Name: RNA Analizi İnsan Prostat Epitelinin Lazer yakalama mikrodiseksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Öğrenin, lazer yakalama mikrodiseksiyon ile donmuş prostat dokusundan saf epitel hücre popülasyonlarından RNA izolasyonu yapmayı. Bu yöntem, prostat kanseri araştırmalarında gen ekspresyonu analizlerine olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yıllar boyunca bu metodolojiyi optimize etmedeki yardımları için Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco ve Avani Vaishnav'a ve RNA sıralama analizi için Urbana-Champaign'deki Illinois Üniversitesi'nden Yang Zhang ve Dr. Jian Ma'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH / NCI R01 CA166588-01 (Nonn), Amerikan Kanser Derneği Araştırma Görevlisi 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH / NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Sağlık Eşitsizlikleri Fikir Ödülü PC121923 (Nonn) ve Kanseri Önleme Vakfı hibesi (Zhou) tarafından desteklenmiştir.

Bu deneyler için kullanılan tüm insan dokuları Chicago&#39;daki Illinois Üniversitesi&#39;nde Kurumsal Değerlendirme Kurulu onaylı protokol ve / veya muafiyet yoluyla elde edildi. 1. Bölüm Taze Donmuş Prostat PEN-slayt üzerine ve Ücretli Cam Slide üzerine <ol><li> Bir gün önce veya bir kaç saat numune kesit önce, temiz araçlar (yani, fırça, forseps, coplins, bıçaklar, PEN-çerçeveli slaytlar (değilse zaten RNaz ücretsiz), bir ETOH güvenli işaretleyici ve bir kalem) ve iç Bir sprey şişesi ve laboratuar mendil kullanarak çözüm-dekontaminasyon RNaz RT Kriyostat. <ol><li> RNaz dekontaminasyon çözüm silerek önce 5 dakika boyunca oturup çözüm ve (depcH 2 0 ile hazırlanan)% 70 EtOH ile son durulama RNaz-dekontaminasyon üzerinde sol kaldırmak için depcH 2 0 ile durulayın izin verin. Not: Bir RNaz ücretsiz çalışma alanı korumak için şarttır. Tüm coplins, araçlar, dondurulmuş montaj orta, bıçaklar ve kullanılan slaytlar RNaz ücretsiz iş için yalnızca kullanılmalıdırve standart bir olmayan RNaz ortamda hiç kullanmadım. Tüm enstrümanlar her deneyden önce bir Rnase dekontaminasyon solüsyonu ile tedavi edilmelidir. </li></ol></li><li> -24 ° C&#39;ye soğutun kriyostat. </li><li> Önce Kesit en az 30 dakika soğumasını kriyostat içinde aşağıdaki temizlenmiş RNaz ücretsiz araçlar yerleştirin: slayt coplin dolu% 100 etanol, araçlar, küçük dondurulmuş doku kaset ve montaj mandren ile. </li><li> Taşınması için bir kuru buz dolu bir köpük halinde dondurulup ve kova yere donmuş prostat dokusunu al. En az 30 dakika boyunca sıcaklık kriyostat denge sağlaması için kriyostat halinde doku yerleştirin. Not: lazer yakalama mikro diseksiyon İnsan prostat dokuları taze dondurulmuş veya da olabilir parafine gömülü (FFPE) formalin ile fikse. Zaman kısıtlamaları ve slayt hazırlama doku kaynakları arasında biraz farklıdır. Burada donmuş kesitler için adımları açıklar. </li><li> Bir seferde bir doku ile Çalışma ve botto içine donmuş montaj orta fışkırtmaKasetin m ve hızlı bir şekilde soğutulmuş forseps kullanılarak dondurulmuş montaj ortama donmuş prostat dokusunu monte edin. </li><li> Dondurulmuş montaj orta ayarlamak için 5 dakika süreyle kriyostat içinde soğutucu üzerine doku ile kaseti yerleştirin. </li><li> Chuck üzerine dondurulmuş montaj orta küçük bir miktar Squirt ve dikkatle dondurulmuş montaj ortamına kadar monte doku alt tarafı basın. 5 dk dondurulmuş montaj orta tamamen katılaşmaya izin vermek için kriyostat ayarlanır edelim. </li><li> Tutucu içine aynasını yerleştirin ve sıkın. </li><li> Kilitli pozisyonda kolu kilitleyin ve kriyostat üzerine yeni bir bıçak yerleştirin. Amplifikasyon aşamasını içerir aşağı moleküler uç noktaları için (yani, qPCR) bu bulaşmayı önlemek (veya sonraki numune için bıçak alanı kullanabilirsiniz üzerinde bıçağı taşımak) her hasta için yeni bir bıçak kullanılması tavsiye edilir. </li><li> Kolu kilidini ve dikkatle eşitlemek için elle veya bir ayak pedalı ile doku ilerlemek ve 50 mikron ile doku maruzistenen doku maruz kadar m bölümleri ulaşılır. </li><li> 5 um Kriyostat ayarlayın, bir veya iki bölümleri kesmek ve hematoksilen ve eozin (H &amp; E) boyama için ücret cam slayt üzerine yerleştirin (Adım 2). </li><li> Hemen 2 dakika süreyle soğuk% 100 etanol içine slayt yerleştirin. </li><li> Etanol tahsil cam slayt çıkarın ve H &amp; E boyama (Adım 2) geçmeden önce oda sıcaklığında kurumaya bırakın. </li><li> Bir çerçeve destekçisi RT PEN-çerçeve slayt yerleştirin. </li><li> RT PEN çerçeve slaytlar üzerine 10 mikron ve yer bölümlerine Kriyostat ayarlayın. Bir dört bölümler doku büyüklüğüne bağlı olarak her bir slayt üzerine bir yer olabilir. </li><li> Hemen 2 dakika süreyle soğuk% 100 etanol içine slayt dalma. </li><li> Etanol PEN-frame slaytları çıkarın ve LCM için hazır olana kadar -80 ° C derin dondurucuda bir desiccator kutusunda bir slayt kutusuna slayt saklayın. Üç gün Optimal RNA kurtarma için maksimum depolama süresidir. </li><li> Tahsil cam kaydırdı SADECE Adım 2 ile devam edine. PEN-frame slayt için Adım 3 ile devam edin. </li></ol> 2. Hematoksilen Eozin ve-Y (H &amp; E) histolojik Mark-up için Leke Not: Bu yüklü cam slayt doku ve DEĞİL LCM PEN-çerçeve slayt için eğer. <ol><li> Aşağıdaki gibi derecelendirilmiştir etanol ile slayt daldırma yüklü cam slayt bölümleri hidrat: 3 dakika için iki% 70 etanol içinde bir kez 3 dakika boyunca, 3 dakika süre ile kayıcı% 95 etanol içinde iki kez% 100 etanol içinde iki kez daldırma 3 dakika boyunca damıtılmış H 2 O zamanlar. <ol><li> 99 ml% 70 etanol + 1 mi% 1 HCI ve% 0.1 sodyum bikarbonat çözeltisi: 100 ml içinde 0.1 g sodyum bikarbonat damıtılmış H2O asidi alkolü çözeltisi hazırlayın </li></ol></li><li> 5 dakika boyunca hematoksilin Gill II (% 0.4) slayt batırın. </li><li> 3 dakika sürekli çalışan musluk H 2 O aşırı leke yıkayın. </li><li> Kayıcı asit alkol 10 kez batırın </li><li> 3 dakika boyunca musluk H 2 O çalışan slayt yıkayın. </li><li> Slayt Dip% 0.1 sodyum bikarbonat çözeltisi içinde 30-60 sn mavi mor renge dönüşür için. </li><li> 3 dakika boyunca musluk H 2 O çalışan slayt yıkayın. </li><li> 10 dips% 95 etanol içinde slayt durulayın. </li><li> 15 saniye toplam Eozin-Y 2-3 kez slayt batırın. </li><li> Aşağıdaki gibi kademeli etanol ile slayt dehydrate: Ksilen slayt% 95 etanol içinde iki kez,% 100 etanol içinde iki kez ve iki kez daldırma (doku kapsamlı dehidratasyon gösterir açıkça göründüğünden emin olun). </li><li> Sulu olmayan kalıcı sabit montaj orta ve kapak kayma ile slayt monte edin. </li><li> 30 dakika boyunca slayt kurumasını bekleyin. </li><li> Herhangi bir tam slayt tarayıcı ile tarama slayt ve 8 &quot;x 11&quot; kağıt üzerine bir büyük, yüksek çözünürlüklü görüntü yazdırmak. </li><li> Ilgi Anahat alanları işaretleyici ile (genellikle bir kurul onaylı patolog tarafından yapılır). Bu biçimlendirme LCM prosedürü için kılavuzdur. </li></ol> PEN-frame Slaytlar 3. Toluidine Mavi Boyama Not: ThLCM olarak AYNI GÜN yapılır edilir. Tüm çözümler için depcH 2 O su kullanın. RNaz ücretsiz alan tüm adımları tamamlayın. Tüm coplins RNaz dekontaminasyon çözeltisi ile temizlenmelidir. <ol><li> LCM gün 2 dakika süreyle daha sonra 2 dakika süreyle% 90 EtOH içine yavaşça daldırma slaytlar tarafından% 75 EtOH -80 ° C derin dondurucuda ve hidrat gelen PEN-frame slaytları çıkarın. <ol><li> Daha sonra oda sıcaklığında 0.2 um&#39;lik bir filtreden ve mağaza sterilize filtre moleküler biyoloji sınıfı su içinde eritilmesi ile% 0.5 toluidin mavisi hazırlayın. Bu çözelti, en fazla 6 ay süreyle yeniden kullanılabilmektedir. Not: Bu son derece öncesinde filtrasyon birkaç saat sürebilir olarak solüsyonu hazırlamak için tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Yavaşça 5-30 saniye boyunca% 0.5 toluidin mavisi içine slaytlar batırarak prostat dokusunu Leke. Yıkama ile doku 3 dakika için 30 saniye için% 75 EtOH, ardından 15 saniye boyunca depcH 2 O 2 kez slaytlar destain. Not: Leke ve destain süreleri iyi boyama sağlamak için ayarlanabilir. Prostat leke üzerinde eğilimindedir. </li><li&gt; buz üzerinde RNAaz serbest kuru kaba PEN-kare slaytlar aktarın. </li></ol> 4. Lazer yakalama Mikro diseksiyon (LCM) <ol><li> LCM, 15 dakika boyunca 42 ° C &#39;de sıcak bir slayt kuru slayt hemen önce. Işlenmiş ve onlar için hazır olana kadar buz üzerinde kalan saklamak olacak Kuru, sadece slayt. </li><li> LCM ve bilgisayar bu sırada, mikroskop gücü, lazer tuşu, lazer anahtarı ve ardından bilgisayarı açın. Lazer Diseksiyon yazılımını başlatın. </li><li> Slaytlar ve toplama tüpleri yüklemek için mikroskop kontrol etmek için yazılımı kullanın. Daha sonra &quot;Devam&quot; butonuna tıklayınız, &quot;boşaltma numune tutucu&quot; üzerine tıklayın aşağı bakacak şekilde doku ile mikroskop lamı sahibinin üzerine bölümleri ile slayt yüklemek ve mikroskopta uygun yuvaya slayt tutucu takın. <ol><li> &quot;Boşaltma toplama tüpleri&quot;, etiketin üzerine tıklayın ve tüp tutucu üzerine 0.5 ml tüpler yüklemek ve enstrüman uygun yuvaya takın. bir Zamanlarkapaklar toplama kapaklar Lizis tampon 35 ul ekleyin ve kabarcıkları önlemek için deneyin, güvencesindedir. Daha sonra &quot;Tamam&quot; a tıklayın. Not: 25 ul lizis tamponu 10 ul depcH2O ile: buharlaşma bir sorun varsa, aşağıdaki gibi tampon sulandırmak. </li></ol></li><li> Yazılımda, slayt slayt tutucuya yerleştirildi konumu seçin. LCM numune toplamak için toplama kapağı seçin. </li><li> Görselleştirmek ve 10X de bilgisayar aracılığıyla slayt odaklanır. Ardından &quot;kalibre&quot; &quot;Laser&quot; seçerek lazer kalibre etmek için yazılımı kullanın. Lazer ışını tamamen ve verimli seçilen alanı kesmek için izin lazerin güç, diyafram ve hız, seçme &quot;lazer&quot;, sonra &quot;kontrol&quot; ayarlayın. Tamamen doku içinden lazer kesim kadar ayarlamalar tekrarlayın. </li><li> Bir kılavuz olarak 8 &quot;x 11&quot; patolog mark-up kullanarak, epithe istenilen alanlarını sınırlamak için &quot;şekil çizmek&quot; aracını kullanıngörünümünde Lium herhangi bir stroma toplama önlemek. Birden alanlar tek bir görünümde içinde seçilebilir, ancak &quot;şeklinde kesmek&quot; aracını tıklayarak ilk kesme olmadan başka görünüme hareket etmiyor: Not. <ol><li> Bir alan tamamen lazerle kesilmiş olsun yoksa manuel üzerine gitmek için &quot;hareket ve kesim&quot; aracını kullanın. Yeni görüşlere hedefi hareketli Devam ve slayt tamamen disseke edilir veya doku istenilen miktarda tahsil edilene kadar lazer kesim tekrarlayın (tipik olarak 100 huylu bezleri RNA 150-500 ng verim). (Şekil 1A örneğe bakın). </li></ol></li><li> Dikkatle kapaklar lizis tamponu ve doku dikkatli olmak, tahsilat sahibinin tüpleri kaldırmak ve kapaklarını kapatın. Kısaca tüpünün dibinde sıvı ve doku toplamak 30 sn için santrifüjlenir. RNA izolasyonu için hazır olana kadar -80 ° C&#39;de 30 dakika ve mağaza 42 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> Bir Fil ile 5. Toplam RNA izolasyonuter bazlı Takımı ve Kalite Analizleri <ol><li> Buz üzerinde tüpler dışarı çözülme ve 100 ul çözümün ses getirmek. </li><li> Filtrenin merkezine 30 ul ofLysis Çözüm uygulayarak RNA izolasyon kiti, mikro filtre önceden ıslak ve sonraki iki adımı (en azından 5 dakika) whileperforming bekletin. </li><li> Lizat (kitte sağlanan) LCM katkı maddesi çözeltisi 3 ul ilave edin ve 5 saniye için vorteks ile karıştırılır. Tüpün altındaki sıvıyı toplamak için 30 saniye boyunca santrifüjleyin. </li><li> Sıvıyı çıkarmak için en yüksek hızda 30 saniye ~ için önceden ıslatılmış filtre santrifüj. </li><li> Yukarı ve aşağı yavaşça, lizat karışımına girdap ya da pipet% 100 etanol (bu durumda 129 ul) 1.25 hacimleri ekleyin. ** Bu yöntem, büyük ve küçük RNA türleri hem de kurtaracaktır. </li><li> 1 dk filtreye RNA bağlamak için 10.000 xg&#39;de önceden ıslatılmış mikro filtre üzerine numuneyi ve santrifüj yükleyin. Daha sonra yıkama solüsyonu 1, R &quot;, 180 ul mikro filtre yıkama21; 1 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüj. Not: Tüm santrifüj bu nokta 13.000 xg veya maksimum hızda yapılmalıdır seçin. </li><li> Kit protokol tarafından yönlendirildiği gibi yıkayın sırasıyla &quot;Yıkama çözümlerinin 2 ve 3&quot; 180 ul ile iki kez filtre. Santrifüj bakiye akışkan maddeyi ortadan kaldırmak ve kurutun 30 sn için, daha sonra akış atmak ve 1 dakika boyunca filtreyi dönerler. </li><li> Yeni bir koleksiyon tüpüne filtreyi aktarın. </li><li> (Takım ile birlikte verilme), -95 ° C&#39;ye kadar sıcak Elüsyon çözeltisi. </li><li> Filtrenin merkezine önceden ısıtılmış yıkama çözeltisi 10 ul uygulayın, kapağını takın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca muhafaza edin. Daha sonra RNA elüte etmek için 1 dk için santrifüj ve ~ RNA 20 ul elde etmek için bu adımı bir kez tekrarlayın. </li><li> 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca DNaz I tedavi gerçekleştirin. </li><li> 260 nm&#39;de absorbans ile spektrofotometre ile RNA ölçmek. 260 nm ve 280 nm dalga boylarında optik yoğunluk oranı saflığını değerlendirmek için kullanılırRNA 15 (Tablo 1). </li></ol> 6. Gen İfadesi Analizi Not: (mRNA ve lncRNAs gibi) uzun bir RNA türünün gen ekspresyonunu Aşama 6.1 ve kısa RNA türünün (mikroRNA gibi) gösterilir aşama 6.2&#39;de gösterilmiştir. Farklı kitleri RT-qPCR için kullanılabilir ve gerekli RNA miktarı (10 ng kadar az) kiti göre değişir. RNA sekans analizi, 6.3 tarif edilmektedir. <ol><li> Arka uyarlamak (RT) 5 RT ana karışımı ul (RT tampon maddesi, dNTP&#39;ler, rastgele primerler, RT enziminin, RNaz inhibitörü) ile 20 ng 5 ul / RNA örnek ul karışım cDNA&#39;ya RNA&#39;nın. 37 ° C&#39;de, sonra 120 dakika 25 ° C&#39;de 25 dakika boyunca reaksiyon inkübe ve 85 ° C &#39;de 5 dak. </li><li> RNaz içermeyen su ile RT reaksiyonu 1:10 seyreltin ve ilgi genleri için primer ya da primer / prob setleri ile 10 ul qPCR reaksiyon başına 2.5 ul kullanın. Not: kısmen bozulmuş RNA analizini kolaylaştırmak için bu fo primerler kullanılması tavsiye edilirr kısa amplikonlar (az 100 bp) 16. (Tablo 2B) <ol><li> MicroRNA ifade analizi için RT usta karışımı 5 ul 2-10 ng 5 ul / RNA örnek ul karıştırılarak RT reaksiyonu çalıştırın. Not: her biri ticari olarak temin edilebilen PCR bazlı mikroRNA algılama teknolojisi, özel ve özel bir RT primerleri kullanılmasını gerektirir. </li></ol></li><li> Alternatif olarak veya RT-PCR ilave olarak, RNA farklı türler ölçmek için yeni nesil dizilimi (RNA seq veya küçük RNA seq) kullanın. Genellikle, bu prosedür (Tablo 3) RNA 500 ​​ng kullanımı ve üretimi ve tespit aracı ile gösterildiği gibi yöntemi gerçekleştirmek. </li></ol>

<ol><li>Schauer, I. G., Rowley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+role+of+reactive+stroma+in+benign+prostatic+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia.</a> Differentiation. 82, 200-210 (2011).</li>
<li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+as+models+of+prostate+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-related+cancer%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures as models of prostate cancer development.</a> Endocrine-related cancer. 12, 19-47 (2005).</li>
<li>McNeal, J. E., Haillot, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+spread+of+adenocarcinoma+in+the+prostate+as+related+to+cancer+volume%5BTitle%5D)+AND+%22The+Prostate%22%5BJournal%5D)">Patterns of spread of adenocarcinoma in the prostate as related to cancer volume.</a> The Prostate. 49, 48-57 (2001).</li>
<li>Nonn, L., Vaishnav, A., Gallagher, L., Gann, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+and+micro-RNA+expression+analysis+in+laser-capture+microdissected+prostate+biopsies%3A+valuable+tool+for+risk+assessment+and+prevention+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+molecular+pathology%22%5BJournal%5D)">mRNA and micro-RNA expression analysis in laser-capture microdissected prostate biopsies: valuable tool for risk assessment and prevention trials.</a> Experimental and molecular pathology. 88, 45-51 (2010).</li>
<li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+transcriptome+analysis+of+formalin-fixed+prostate+cancer+specimens+identifies+biomarkers+of+disease+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Global transcriptome analysis of formalin-fixed prostate cancer specimens identifies biomarkers of disease recurrence.</a> Cancer research. 74, 3228-3237 (2014).</li>
<li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-coding+and+microRNA+biomarkers+of+recurrence+of+prostate+cancer+following+radical+prostatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Protein-coding and microRNA biomarkers of recurrence of prostate cancer following radical prostatectomy.</a> The American journal of pathology. 179, 46-54 (2011).</li>
<li>Giangreco, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+and+regulation+of+vitamin+D+hydroxylases+and+inflammatory+genes+in+prostate+stroma+and+epithelium+by+1%2C25-dihydroxyvitamin+D+in+men+with+prostate+cancer+and+an+in+vitro.+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+steroid+biochemistry+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Differential expression and regulation of vitamin D hydroxylases and inflammatory genes in prostate stroma and epithelium by 1,25-dihydroxyvitamin D in men with prostate cancer and an in vitro. model.</a> The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. , (2014).</li>
<li>Giangreco, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+microRNAs%2C+miR-100+and+-125b%2C+are+regulated+by+1%2C25-dihydroxyvitamin+D+in+primary+prostate+cells+and+in+patient+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+prevention+research%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor microRNAs, miR-100 and -125b, are regulated by 1,25-dihydroxyvitamin D in primary prostate cells and in patient tissue.</a> Cancer prevention research. 6, 483-494 (2013).</li>
<li>Mihelich, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-183-96-182+cluster+is+overexpressed+in+prostate+tissue+and+regulates+zinc+homeostasis+in+prostate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells.</a> The Journal of biological chemistry. 286, 44503-44511 (2011).</li>
<li>Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+RNA+integrity+in+a+homogeneous+population+of+mammary+epithelial+cells+isolated+by+Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection.</a> BMC cell biology. 11, 95(2010).</li>
<li>Gregg, J. L., Brown, K. E., Mintz, E. M., Piontkivska, H., Fraizer, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+in+prostate+cancer+epithelial+and+interstitial+stromal+cells+using+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression in prostate cancer epithelial and interstitial stromal cells using laser capture microdissection.</a> BMC cancer. 10, 165(2010).</li>
<li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+microRNA+profiling+of+prostate+carcinomas+with+increasing+tumor+stage+by+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer+research+%3A+MCR%22%5BJournal%5D)">Comparative microRNA profiling of prostate carcinomas with increasing tumor stage by deep sequencing.</a> Molecular cancer research : MCR. 12, 250-263 (2014).</li>
<li>Smalheiser, N. R., Lugli, G., Thimmapuram, J., Cook, E. H., Larson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+siRNAs+and+noncoding+RNA-derived+small+RNAs+are+expressed+in+adult+mouse+hippocampus+and+are+up-regulated+in+olfactory+discrimination+training%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Endogenous siRNAs and noncoding RNA-derived small RNAs are expressed in adult mouse hippocampus and are up-regulated in olfactory discrimination training.</a> Rna. 17, 166-181 (2011).</li>
<li>Song, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profile+analysis+of+microRNAs+in+prostate+cancer+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Prostate%22%5BJournal%5D)">Expression profile analysis of microRNAs in prostate cancer by next-generation sequencing.</a> The Prostate. 75, 500-516 (2015).</li>
<li>Deng, M. Y., Wang, H., Ward, G. B., Beckham, T. R., McKenna, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+six+RNA+extraction+methods+for+the+detection+of+classical+swine+fever+virus+by+real-time+and+conventional+reverse+transcription-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+veterinary+diagnostic+investigation+%3A+official+publication+of+the+American+Association+of+Veterinary+Laboratory+Diagnosticians%2C+Inc%22%5BJournal%5D)">Comparison of six RNA extraction methods for the detection of classical swine fever virus by real-time and conventional reverse transcription-PCR.</a> Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17, 574-578 (2005).</li>
<li>Kong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+short+amplicons+in+FFPE-derived+long-chain+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of short amplicons in FFPE-derived long-chain RNA.</a> Scientific reports. 4, 7246(2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

İnsan örneklerden gen ekspresyonu kalitesi veya uygun bir doku miktarı için değil, aynı zamanda, belirli bir doku numunesinde mevcut olan çeşitli histolojik kişiler için değil, sadece zor olabilir. Bu iyi huylu dokular büyük ölçüde stromal doku ve kanser alanlardır stroma yoksun olduğu prostat özellikle zordur. LCM, iki farklı hücre tipleri (Şekil 1A) daha doğru bir imza prostat stroma ve epitel RNA fiziksel olarak ayrılmasını kolaylaştırır. Macrodissection veya bütün doku işleme kıyasla, LCM huylu doku...

Prostat bezi, öncelikle düz kas 1 oluşan Fibromusküler stroma ile çevrili glandüler asinüs düzenlenmiş salgı epitel oluşan heterojen bir dokudur. Bazal hücreler, salgı hücreleri, nöroendokrin hücre transit yükselterek hücre ve kök hücre 2: epitelial bölmesi, beş farklı ama organize hücre tiplerinin oluşur. Luminal epithelial hücrelerde ortaya çıkar, prostat kanseri (PCa) &#39;de, adenokarsinom büyüme stromal bölmesinde 3 arasında belirgin bir aşamalı bir düşüş olur. Bu nedenlerden dolayı, doku örnekleri PCa ölçüde göre stromal ve epitelyal hücre tipinin orantılı olarak belirgin farklılıklar vardır. Bu farklılıklar, istenen hücre tipi mikrodiseksiyon bakılmaksızın tüm dokulardan elde edilen gen ekspresyon verileri yanlı varsayımlar yol açabilir. Bu nedenle, bu önyargı kaldırmak için onu önce RNA ekstraksiyon ve hücre tiplerini ayırmak için esastırgen ekspresyon analizi. Macrodissection ya mikrodiseksiyon fiziksel çevredeki stroma 4 -6 den iyi karakterize edilmiş epitelyal alanları ayırmak için kullanılabilir. Macrodissection tipik bir mikroskop altında bir jilet ile yapılan ve büyük PCa stromadan nodüller ayırmak için iyi çalışır, ancak stroma çevreleyen benign epitel kaldırma yeteneğine sahip değildir (Şekil 1&#39;de huylu prostat histoloji örneğe bakın). Bir lazer (LCM) ile Mikrodisseksiyonla macrodissection önemli ölçüde daha fazla emek yoğun, ama çok doğru bir iyi huylu epitel 4 incelemek olabilir. Bizim laboratuardan Son yayınlar RNA başarıyla formalin ile fikse parafine gömülü (FFPE) biyopsi veya dondurulmuş doku 4,7-9 birinden LCM tarafından elde edilebilir olduğunu göstermiştir. LCM-RNA ekstraksiyonu büyük zorluklar R 1) doğru dokuda istenilen alanlarını incelemek için, ve 2) korumak için vardırLCM ve izolasyon işlemi 4.10 sırasında NA bütünlüğü. Saf hücre popülasyonlarının izole RNA ters transkripsiyon kantitatif PCR (RT-qPCR) 7,8, mikrodizi 11 ve derin -sequencing 12-14 dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle gen ekspresyon analizi için kullanılabilir. Bu protokolün amacı, aşağı doğru gen ekspresyon analizleri donmuş dokudan LCM prostatik epitel toplam RNA&#39;nın izole edilmesi için.

<table><tbody><tr><td>RNase-UZAKTA&nbsp;</td><td>MBP</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>KALEM membran 4.0 mm slaytlar&nbsp;</td><td>Leica</td><td>11600289</td><td></td></tr><tr><td>Cam slaytlar, Superfrost Plus</td><td>FisherBrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 geçirmez</td><td>Decon laboratuvarları.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>DEPC (dietil pirokarbonat)</td> <td>Sigma</td><td>D-5758</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Coplins (Boyama kavanozu)</td> <td>IHCWORLD</td><td>M900-12</td><td></td></tr><tr><td>Coplins (Boyama rafı)</td> <td>IHCWORLD</td><td>M905-12</td><td></td></tr><tr><td>Aperio ScanScope Aperio (</td><td>Leica)</td> <td>ScanScope&reg; </td><td></td>CS</tr><tr><td>Toluidin Mavi</td><td>Fluka</td><td>89640-5G</td><td></td></tr><tr><td>Lazer Mikrodiseksiyon Sistemi</td><td>Leica</td><td>LMD7000</td><td></td></tr><tr>LCM <td>Thermo Scientific</td><td>AB-0350</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous&reg;-Micro Total RNA İzolasyon Kiti</td> için 0.5 ml İnce Cidarlı Tüpler <td>Ambion</td><td>AM1931</td><td>Thermo Fisher Scientific Marka</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Florometre</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Q32866</td><td>Thermo Fisher Scientific Marka</td></tr><tr><td>Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific Marka</td><td>4368814</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td></tr><tr><td>Evrensel cDNA Sentez Kiti II, 8-64 rxns</td><td>Exiqon 203301</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan microRNA RT kiti</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4366597</td><td>Thermo Fisher Scientific Marka</td></tr><tr><td>Hematoksilen boyası&nbsp;</td><td>Ricca Kimya Şirketi</td><td>3536-16</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Y</td><td>Richard Allan Bilimsel&nbsp;</td><td>7111</td><td></td></tr></tbody></table>

rna analizi İnsan prostat epitelinin lazer yakalama mikrodiseksiyon

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

Prostat bezi, stromal, epitelyal, nöroendokrin ve immün hücre tiplerinden oluşan heterojen bir ortam içerir. Sağlıklı prostat, ayrık epitelyal astarlı sekretuar lümenleri çevreleyen fibromüsküler stroma ve çok küçük bir immün ve nöroendokrin hücre popülasyonundan oluşur. Buna karşılık, prostat kanseri bölgeleri, stromal popülasyonu büyük ölçüde azalmış veya hiç olmayan displastik luminal epitel ile artmıştır. Stromal ve epitelyal hücre tipleri arasındaki derin fark göz önüne alındığında, herhangi bir aşağı akış moleküler analizi için hücre tiplerini ayırmak zorunludur. Bu bilgiye rağmen, gen ekspresyonu çalışmalarının büyük bir kısmı iyi huylu prostatı mikro diseksiyon olmadan kanserle karşılaştırır ve bu da iyi huylu örneklerde stromal yanlılığa yol açar. Lazer yakalamalı mikro diseksiyon (LCM), farklı hücre tiplerini bir numune bölümünden fiziksel olarak ayırmak için etkili bir yöntemdir. Bu protokolün amacı, RNA'nın LCM tarafından toplanan insan prostat epitelinden başarılı bir şekilde izole edilebileceğini ve RT-qPCR ve RNAseq gibi aşağı akış gen ekspresyonu çalışmaları için kullanılabileceğini göstermektir.

Bir önceki çalışmada aynı hastadan 4 dondurulmuş ve FFPE prostat dokularından mRNA ve microRNA RT-qPCR ifade profilleme karşılaştırmak epitel ve stromal doku toplamak için LCM kullanımını gösterdi. LCM RNA büyük miktarda nesil sekans analizi için toplanacak olan, özellikle de zaman alıcıdır. Bu nedenle, çalışma alanı tutmak için çok önemlidir ve araçları ücretsiz RNaz. (Bir sonraki paragrafta daha ayrıntılı olarak ele) toplandı RNA kaliteli ve hücre-özgüllük kontrolleri incelemek için tavsiye edilir. ...

Bu protokolün amacı, aşağı akış RNA analizi için heterojen prostat dokularından saf hücre tipi popülasyonlarını izole etmek için etkili bir yöntem olarak lazer yakalama mikro-diseksiyonunu kullanmaktır.

RNA Analizi İnsan Prostat Epitelinin Lazer yakalama mikrodiseksiyon

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Bu lazer yakalama mikrodisseksiyon protokolünün genel amacı, heterojen dondurulmuş prostat dokularından, sonraki gen ekspresyon analizleri için saf prostatik epitelyal hücre tipi popülasyonlarından toplam RNA izole etmektir. Bu yöntem, hasta örneklerinin analiz edilmesine ve prostat kanseri araştırma alanındaki temel soruların, örneğin benign ve hastalıklı epitelyal prostatik doku örneklerinde veya klinik araştırma örneklerinde RNA ekspresyonunun nasıl farklılaştığı gibi soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, lazer yakalama mikrodisseksiyonun dondurulmuş prostat dokusundan homojen epitelyal veya stroma hücresi popülasyonlarının RNA izolasyonuna olanak tanımasıdır.Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, RNA'ların korunması için hangi adımların kritik olduğunu bilmedikleri için yüksek kaliteli RNA elde etmekte zorlanırlar. Serbest koşullar. İşlem için gerekli olan tüm reaktifleri ve araçları toplayarak başlayın. Dondurulmuş prostat dokusunun kriyostat içinde 30 dakika boyunca dengelenmesine izin verdikten sonra, kasetin altına montaj ortamı püskürtün ve soğutulmuş pensler kullanarak dokuyu hızlıca monte edin.Kasetleme ortamının donması için kaseti

laser-capture-microdissection-human-prostatic-epithelium-for-rna

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kantitatif Real Time PCR (qPCR) tümör örneklerinde çeşitli mikroRNA ifade seviyeleri (miRNA) molekülleri araştırmak için hızlı ve duyarlı bir yöntemdir. Farklı miRNA moleküller yüzlerce bu yöntem ifadesi kullanılarak, amplifiye miktarı, ve aynı cDNA şablon ile analiz edilebilir.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) tarafından Prostat tümörlerinde mikroRNA Algılama

İnsan genomunun% 8'ini işgal insan endojen retrovirüsleri (herv), kıt kodlama kapasitelerini ama yüz bin uzun terminal tekrarları (LSY) korur. Özel bir Affymetrix mikroarray bireysel herv odağı ifade belirlemek için tasarlanmıştır ve gelecekteki klinik çalışmalar için kavramının bir kanıtı olarak prostat kanseri dokularda kullanıldı.

Prostat Kanserinde Biyomarker Discovery Uygulama: Bireysel herv Lokusları İfade Mikroarray tabanlı Kimlik

Belirli bir doku hücrelerinin bir alt kümesi gen ifade analizi büyük bir sorun teşkil etmektedir. Bu makalede, lazer yakalama mikrodiseksiyon ile hızlı bir immün yöntemi birleştirerek belirli bir hücre popülasyonu yüksek kaliteli toplam RNA izole açıklamaktadır.

Hücre belirli alt gruplar RNA izolasyonu Hızlı immünoyaftalama ile birlikte Lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanma

Burada, kantitatif gerçek zamanlı PCR (RT-PCR) ve yerinde hibridizasyon (ISH) kullanan arşivlenmiş Formalin-Sabit, Parafine Gömülü (FFPE) veya taze dondurulmuş prostat kanseri (PCa) klinik dokularında mikroRNA (miRNA) ekspresyon analizleri için basitleştirilmiş bir protokolü açıklıyoruz.

Prostat Kanseri Klinik Dokularındaki miRNA İfade Analizleri

Burada, biz bir tekrarlanabilir lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) için bir protokol trabeküler meshwork (TM) aşağı akım RNA analizi için yalıtmak için açıklamak. TM ifadede gen değişiklikleri analiz yeteneği göz hastalıkları TM ile ilgili temel moleküler mekanizmaları anlamada yardımcı olacaktır.

Lazer yakalama mikrodiseksiyon son derece saf trabeküler Meshwork gen ifade analizi için fare gözlerinden

Bu iletişim kuralı, enterik gangliyon lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanarak sabitlenmemiş, taze rezeke insan bağırsak dokusundan izole yüksek bütünlük RNA örnekleri almak için hedeftir. Bu protokol flaş donmuş örnekleri insan bağırsak dokusu, cryosectioning, ethanolic boyama ve dehidratasyon, LCM, hazırlanıyor içerir ve RNA çıkarma.

Lazer-yakalama mikrodiseksiyon optimizasyonu gelen insan dokusu taze donmuş enterik gangliyon yalıtım için

Kemik hücrelerinde gen ekspresyonu analizi için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmek için lazer yakalama mikrodisseksi (LCM) protokolü geliştirilmiştir. Mevcut çalışma fare uyluk bölümleri üzerinde duruluyor. Ancak, burada bildirilen LCM protokolü herhangi bir sert doku hücrelerinde gen ekspresyonu çalışmak için kullanılabilir.

Taze Dondurulmuş Fare Kemiklerinden Yüksek Kaliteli RNA Veren Lazer Yakalama Mikrodisksiyon Protokolü

Bu protokol, fare embriyosu taze dondurulmuş bölümlerinden kıkırdak ve kemik izolasyonu için lazer yakalama mikrodizeksiyon açıklar. Kıkırdak ve kemik hızla cresyl menekşe boyama ile görselleştirilmiş ve transkripsiyonanalizi için yüksek kaliteli RNA verim hassas toplanabilir.

Gen Ekspresyonu Analizi için Fare Embriyonik Kıkırdağı ve Kemiğinin Lazer Yakalama Mikrodizmesi

Tedavi direnci genellikle ileri prostat kanseri olan hastalarda gelişir, ve bazı durumlarda, kanser nöroendokrin prostat kanseri denilen ölümcül bir alt tip ilerler. Bu geçişi kolaylaştıran küçük kodlamayan RNA aracılı moleküler değişikliklerin değerlendirilmesi, daha iyi hastalık tabakalaşmasına ve nöroendokrin prostat kanserigelişimine yol açan nedensel mekanizmaların tanımlanmasına olanak sağlayacaktır.

Formalin-sabit Dokulardan Küçük Kodlamaz RNA'nın ve Kastrasyona Dirençli Prostat Kanseri Hastalarından Serum Türetilmiş Ekzozomların Dizilimi

Glomerulus, proksimal tübül, kalın yükselen uzuv, toplama kanalı ve interstiyum dahil olmak üzere insan böbreğinin alt segmentlerinin lazer mikroseksiyonu için bir protokol açıklıyoruz. RNA daha sonra elde edilen bölmelerden izole edilir ve her alt segmentteki transkriptomik imzadaki değişiklikleri belirlemek için RNA dizilimi gerçekleştirilir.

İnsan Böbrek Dokusunda Bölgesel TranskriptomikLeri Ortaya Çıkarmak İçin Lazer Mikrodispeksiyon Uygulaması

Bu protokol, paraformaldehit sabitlenmiş, Optimal Kesme Sıcaklığı bileşen gömülü fare karaciğer dokusunun tanımlı histolojik bölgelerinden RNA'yı lazer yakalama mikrodiseksiyonu kullanarak izole etme yöntemini tanımlar; böylece hedefe yönelik aşağı akım gen ekspresyonu analizi mümkün olur.

RNA analizi için paraformaldehit sabitli fare karaciğer dokusunun lazer yakalama mikrodiseksiyonu

Öğrenin, lazer yakalama mikrodiseksiyon ile donmuş prostat dokusundan saf epitel hücre popülasyonlarından RNA izolasyonu yapmayı. Bu yöntem, prostat kanseri araştırmalarında gen ekspresyonu analizlerine olanak tanır.

RNA Analizi İnsan Prostat Epitelinin Lazer yakalama mikrodiseksiyon

Daha fazla video keşfet