RNA Analizi İnsan Prostat Epitelinin Lazer yakalama mikrodiseksiyon
26 Kasım 2015
Bu protokolün amacı, aşağı akış RNA analizi için heterojen prostat dokularından saf hücre tipi popülasyonlarını izole etmek için etkili bir yöntem olarak lazer yakalama mikro-diseksiyonunu kullanmaktır.
Bu lazer yakalama mikro diseksiyon protokolünün genel amacı, aşağı akış gen ekspresyon analizleri için heterojen donmuş prostat dokularından prostat epitel hücre tiplerinin saf popülasyonlarından toplam RNA'yı izole etmektir. Bu yöntem, hasta örneklerini analiz etmeye ve prostat kanseri araştırma alanındaki RNA ekspresyonunun iyi huylu ve hastalık epitelyal protez doku örneklerinde veya klinik araştırma örneklerinde nasıl farklılık gösterdiği gibi temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, lazer yakalamalı mikro diseksiyonun donmuş prostat dokusundan homojen epitelyal veya str hücre popülasyonlarının RNA izolasyonunu sağlamasıdır.
Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, RNA'ları korumak için hangi adımların kritik olduğunu bilmedikleri için yüksek kaliteli RNA elde etmek için mücadele edeceklerdir. Serbest koşullar: Prosedür için gerekli tüm reaktifleri ve araçları toplayarak başlayın. Donmuş prostat dokusunun kriyostat içinde 30 dakika boyunca dengelenmesine izin verdikten sonra, montaj ortamını kasetin altına sıkın ve soğutulmuş forseps kullanarak dokuyu hızlı bir şekilde monte edin.
Montaj ortamını ayarlamak için kaseti kriyostatın soğutucusuna beş dakika boyunca yerleştirin. Ayarlandıktan sonra, dondurulmuş, montaj ortamını aynaya fışkırtın ve monte edilen dokuyu dikkatlice içine bastırın. Alt taraf yukarı.
Hazırlığın beş dakika sertleşmesine izin verin. Mandreni tutucuya yerleştirmeden önce, kolu yerine kilitleyin ve kriyostatın üzerine yeni bir bıçak yerleştirin. Sapın kilidini açtıktan sonra, istenen doku maruziyetine ulaşılana kadar numuneyi dikkatlice ilerletin.
Hazır olduğunda, kriyostatı beş mikrona ayarlayın ve bir veya iki bölümü kesin. Bu bölümleri hematin ve eoin boyama için yüklü bir cam slayt üzerine yerleştirin. Slaytı hemen iki dakika boyunca soğuk, %100 etanolün içine yerleştirin.
Bu sürenin sonunda slaytı çıkarın ve oda sıcaklığında kurumaya bırakın. H ve d lekeli slayt, nükleer dokuların daha iyi görselleştirilmesini sağlar ve patolog tarafından ilgi alanlarını işaretlemek için kullanılmalıdır. Ardından, oda sıcaklığında bir kalem çerçevesi yerleştirin.
Bir çerçeve destekçisine kaydırın, kriyostatı 10 mikrona ayarlayın ve bölümler oluşturun. Doku boyutuna bağlı olarak her slayta bir ila dört bölüm yerleştirilebilir. Slaytı hemen soğuk% 100 etanole daldırın.
Slaytı iki dakika sonra çıkarın ve daha sonra analiz etmek üzere dondurucuda saklayın. Lazer yakalama mikrodiseksiyonunun aynı gününde, RNA içermeyen bir alanda çalışan kalem çerçevesi slaytlarını dondurucudan alın. Slaytları iki dakika boyunca hafifçe %90 etanole, ardından iki dakika boyunca %75 etanole batırarak nemlendirin.
Hidratlandıktan sonra, slaytları beş ila 30 saniye arasında nazikçe %0,5 toine mavisine batırarak prostat dokusunu boyayın. Slaytları 15 saniye boyunca derin suda iki kez, ardından 30 saniye ila üç dakika boyunca% 75 etanol yıkayarak dokuyu alıkoyun. Son olarak, kalem çerçevesi slaytlarını buz üzerinde RNA içermeyen kuru bir kaba aktarın.
Prosedüre başlamadan önce, 15 dakika boyunca bir slayt ısıtıcısı üzerine kuruması için bir slayt yerleştirin. Yalnızca işlenecek slaytı kurutun ve geri kalanını ihtiyaç duyulana kadar buz üzerinde saklayın. LCM bileşenlerini aşağıdaki sırayla açın.
Mikroskop gücü, lazer anahtarı, lazer anahtarı ve ardından bilgisayar. Ardından, yazılımı kullanarak lazer mikrodiseksiyon yazılımını başlatın. Mikroskobun slaytları ve toplama tüplerini yüklemesini isteyin.
Numune tutucuyu boşaltın üzerine tıklayın ve slaytı, doku aşağı bakacak şekilde slayt tutucuya yükleyin. Slayt tutucuyu mikroskoptaki uygun yuvaya yerleştirin ve devam et'e tıklayın. Ardından, toplama tüplerini boşalt'a tıklayın.
Tüpleri etiketleyin ve tüp tutucuya yükleyin ve uygun yuvaya yerleştirin. Kapakları sabitleyin ve 35 mikrolitre lizis tamponu ekleyin. Kabarcıklardan kaçınmaya özen gösterin.
Koleksiyon kapakları yüklendikten sonra Tamam'a tıklayın. Tutucudaki sürgünün konumunu seçmek için yazılımı kullanın ve ardından numuneyi almak için toplama kapağını seçin. Slaytı bilgisayarda 10 x büyütme ile görselleştirin ve odaklayın.
Lazeri seçerek lazeri kalibre etmek için yazılımı kullanın. Ardından kalibre edin, lazeri seçerek lazerin güç açıklığını ve hızını ayarlayın ve ardından kontrol edin. Lazer dokuyu tamamen kesene kadar ayarlamalar yapmaya devam edin.
LCM'ye tabi tutulan dokunun arzu alanlarını doğru bir şekilde incelemek için tipik olarak kurul sertifikalı bir patolog tarafından yapılan ilgi alanlarını ana hatlarıyla belirtmek çok önemlidir Sekize 11 saat ve e patolog işaretlemesini görsel bir kılavuz olarak kullanarak. Görünümde istenen epitel alanlarını sınırlamak ve herhangi bir stroma toplamaktan kaçınmak için yazılımdaki şekil çizme aracını kullanın. Lazeri başlatmak için kes'e tıklayın.
Bir alan tamamen kesilmemişse, manuel olarak üzerinden geçmek için taşıma ve kesme aracını kullanın. Objektifi yeni görünümlere taşımaya devam edin ve slayt tamamen diseke edilene veya istenen miktarda doku toplanana kadar lazer kesimi tekrarlayın. Tamamlandığında, tüpleri toplama tutucusundan dikkatlice çıkarın ve kapaklardaki lizis, tampon ve dokuya dikkat ederek kapakları kapatın.
Kısaca, tüpün dibindeki sıvıyı ve dokuyu toplamak için 30 saniye santrifüj edin. Numuneleri 42 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin ve RNA izolasyonu için hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Bu örnekler, iyi huylu epitel hücre tipine özgü kontrolleri yakalayan lazerden önce ve sonra bir kalem çerçevesi slaytı üzerinde temsili toluidin mavisi lekeli prostat kesitlerini göstermektedir.
Dokunun lazerle yakalanan alanının özgüllüğünü onaylayın. İyi huylu epitel ve stroma. Prostat kanserine özgü geni A-M-A-C-R'yi eksprese etmeyin.
Stroma epitelyal spesifik geni ve KX 3.1'i bu prosedürü denerken eksprese etmedi. RNA bozulmasını önlemek için RNA içermeyen bir ortamda çalışmayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, çok sayıda aşağı akış analiz tekniği için donmuş dokudan homojen epitel veya fırtına hücresi popülasyonlarından RNA'nın nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Bir kriyostat ile çalışmanın, bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman iyi eğitim ve bıçağa son derece iyi dikkat edilmesi gibi önlemlerde son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, heterojen dondurulmuş prostat dokularından saf prostat epitel hücre tiplerini izole etmek için lazer-capture mikro-diseksiyon kullanımını açıklar. Bu yöntem, prostat kanseri araştırmalarında aşağı yönlü RNA analizini kolaylaştırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyoloji
- Onkoloji
Arka Plan
- Prostat kanseri araştırmaları, belirli hücre tiplerinden hassas RNA analizi gerektirir.
- Heterojen dokular, saf hücre popülasyonlarının izole edilmesini zorlaştırır.
- Lazer-capture mikro-diseksiyon, yüksek kaliteli RNA ekstraksiyonu için bir çözüm sunar.
- RNA ekspresyon farklılıklarının anlaşılması klinik uygulamaları bilgilendirebilir.
Çalışmanın Amacı
- Saf prostat epitel hücre popülasyonlarından toplam RNA'yı izole etmek.
- İyi huylu ve hastalıklı dokular arasında RNA ekspresyonunu analiz etmek.
- Gen ekspresyon analizleri aracılığıyla prostat kanseri hakkındaki anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Lazer-capture mikro-diseksiyon tekniği.
- Dondurulmuş prostat doku örneklerinden RNA izolasyonu.
- Prosedür sırasında RNA kalitesini korumak için kritik adımlar.
- Doku işleme için soğutulmuş forseps ve montaj ortamının kullanımı.
Ana Sonuçlar
- Spesifik hücre popülasyonlarından yüksek kaliteli RNA'nın başarılı bir şekilde izole edilmesi.
- Çeşitli doku örneklerinde RNA ekspresyon profillerini ayırt etme yeteneği.
- Araştırmada lazer-capture mikro-diseksiyonun etkinliğinin gösterilmesi.
- Klinik denemelerde hasta örneklerinin analizinde iyileştirilmiş analiz potansiyeli.
Sonuçlar
- Lazer-capture mikro-diseksiyon, prostat kanseri araştırmaları için değerli bir araçtır.
- İzole edilen RNA, hastalık mekanizmalarına dair içgörüler sağlayabilir.
- Bu yöntem, heterojen dokuları etkili bir şekilde çalışma yeteneğini artırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Laser-capture microdissection (LCM) enables precise isolation of pure prostatic epithelial cell populations from heterogeneous tissue, directly addressing stromal bias in gene expression studies. This capability enhances predictive confidence in target validation and supports robust biomarker discovery for prostate cancer research. Integrating LCM-derived RNA analysis at early discovery and translational stages improves portfolio decision-making by reducing biological ambiguity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-type specific gene expression in benign versus diseased prostate tissue.
- Supports functional target validation by isolating homogeneous epithelial or stromal populations.
- Reduces confounding stromal signals, increasing predictive confidence in molecular findings.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying cell-type contributions to disease phenotypes.
Screening & Assay Development
- Provides validated RNA samples for downstream RT-qPCR and RNAseq workflows.
- Improves assay reproducibility by ensuring sample homogeneity and reducing variability.
- Enables standardization of gene expression assays across clinical and preclinical specimens.
- Supports reliable compound evaluation by linking molecular readouts to defined cell populations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene expression profiles with disease-relevant epithelial compartments for biomarker development.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by maintaining cell-type specificity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust, cell-specific molecular data.
- Supports translational research by providing high-quality RNA for clinical trial specimen analysis.
Pipeline & Workflow Integration
LCM-based RNA isolation fits at the interface of early discovery, target validation, and translational research, enabling seamless progression from hypothesis testing to preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing by isolating pure epithelial or stromal populations for differential gene expression analysis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNA samples for assay development and validation.
- Analytics: Provides high-quality molecular readouts for comparing benign and diseased tissue conditions.
- Translational Research: Maintains disease relevance by aligning molecular outputs with specific tissue compartments.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for cell-type specific RNA analysis across multiple studies and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of RNA-based assays.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, cryostat operation, and RNA preservation techniques.
- Demands access to LCM instrumentation and RNA analysis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for sample preparation and data interpretation.
- Adaptation may be needed for different tissue types or disease models.
- RNA integrity is highly sensitive to handling and environmental conditions.
