markörle işaretleyin. Daha sonra, ince uçlu bir cerrahi matkap ucuyla donatılmış bir cerrahi matkap kullanarak, bregmada posterior olarak başlayan ve orta hattın hemen solunda anterior olarak uzanan iki milimetrelik eliptik bir kraniyotomi gerçekleştirin.Serebral korteksin görüntülenebilmesi için kemik fragmanlarını ve üzerindeki yumuşak dokuyu temizleyin. Steril salin damlalarını aralıklarla uygulayarak kortikal yüzeyin nemli kalmasını sağlayın. Ardından, doldurulmuş pipeti injektör koluna sabitleyin.Pipetin distal ucunu bregma ile hizalayın ve stereotaktik koordinatları sıfırlayın. Tablo bir'de listelenen anterior, posterior ve medial-lateral koordinatları kullanarak pipeti birinci enjeksiyon noktasına ilerletin. Ardından, pipeti kortikal yüzeye kadar ilerletin ve dorsal-ventral ölçümünü sıfırlayın.Pipeti dorsal-ventral koordinatlara doğru yavaşça indirin. Stereotaktik mikroskop büyütmesinin 3X olarak ayarlandığından ve kalibre edilmiş retikülün net bir şekilde görülebildiğinden emin olun. Hava-sıvı menisküsü sagital görünümde olacak şekilde açılı pipete yandan bakın.Menisküs, pipetin hem iç hem de dış duvarının aynı odak düzleminde görünmelidir. Şimdi, 20 ms'lik darbeler için 20 PSI'ya ayarlanmış bir lokal basınç enjeksiyon sistemi kullanarak, beyne 100 nanolitre L-Nio enjekte edin. Toplam hacmi enjekte ettikten sonra, pipet kanalından geri akışı önlemek için beş dakika bekleyin.Ardından, pipeti geri çekin ve birinci tabloda verilen ikinci ve üçüncü koordinat kümeleri için enjeksiyon prosedürünü tekrarlayın. Son enjeksiyondan sonra, pipeti çıkarın ve kraniyotomi bölgesini dolduracak kadar kemik mumu yerleştirin. Son olarak, saçlı deri yarasının kenarlarını birbirine yaklaştırın ve dermal yapıştırıcı ile bağlayın.Postoperatif analjezi uygulandıktan sonra, hayvanı temiz bir kafese yerleştirin. İçme suyunda beş gün boyunca veya sakrifiye süresi beş günden kısaysa sakrifiye edilene kadar postoperatif antibiyotikler sağlayın. Fare, onaylanmış prosedürlere göre sakrifiye edilip desite edildikten sonra, kafatasını arkadan açmak için steril makas kullanın ve ardından üstteki kafatası kemiğini nazikçe kaldırmak için bir spatula kullanın.Ardından, olfaktör bulbu ve optik sinirleri kesmek için beynin ön kısmına steril dört milimetrelik bir spatula yerleştirin. Daha sonra beyni nazikçe kalvaryumdan çıkarın ve buz gibi soğuk diseksiyon tamponuna yerleştirin. Bir beyin bloğu ve steril jiletler kullanarak, etkilenen bölgeyi içeren iki ila üç milimetrelik dilimler kesin ve soğuk diseksiyon tamponuna yerleştirin.Bir disseksiyon mikroskobu altında, enjekte edilen hemisferdeki motor korteksin altında kalan beyaz maddeyi tanımlayın. İnme sonrası erken aralıklarda, fast green gibi yaygın laboratuvar boyalarıyla karıştırılmış L-Nio enjeksiyonu, inmenin görsel olarak tanımlanmasına olanak tanıyabilir. İnme sonrası daha uzun aralıklarda, bölge fokal nekroz ve miyelin solgunluğu ile görsel olarak tanımlanabilir.Belirlendikten sonra, felç bölgesini içeren beyaz cevher bölgesini dikkatlice diseke etmek için bir skalpel kullanın. İsteğe bağlı olarak, üstteki korteksi ve alttaki striatumu çıkarın. Burada gösterildiği gibi, kırmızı renkte gösterilen nöral filamentler için yapılan immünofloresan işaretleme, medial yaklaşım kullanılarak felçten yedi gün sonraki aksonal kayıp derecesini göstermektedir.Posterior açılı yaklaşım kullanılarak, beyaz madde inme lezyonu lateral ventrikülün hemen üzerine hedeflenmiş olup IBA-1 immunolekelenmesi ile tespit edildiği üzere yoğun mikroglial reaktivite göstermektedir. İki astrosit ara filaman markörü olan kırmızıyla gösterilen vimentin ve yeşille gösterilen glial fibrillary acidic protein, inme sonrası beyaz madde astrositlerinin morfolojisindeki değişiklikleri ortaya koymaktadır. İnme indüksiyonu sırasında floresan dekstran aminin eş zamanlı enjeksiyonu, aksonları inme nedeniyle hasar görmüş bireysel nöronların tanımlanmasına olanak tanır.Etiketlemenin çoğu, inme bölgesinin üzerindeki primer sensörimotor kortekslerdeki beşinci ve altıncı katman nöronları içindeki aksonlarda gerçekleşir. Bu görüntü, inmeden yedi gün sonrasını temsil etmektedir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde 45 dakika içinde tamamlanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, bir farede fokal beyaz cevher inmesi nasıl oluşturulacağı ve inme ile nöro-onarım konusundaki önemli soruları yanıtlamak için yararlı olan çeşitli alt işlem süreçleri için beyin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

a-versatile-murine-model-subcortical-white-matter-stroke-for-study

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu video, beyaz madde içinde hedeflenen beyin koordinatlarına bir nitrik oksit inhibitörü enjekte ederek anestezi uygulanmış bir farede beyaz madde inmesini indüklemek için kesin tekniği göstermektedir. Bu, kan damarı daralmasına ve kan akışının engellenmesine yol açarak nöronal hasara ve beyin felci ile sonuçlanır.

Bir nitrik oksit inhibitörü kullanarak bir murin modelinde beyaz cevher inmesinin indüklenmesi

Orta serebral arter oklüzyonu (MCAO) çeşitli kemirgen modelleri yaygın deneysel beyin araştırmalarda kullanılır. Burada, insan iskemik strok çoğunluğu tarafından uygulanan zarar tekabül eden bir boyutta tutarlı bir kortikal enfarktüs üreten transkraniyal sürekli uzak MCAO modelini göstermektedir.

Farelerde Modelleme İnme: Distal Orta Serebral Arter Daimi Pıhtılaşma

Bu el yazması kapsül enfarktüs bir modelleme tekniği anlatılmaktadır. Burada ön ameliyat hedef haritalama sonra ışık düşük yoğunluğu ile modifiye Fototrombotik tekniği kullanılmıştır. Bu tekniği kullanarak, biz kalıcı motorlu bozukluğu olan bir sınırlı kapsül infarkt modeli yarattı.

Bir FOTOTROMBOTİK Tekniği sınırlı Kapsül Enfarktüs Modelleme

Bu makalede, yenidoğan faresinde tekrarlanabilir omurilik kompresyon yaralanması (SCI) oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Model, spontan fonksiyonel iyileşmenin altında yatan adaptif plastisite mekanizmalarını incelemek için avantajlı bir platform sağlar.

Bir Yenidoğan Fare Omurilik Sıkıştırma Yaralanması Modeli

distal orta serebral arter dalı (MCAO) Cerrahi tıkanması, deneysel inme araştırmalarında sıkça kullanılan bir modeldir. Bu el yazması farelerde boyuna intravital mikroskopi için bir fırsat sunuyor yanal kafatası pencere takılması, birlikte kalıcı MCAO temel tekniğini açıklar.

Yanal Kronik Kranial Pencere Hazırlık sağlar İn Vivo Farelerde Distal Orta Serebral Arter Tıkanıklığı takiben Gözlem

Burada açıklanan fototrombotik inme modeli, bir inmenin, ışığa duyarlı bir boyanın kullanılmasından sonra lazer aydınlatma kullanılarak kalıcı mikrovasküler tıkanıklık indüklenerek sağlam kafatasından üretildiği yerdir.

Farelerde Modelleme İnme: Fototomboz ile Fokal Kortikal Lezyonlar

Bu protokol, orta büyüklükte bir enfarktüse ve mükemmel bir hayatta kalma oranına sahip benzersiz bir fare vuruşu modeli gösterir. Bu model, klinik öncesi inme araştırmacılarının iskemi süresini uzatmasına, yaşlı fareleri kullanmasına ve uzun vadeli fonksiyonel sonuçları değerlendirmesine olanak tanır.

Yaşlı Farelerde İnme Sonuçlarını İncelemek için Modifiye Transkraniyal Orta Serebral Arter Oklüzyon Modeli

Bu protokol, kortikal iskemik inmeyi takiben Neurod1'in viral aracılı ektopik ekspresyonunu tanımlar. Neurod1, (1) inme sonrası subakut faz sırasında (7 gün) vahşi tip farelerde Cre-Flex AAV sistemi kullanılarak ve (2) inme sonrası kronik faz sırasında (21 gün) koşullu raportör farelerde tek bir AAV vektörü kullanılarak verilir.

İskemik İnme Sonrası Subakut ve Kronik Zamanlarda Transdüksiyonlu Hücrelerde Nörod1'in Ektopik Ekspresyonunun Araştırılması için AAV Sistemleri ve Fare Modelleri

Asimetrik bilateral ortak karotis arter stenozunun iğne yöntemi, vasküler kognitif bozukluk ve demans için bir fare modeli oluşturmak için önerilmiştir. Daha önce kurulmuş modellere kıyasla daha uzun vadeli sonuçlarla sonuçlanır ve canlı MRG ile uyumludur. Prosedürü gösteren görsel temsil, ameliyatta ustalaşmak için rehberlik sağlar.

İğne Kılavuzluğunda Asimetrik Bilateral Ortak Karotis Arter Darlığına Dayalı Vasküler Kognitif Bozukluk ve Demans için Bir Fare Modeli

Izole adacık transplantasyonu tip 1 şeker hastalığı için potansiyel bir tedavi olarak öne sürülmüştür. Burada, fare pancreata adacıkları izole, ve böbrek subkapsüler alan nakli için bir yöntem açıklanmaktadır.

Murin Islet İzolasyon ve subkapsüler Böbrek Nakli Bir Yöntem

Keşfedin fare beyaz cevherinde fokal inme modellemesi için stereotaktik L-Nio enjeksiyon tekniğini. Bu yöntem aksonal hasar ve mikroglial yanıtları inceleyerek inme nörobiyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

Aksonal Dejenerasyon ve Beyaz Cevher Nörobiyoloji Çalışması Çok Yönlü Fare Modeli subkortikal beyaz madde İnme

Daha fazla video keşfet