RNA Analizi İnsan Prostat Epitelinin Lazer yakalama mikrodiseksiyon

Bu lazer yakalama mikrodisseksiyon protokolünün genel amacı, heterojen dondurulmuş prostat dokularından, sonraki gen ekspresyon analizleri için saf prostatik epitelyal hücre tipi popülasyonlarından toplam RNA izole etmektir. Bu yöntem, hasta örneklerinin analiz edilmesine ve prostat kanseri araştırma alanındaki temel soruların, örneğin benign ve hastalıklı epitelyal prostatik doku örneklerinde veya klinik araştırma örneklerinde RNA ekspresyonunun nasıl farklılaştığı gibi soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, lazer yakalama mikrodisseksiyonun dondurulmuş prostat dokusundan homojen epitelyal veya stroma hücresi popülasyonlarının RNA izolasyonuna olanak tanımasıdır.

Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, RNA'ların korunması için hangi adımların kritik olduğunu bilmedikleri için yüksek kaliteli RNA elde etmekte zorlanırlar. Serbest koşullar. İşlem için gerekli olan tüm reaktifleri ve araçları toplayarak başlayın. Dondurulmuş prostat dokusunun kriyostat içinde 30 dakika boyunca dengelenmesine izin verdikten sonra, kasetin altına montaj ortamı püskürtün ve soğutulmuş pensler kullanarak dokuyu hızlıca monte edin.

Kasetleme ortamının donması için kaseti kriyostatın soğutucusunda beş dakika bekletin. Donma işlemi tamamlandığında, dondurulmuş kasetleme ortamını çakmağa püskürtün ve monte edilmiş dokuyu dikkatlice üzerine bastırın. Alt taraf yukarı bakacak şekilde yerleştirin.

Hazırlığın beş dakika boyunca sabitlenmesini bekleyin. Mandreni tutucuya yerleştirmeden önce, kolu konumuna kilitleyin ve kriyostata yeni bir bıçak takın. Kolun kilidini açtıktan sonra, istenen doku açığa çıkana kadar örneği dikkatlice ilerletin.

Hazır olduğunda, kriyostatı beş mikrona ayarlayın ve bir veya iki kesit alın. Bu kesitleri hematoksilin ve eozin boyaması için yüklü bir cam lam üzerine yerleştirin. Lamı hemen iki dakika boyunca soğuk, %100 etanol içine yerleştirin.

Bu sürenin ardından lamı çıkarın ve oda sıcaklığında kurumaya bırakın. H ve E ile boyanmış lam, nükleer dokuların daha iyi görselleştirilmesini sağlar ve patolog tarafından ilgi duyulan alanların işaretlenmesi için kullanılmalıdır. Ardından, oda sıcaklığındaki bir kalem çerçevesini yerleştirin.

Bir çerçeve destekleyicisine yerleştirin, kriyostatı 10 mikron değerine ayarlayın ve kesitler oluşturun. Doku boyutuna bağlı olarak, her bir lam üzerine bir ila dört kesit yerleştirilebilir. Lamı hemen soğuk %100 etanol içerisine daldırın.

Lamı iki dakika sonra çıkarın ve daha sonraki analizler için dondurucuda saklayın. Lazer yakalama mikrodissection işleminin yapıldığı aynı gün, RNA içermeyen bir alanda çalışarak kalem çerçeveli lamları dondurucudan çıkarın. Lamları önce iki dakika boyunca %90 etanolde, ardından iki dakika boyunca %75 etanolde nazikçe bekleterek hidrate edin.

Hidrasyon işleminin ardından, lamları 0,5% toluidine blue çözeltisine beş ile 30 saniye arasında nazikçe daldırarak prostat dokusunu boyayın. Lamları önce 15 saniye boyunca saf suda iki kez yıkayarak, ardından 30 saniye ile üç dakika arasında %75 etanol ile yıkayarak dokuyu renginden arındırın. Son olarak, pen frame lamlarını buz üzerinde bulunan RNA içermeyen kuru bir kaba aktarın.

Prosüdüre başlamadan önce, bir lamı kurutulması için 15 dakika boyunca lam ısıtıcısına yerleştirin. Yalnızca işlenecek olan lamı kurutun ve geri kalanları ihtiyaç duyulana kadar buz üzerinde saklayın. LCM bileşenlerini aşağıdaki sırayla çalıştırın.

Mikroskop gücünü, lazer anahtarını, lazer şalterini ve ardından bilgisayarı açın. Sonra, ilgili yazılımı kullanarak lazer mikrodissection yazılımını başlatın. Mikroskoba lamları ve toplama tüplerini yüklemesi için komut verin.

Numune tutucuyu boşalt seçeneğine tıklayın ve lamı, doku yüzeyi aşağı bakacak şekilde lam tutucuya yerleştirin. Lam tutucuyu mikroskoptaki uygun yuvaya yerleştirin ve devam et seçeneğine tıklayın. Ardından, toplama tüplerini boşalt seçeneğine tıklayın.

Tüpleri etiketleyip tüp tutucuya yerleştirin ve uygun yuvaya takın. Kapakları sıkıca kapatın ve hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek 35 µL lizis tamponu ekleyin.

Toplama kapakları yüklendikten sonra tamam'a tıklayın. Yazılımı kullanarak tutucudaki lamın konumunu seçin ve ardından örneği toplamak için toplama kapağını seçin. Bilgisayar üzerinden 10 x büyütmede lamı görüntüleyin ve odaklayın.

Yazılımı kullanarak, "laser" seçeneğini belirleyip lazeri kalibre edin. Ardından "laser" ve sonrasında "control" seçeneklerini seçerek kalibrasyon yapın ve lazerin güç, diyafram ve hız ayarlarını düzenleyin. Lazer, dokuyu tamamen kesene kadar ayarlamalar yapmaya devam edin.

LCM'ye tabi tutulan dokunun istenen alanlarını doğru bir şekilde diseke edebilmek için, genellikle board sertifikalı bir patolog tarafından yapılan ilgi alanlarının belirlenmesi kritik öneme sahiptir; bu işlem için 8x11 H&E patolog işaretlemesi görsel rehber olarak kullanılır. Görünümdeki istenen epitel alanlarını çevrelemek için yazılımdaki şekil çizme aracını kullanın ve herhangi bir stroma toplamaktan kaçının. Lazeri başlatmak için "cut" seçeneğine tıklayın.

Bir alan tamamen kesilmemişse, üzerinden manuel olarak geçmek için taşıma ve kesme aracını kullanın. Objektifi yeni görünümlere doğru hareket ettirmeye devam edin ve lam tamamen diseke edilene veya istenen miktarda doku toplanana kadar lazer kesim işlemini tekrarlayın. İşlem tamamlandığında, tüpleri toplama tutucusundan dikkatlice çıkarın ve kapaklardaki lizis çözeltisi, tampon ve dokulara dikkat ederek kapakları kapatın.

Kısaca, sıvıyı ve dokuyu tüpün dibinde toplamak için 30 saniye boyunca santrifüjleyin. Numuneleri 30 dakika boyunca 42 °C'de inkübe edin ve RNA izolasyonu için hazır olana kadar -80 °C'de saklayın. Bu örnekler, benign epitel hücre tipi spesifik kontrollerinin lazerle yakalanmasından önce ve sonra, bir kalem çerçeveli lam üzerindeki temsilci toluidin mavisi boyalı prostat kesitlerini göstermektedir.

Dokunun lazerle yakalanan alanının özgüllüğünü doğrulayın. Benign epitel ve stroma. Prostat kanserine özgü gen olan A-M-A-C-R'yi eksprese etmezler.

Stroma, epitelyuma özgü geni ve KX 3.1'i eksprese etmedi. Bu prosedürü uygularken, RNA degradasyonunu önlemek için RNA içermeyen bir ortamda çalışmayı hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, birçok alt analiz tekniği için dondurulmuş dokudaki epitelyal veya stromal hücrelerin homojen popülasyonlarından RNA'nın nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Kriyostatla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken iyi bir eğitim almak ve bıçağa aşırı derecede dikkat etmek gibi önlemler her zaman alınmalıdır.