Name: Hücre Testi Mitoz Sonu Kromatin dekondenzasyon Eğitim için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Öğrenin mitoz sonu kromatin dekondenzasyonunu HeLa hücreleri ve Xenopus laevis yumurta ekstresi kullanarak hücre dışı testte yeniden oluşturmayı. Bu yöntem kromatin dinamikleri ve hücre döngüsü biyolojisi araştırmaları için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AKS 1 &amp; 2 Gelişimsel Cell 31 (3), Magalska yeniden basıldı edilir Şekil Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı ve ERC (wa için AN377 / 3-2 ve 309.528 CHROMDECON) ve Boehringer Ingelheim Fonds doktora Bursu ile desteklenmiştir ve diğ. mitoz, 305-318, 2014 yılı sonunda kromatin yoğunlaşması halinde, RuvB benzeri ATPazlar fonksiyonu, Elsevier tür izni ile.

<ol><li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220, 719-721 (1983).</li>
<li>de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+mitotic+chromosomes+in+Xenopus+egg+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg extract.</a> Methods Mol Biol. 119, 219-229 (1999).</li>
<li>Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+spindle+assembly+and+chromosome+condensation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).</li>
<li>Galy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+gp210+in+mitotic+nuclear-envelope+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A role for gp210 in mitotic nuclear-envelope breakdown.</a> J Cell Sci. 121, 317-328 (2008).</li>
<li>Chan, R. C., Forbes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+nuclear+assembly+and+nuclear+import+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).</li>
<li>Gillespie, P. J., Gambus, A., Blow, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+use+of+Xenopus+egg+extracts+to+study+DNA+replication+and+chromatin+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation and use of Xenopus egg extracts to study DNA replication and chromatin associated proteins.</a> Methods. 57, 203-213 (2012).</li>
<li>Gant, T. M., Wilson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear assembly.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 669-695 (1997).</li>
<li>Magalska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvB-like+ATPases+function+in+chromatin+decondensation+at+the+end+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">RuvB-like ATPases function in chromatin decondensation at the end of mitosis.</a> Developmental Cell. 31, 305-318 (2014).</li>
<li>Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+structure+and+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome structure and condensation.</a> Curr Opin Cell Biol. 18, 632-638 (2006).</li>
<li>Lavoie, B. D., Tuffo, K. M., Oh, S., Koshland, D., Holm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+condensation+requires+Brn1p%2C+the+yeast+homologue+of+Barren%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome condensation requires Brn1p, the yeast homologue of Barren.</a> Mol Biol Cell. 11, 1293-1304 (2000).</li>
<li>Philpott, A., Leno, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoplasmin+remodels+sperm+chromatin+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 69, 759-767 (1992).</li>
<li>Philpott, A., Leno, G. H., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+decondensation+in+Xenopus+egg+cytoplasm+is+mediated+by+nucleoplasmin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sperm decondensation in Xenopus egg cytoplasm is mediated by nucleoplasmin.</a> Cell. 65, 569-578 (1991).</li>
<li>Burglin, T. R., Mattaj, I. W., Newmeyer, D. D., Zeller, R., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+nucleoplasmin+from+Xenopus+laevis+oocytes+and+analysis+of+its+developmental+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cloning of nucleoplasmin from Xenopus laevis oocytes and analysis of its developmental expression.</a> Genes Dev. 1, 97-107 (1987).</li>
<li>Whitaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+at+fertilization+and+in+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Calcium at fertilization and in early development.</a> Physiological reviews. 86, 25-88 (2006).</li>
<li>Gasser, S. M., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+the+isolation+of+individual+and+clustered+mitotic+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes.</a> Exp Cell Res. 173, 85-98 (1987).</li>
<li>Eisenhardt, N., Schooley, A., Antonin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+in+vitro+assays+to+analyze+the+function+of+transmembrane+nucleoporins+and+targeting+of+inner+nuclear+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus in vitro assays to analyze the function of transmembrane nucleoporins and targeting of inner nuclear membrane proteins.</a> Methods Cell Biol. 122, 193-218 (2014).</li>
<li>Wignall, S. M., Deehan, R., Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+condensin+complex+is+required+for+proper+spindle+assembly+and+chromosome+segregation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts.</a> J Cell Biol. 161, 1041-1051 (2003).</li>
<li>Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+formation+of+nucleus-like+structures+around+bacteriophage+DNA+microinjected+into+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs.</a> Cell. 34, 13-23 (1983).</li>
<li>Hartl, P., Olson, E., Dang, T., Forbes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+assembly+with+lambda+DNA+in+fractionated+Xenopus+egg+extracts%3A+an+unexpected+role+for+glycogen+in+formation+of+a+higher+order+chromatin+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear assembly with lambda DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate.</a> J Cell Biol. 124, 235-248 (1994).</li>
<li>Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+repression+by+nucleosomes+but+not+H1+in+reconstituted+preblastoderm+Drosophila+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Transcriptional repression by nucleosomes but not H1 in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin.</a> EMBO J. 13, 373-379 (1994).</li>
<li>Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+membrane+protein-DNA+interactions+required+early+in+nuclear+envelope+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly.</a> J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).</li>
<li>Zhang, C., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin-independent+nuclear+envelope+assembly+induced+by+Ran+GTPase+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin-independent nuclear envelope assembly induced by Ran GTPase in Xenopus egg extracts.</a> Science. 288, 1429-1432 (2000).</li>
<li>Paulson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+chromosome+clusters+from+metaphase-arrested+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Isolation of chromosome clusters from metaphase-arrested HeLa cells.</a> Chromosoma. 85, 571-581 (1982).</li>
<li>Ramadan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc48%2Fp97+promotes+reformation+of+the+nucleus+by+extracting+the+kinase+Aurora+B+from+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin.</a> Nature. 450, 1258-1262 (2007).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Xenopus Yumurta ekstreleri sadakatle in vitro hücresel süreçleri yeniden üretmek için çok yararlı bir araç olduğunu laevis ve bu sistem başarıyla hücre döngüsü ve hücre bölünmesi olayları 2, 3,5,6,17 karakterizasyonu kullanılmıştır. Nedeniyle Oogenezinde sırasında yumurta münzevi nükleer parçaların büyük mağazalar, yumurta ekstreleri hücresel bileşenleri mükemmel bir kaynağıdır. Memeli doku hücre hatları veya genetik manipülasyon RNAi gibi diğer yaklaşımlar karşılaştırıld...

Xenopus laevis yumurta ekstraktı, hücre içermeyen tahlil basitliği karmaşık hücresel olayları incelemek için güçlü ve geniş ölçüde uygulanan bir araçtır. Lohka ve Masui 1 ile ilk bilgi oldukları için yaygın olarak bu kromatin yoğunlaşması 2, spiralin bir araya gelmesi 3, çekirdek zarı arıza 4 değil, aynı zamanda Nükleositoplazmik taşıma 5 ya da DNA replikasyonu 6 gibi mitotik süreçleri incelemek için kullanılmıştır. Nükleer zarf Reformasyon ve nükleer gözenek kompleksi tekrar monte olarak interphasic çekirdeğinin reform için gerekli mitoz sonunda gerçekleşen olaylar, erken mitotik olaylara nazaran anladığınızı daha az ama benzer Xenopus yumurta özü 7 kullanılarak incelenebilir. Biz son zamanlarda mitoz 8 yılı sonunda kromatin yoğunluk azaltılmasından okumak için Xenopus yumurta özü dayalı bir tahlil kurduk, bir altı-incelenmiştir süreç i bekliyor olduğunuAyrıntılı karakterizasyonu ts. Metazoan&#39;da olarak, kromatin yüksek genetik materyalin sadakatle ayrılmasını gerçekleştirmek için, mitotik girişinde yoğunlaştırılır. Kromatin interfaz sırasında gen ifadesi ve DNA replikasyonu için erişilebilir olduğundan emin olmak için, mitoz sonunda de-sıkıştırılmış olması gerekir. Omurgalılarda, kromatin kadar mitotik sıkıştırma genellikle çok daha düşük olan mayalar aksine, S., örneğin, sadece iki kat interfaz 9 göre mitoz sırasında daha fazla sıkıştırılmış elli misli cerevisiae 10. Omurgalı kromatin Dekondenzasyon çoğunlukla yumurta döllenmeden sonra sperm DNA yeniden düzenlenmesi bağlamında ele alınmıştır. Moleküler bir mekanizma, hangi nükleoplasmin, bol oosit proteini, yumurta saklanan histon H2A ve H2B sperm özgü protaminler değiştirir. Bu süreç aynı zamanda Xenopus yumurta özü 11, 12 kullanılarak aydınlatılmıştır. Bununla birlikte, sentezlemenükleoplasmin bu sperm özgü protaminler içermeyen oosit 13 ve mitotik kromatine sınırlıdır. Dolayısıyla mitoz sonunda yoğunluk azaltılmasından kromatin 8 bağımsız nükleoplasmin olduğunu. In vitro Dekondenzasyon reaksiyonu için biz senkronize HeLa hücrelerinden izole aktif X. laevis yumurta ve kromatin kümelerden oluşan özü kullanır. Bir kalsiyum iyonofor ile yumurta tedavisi döllenme sırasında sperm girişi tarafından oluşturulan oosit içine kalsiyum salınımını taklit eder. Kalsiyum dalgası ilk interfaz 14 ilerler, mayoz ikinci metafaz tutuklandı hücre döngüsü yeniden başlamasını ve yumurta, tetikler. Bu nedenle, form aktive yumurta hazırlanan yumurta ekstreleri mitotik çıkış / interfaz durumunu temsil ve kromatin yoğunlaşması, nükleer zarf gibi mitotik çıkış için belirli olayları uyarmak için yetkili ve karmaşık reform gözenek. Mitotik ch izolasyonu içinkümeler romatin biz kromozom kümeleri HeLa hücrelerinde mitoz senkronize ve degrade santrifüj ile poliamin içeren tamponlar izole gelen lizis tarafından yayımlanan Gasser &amp; Laemmli 15, yayınladığı protokol biraz değiştirilmiş bir versiyonu kullanılmış.

<table><tbody><tr><td>spermin tetrahidroklorür</td><td>Fluka analitik</td><td>85610-25G</td><td></td></tr><tr><td>spermidin trihidroklorür</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S2501-5G</td><td></td></tr><tr><td>yüksek saflıkta digitonin</td><td>Millipore</td><td>300410-1GM</td><td>toksik</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Uygulaması</td><td>A0999,0100</td><td>toksik</td></tr><tr><td>timidin</td><td>Calbiochem</td><td>6060</td><td></td></tr><tr><td>nokodazol</td><td>Calbiochem</td><td>487928</td><td>toksik</td></tr><tr><td>% 37 formaldehit çözeltisi</td><td>Roth</td><td>7398-1</td><td>toksik</td></tr><tr><td>tripan mavisi çözeltisi (% 0.4) </td><td>) Sigma</td><td>T8154</td><td>toksik</td></tr><tr><td>1,4-ditiotreitol (DTT)</td> <td>Roth</td><td>6908.2</td><td></td></tr><tr><td>AEBSF hidroklorür</td><td>Applichem</td><td>A1421,0001</td><td></td></tr><tr><td>pepstatin</td><td>Roth</td><td>2936.1 / 2/3</td><td></td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Roth</td><td>CN334</td><td></td></tr><tr><td>aprotinin</td><td>Roth</td><td>A162.3</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (kolloidal silika parçacıkları çözüm)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&sup2; doku kültürü şişeleri</td><td>Greiner Bio-one</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Homojenizatör (40 ml doku öğütücü)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer odası</td><td>Asistan</td><td>441/1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Oak Ridge Santrifüj Tüpleri, polikarbonat (50 ml)</td><td>Nalgene</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>100 & mikro; m hücre süzgeci, naylon</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>sitokalasin B</td><td>Uygulaması</td><td>A7657,0010</td><td>toksik</td></tr><tr><td>sikloheksimid</td><td>Roth</td><td>8682.3</td><td>toksik</td></tr><tr><td>L-sistein</td><td>Merck</td><td>1.028.381.000</td><td></td></tr><tr><td>hCG Ovogest</td><td>MSD</td><td>1431593</td><td></td></tr><tr><td>PMSG olarak mevcuttur Intergonan</td><td>MSD</td><td>olarak mevcuttur 1431015</td><td></td></tr><tr><td>A23187 (karışık kalsiyum-magnezyum tuzu)</td><td>Enzo</td><td>ALX-450-002-M010</td><td>toksik</td></tr><tr><td>şırınga iğneleri (1,20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2")</td><td>Braun</td><td>4665120</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Serva</td><td>10920.03</td><td></td></tr><tr><td>GTP, 2 Na x 3 H20</td><td>Roth</td><td>K056.1/2/3/4</td><td></td></tr><tr><td>kreatin fosfat disodyum tuzu</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>kreatin fosfokinaz</td><td>Sigma</td><td>C3755-35KU</td><td></td></tr><tr><td>DMAP</td><td>Sigma</td><td>D2629-1G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI ve nbsp;</td><td>TLA</td> 100 için Roche <td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P-6148</td><td>toksik</td></tr><tr><td>santrifüj tüpleri (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 inç)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343775</td><td></td></tr><tr><td>"Cell-Saver" (geniş açıklıklı uçlar, 1.000 & mikro; l)</td><td>Biozym</td><td>729065</td><td></td></tr><tr><td>%50 glutaraldehit çözeltisi, derece I</td><td>Sigma alderich</td><td>G7651-10 ml</td><td>toksik</td></tr><tr><td>% 0.1 (a/h) poli-L-lizin çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>P8920-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>düz tabanlı tüpler (6 ml, 16.0 / 55 mm)</td> <td>Greiner Bio-one</td><td>145211</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield montaj ortamı</td><td>Vektör laboratuvarları</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>TLA120 için borular (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 inç)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>"Cell-Saver" (geniş açıklıklı uçlar, 200 & mikro; l)</td><td>Biozym</td><td>729055</td><td></td></tr><tr><td>12 mm lameller</td><td>Thermo Scientific</td><td>0784 #1</td><td></td></tr></tbody></table>

hücre testi mitoz sonu kromatin dekondenzasyon eğitim için

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

Omurgalı hücre döngüsü sırasında kromatin kapsamlı yapısal ve fonksiyonel değişikliklere uğrar. Mitotik girişte, mitotik iğ aparatı tarafından ayrı ayrı hareket ettirilen çubuk şeklindeki kromozomlara büyük ölçüde yoğunlaşır. Mitotik kromatin yoğunlaşması, interfazda olduğu gibi elli kat daha yoğun sıkıştırılmış kromozomlar verir. Mitozdan çıkış sırasında, kromozomlar, nükleer bir zarfla çevrili olan ve replikasyon ve transkripsiyon için yetkin olan fonksiyonel interfaz durumlarını yeniden kurmak zorundadır. Dekondensasyon süreci morfolojik olarak iyi tanımlanmıştır, ancak moleküler terimlerle tam olarak anlaşılamamıştır: Altta yatan moleküler olaylar ve büyük ölçüde ilgili faktörler ve bunların düzenlenmesi hakkında bilgi eksikliğimiz vardır. Burada, senkronize HeLa hücrelerinden saflaştırılmış mitotik kromatin kümelerine ve X. laevis yumurta ekstraktına dayalı olarak in vitro kromatin deyoğunlaşmasını aslına uygun olarak özetleyen hücresiz bir sistemi açıklıyoruz. Hücresiz sistemimiz, kromatin dekondensasyonunun daha fazla moleküler karakterizasyonu ve nükleer zarf ve gözenek kompleksinin yeniden birleştirilmesi gibi mitotik çıkış sırasında eş zamanlı olarak meydana gelen süreçlerle koordinasyonu için önemli bir araç sağlar.

Dekondenzasyon reaksiyon zamanı bağımlılığı Şekil 1 Dekondenzasyon deneyinin tipik bir zaman sürecini gösterir. Reaksiyonun başlangıcında görünen kromozomların küme decondenses ve tek, yuvarlak ve pürüzsüz çekirdek içine birleştirir. Yumurta özü sukroz ile ikame edildiğinde kromozom kümesi Dekondenzasyon aktivitesi yumurta ekstre içinde mevcut olduğunu göstermektedir ki, yoğunlaştırılmış kalır tampon. Kromatin Dekondenzasyon bir enerji bağımlı bi...

Yüksek derecede sıkıştırılmış mitotik kromatinin deyoğunlaşmasının moleküler mekanizmaları tam olarak tanımlanmamıştır. HeLa hücrelerinden izole edilen mitotik kromatin kümelerine ve in vitro dekondensasyon sürecini aslına uygun olarak yeniden oluşturan Xenopus laevis yumurta ekstraktına dayanan hücresiz bir test sunuyoruz.

Hücre Testi Mitoz Sonu Kromatin dekondenzasyon Eğitim için

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

Bu deneyin genel amacı, mitozun sonunda gerçekleşen kromatin dekondansasyonunu, hücre dışı bir deney sisteminin basitliğinde aslına uygun şekilde yeniden oluşturmaktır. Bu yöntem, kromatin dekondansasyonunun moleküler mekanizmasının karakterize edilmesine ve düzenlemede yer alan faktörlerin belirlenmesine olanak tanıdığı için mitoz araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, biyokimyasal olarak kolayca manipüle edilebilmesi ve kromatinin incelenebilmesidir.Dekolonizasyon, diğer hücre döngüsü olaylarından ayrılarak tek başına incelenebilir. Başlamak için, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı üzere, helo hücrelerinden mitotik kromatin kümelerini izole edin ve IIC xenopus lavis yumurta özütü hazırlamak için tamponları hazırlayın. Hazırlandıktan sonra, ovulasyon indüklenmiş kurbağaların içine 500 international unit insan koriyonik gonadotropini enjekte etmek için 27 gauge iğne takılmış beş mililitrelik bir şırınga kullanın.Yumurtlamayı başlatmak için, deneyden önceki akşam kurbağaların dorsal lenf kesesinin deri altına enjeksiyon yapın. İndüksiyon gerçekleştikten sonra kurbağaları, 1,2 litre mark's modified ringers buffer içeren bireysel tanklarda 18 °C'de 13 ila 17 saat boyunca tutun. Kurbağalar yumurtalarını bıraktıktan sonra, halihazırda aktifleşmiş olan yumurtaları ve kötü görünümlü tüm yumurtaları ayıklayın. Tankları 600 ila 1000 mililitrelik cam beherlere boşaltarak yumurtaları düzgün bir şekilde toplayın.Yumurtaların ayıklanması kritiktir çünkü genel ekstra kalitesi bu adıma bağlıdır. Aktive olmuş, ipliksi ve diğer yönlerden kötü görünümlü yumurtaları uzaklaştırın. Ayrıca sonraki adımlarda da kötü yumurtaları ayıklamaya devam edin.Yumurtalar çöktüğünde S süpernatanını dökün ve ardından beheri taze tamponla yeniden doldurun. Son yıkamayı takiben yumurtaları yıkamak için bu işlemi dört kez tekrarlayın. Süpernatanı bir kez daha uzaklaştırın ve ardından yumurtaları belirginleştirmek için beheri %2'lik sistein çözeltisi ile doldurun.İki ila dört dakika sonra, L cysteine içeren taze tampon ile değiştirin. Yumurtaların hacmi belirgin şekilde azaldığında ve yaklaşık beş ila yedi dakika sonra yumurtalar daha yoğun bir şekilde toplandığında koryon giderme işleminin tamamlandığını kabul edin. Ardından, tamponu doğrudan yumurtaların üzerine değil, beherin kenarından süzerek boşaltıp yeniden doldurma yöntemiyle yumurtaları mark's modified ringers buffer ile dikkatlice yıkayın.Ardından yumurtaları, 2 mg/mL konsantrasyonunda 8 µL kalsiyum iyonu içeren 100 mL Marx modifiyeli ringers tamponunda aktive edin. Hayvan kutup şapkası kontraksiyonu görünür hale geldiğinde aktivasyonu durdurun.Veya aktivasyondan 10 dakika sonra, yumurtaları Mark's modified Ringer's tamponu ile dikkatlice, tamponu döküp tekrar doldurarak yıkayın ve son yıkamadan sonra tamponu üstte bırakın. Yumurtaları oda sıcaklığında 20 dakika boyunca Mark's modified Ringer's tamponu içerisinde inkübe edin. Ardından, beş mililitrelik santrifüj tüplerini 50 µL sükroz tamponu ve 50 µL 100 kat proteaz inhibitörü ile hazırlayın.Beş µL 1 M DTT'yi, 12,5 µL cyclo heide'yi ve 2,5 µL cyto. B'yi karıştırın. Yumurtaları soğuk sakroz tamponu ile iki kez yıkayın ve ardından santrifüj tüplerine aktarın. Geniş ağızlı plastik bir pastör pipeti kullanarak, tüpleri 130 G'de bir dakika boyunca çevirerek yumurtaları paketleyin. Santrifüjden sonra, fazla tamponu plastik bir pastör pipeti ile alın ve kalan boş alanı daha fazla yumurta ile doldurun.Ardından, yumurta dolu tüpleri 5 mL'lik altılı sallantılı rotorla (swing rotor), 4 °C'de ve 21.000 ×g hızında 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Çözelti üç tabakaya ayrıldığında, 16 gauge iğneli 5 mL'lik bir şırıngayı tüpün yan tarafından iterek, üstteki sarı yumurta sarısı ile alttaki koyu renkli kırılmış yumurta kalıntıları arasındaki orta tabakaya yerleştirin. Düşük hızlı fazik özütü buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın ve ardından 100 katı konsantrasyonda proteaz inhibitöründen 10 µL ekleyin.1 µL 1 M DTT, 20 mg/mL konsantrasyonunda 2,5 µL cyclo heide ve 0,5 µL cyto B karıştırın. Düşük hızlı ekstraktın her mililitresine 10 mg/mL ekleyin. Düşük hızlı fazik ekstraktı, 10 x 2 mL'lik bir rotorda 355.000 ×g'de 12 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, üstteki lipid tabakasını dikkatlice uzaklaştırın ve yüksek hızlı ekstraktı içeren süpernatantı yeni bir tüpe aktarın.Bu adım, yüksek kaliteli bir örnek üretmek için kritik öneme sahiptir. Çekilen sıvının, üstteki lipid tabakasından veya rahatsız edici alt tabakadan kontaminasyon içermemesine dikkat edin. Yüksek hızlı ekstrakttan 18 µL'yi 1,5 mL'lik bir reaksiyon tüpüne pipetleyin ve ardından 0,5 µL glikojen ile 0,5 µL enerji karışımı ekleyin.0,3 µL dimethyl purine ve 0,7 µL mitotik kümeler ekleyin. Dekompanse olan kromatinin parçalanmasını önlemek için, kromatin eklendikten hemen sonra reaksiyonu karıştırmak amacıyla geniş ağızlı uçlar kullanın. Karıştırdıktan sonra, reaksiyon karışımını 20 °C'de iki saate kadar inkübe edin.Ardından, %4 paraldehit, %0,5 glutaraldehit ve 0,1 mg/mL dpi içeren 0,5 mL buz soğukluğundaki fiksatif ekleyerek örneği fikse edin. Geniş ağızlı uçlar kullanarak örneği buz üzerinde 20 ila 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, 12 mm'lik yuvarlak lamelleri %0,1 w/v poli-L-lizin çözeltisi ile kaplayın ve lamellerin afinitesini artırmak için beş dakika boyunca inkübe edin.Ardından, lamelleri filtre kağıdı üzerinde kurutun. Kuruduktan sonra, kaplanmış tarafı yukarı gelecek şekilde kaplı lamelleri altı mililitrelik düz tabanlı santrifüj tüplerinin tabanına yerleştirin. Daha sonra 800 µL %30 sükroz yastığı ekleyin ve sabitlenmiş örneğin tamamını üzerine katmanlar halinde yerleştirin.Numuneyi 4 °C'de ve 2.500 ×g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından S süpernatantını boşaltın ve 16 gauge bir iğne ile santrifüj tüpünün tabanına dikkatlice dokunarak lamelleri tüplerden çıkarın. Lamel iğne yardımıyla bir kenarından kaldırıldığında, lameli cımbızla alın, deiyonize suya daldırarak hızlıca yıkayın ve ardından kenarını filtre kağıdına değdirerek nazikçe kurulayın. Sonrasında, bir mikroskop lamı üzerine bir damla montaj medyumu damlatın ve lamelin numune tarafını üzerine indirin.Montaj medyumunun üzerine kaydırın. Lamelini kağıt havluyla nazikçe kurulayın, lamelin kenarlarını oje ile mühürleyin ve görüntüleme yapılana kadar lamı karanlıkta saklayın. Dekompansasyon analizinin tipik zaman çizelgesi şöyledir.Reaksiyonun başlangıcında görülebilen kromozom kümesi, dekondanse olur, yoğunlaşır ve tek, yuvarlak ve pürüzsüz bir çekirdeğe dönüşür. Yumurta özütü sükroz tamponu ile değiştirildiğinde kromozom kümesi yoğunlaşmış halde kalır; bu durum, yumurta özütünde dekompansasyon aktivitesinin bulunduğunu göstermektedir. Burada gösterilen deneyde, reaksiyona hidrolize olmayan ATP veya GTP analogları eklenmiştir.Bu katkı maddelerinin her ikisi de dekondansasyonu inhibe ederek, bu aktif sürecin hem ATP hem de GTP hidrolizine bağımlı olduğunu kanıtlamaktadır. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, Singapur düzeyleri yumurta ekstraktı hazırlama işlemi yaklaşık iki saatte, dekondansasyon deneyi ise üç saatte tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, başarının kritik düzeyde ekstrakt kalitesine bağlı olduğunu unutmamak önemlidir.Özellikle immün depleksiyonda, bu prosedür takip edilerek taze hazırlanmış ekstrakt kullanılması önerilir. Hangi faktörlerin dahil olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için immün depleksiyonda olduğu gibi diğer yöntemler ve rekombinant proteinlerin eklenmesi gerçekleştirilebilir. Bu teknik, mitoz veya nükleer yapı ve fonksiyon alanlarındaki araştırmacıların, hayvan hücrelerinde mitozun sonunda gerçekleşen kromatin dehumanizasyonunu keşfetmelerinin yolunu açacaktır.Bu videoyu izledikten sonra, xenopus karaciğer yumurta ekstraktlarının nasıl hazırlanacağı ve kromatin dekolonizasyonunu yeniden oluşturmak için bu yöntemin nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Paraformaldehit ve DARPA ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve eldiven giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

a-cell-free-assay-to-study-chromatin-decondensation-at-end

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi için kullanılan bir...

Kromatin Etkileşimler haritalama ve Transkripsiyon Yönetmelik anlamak için paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi

Geçiş anafaz-teşvik kompleksi (APC / C)-bağımlı ubikuitinasyon ve burada siklin B. sonraki yıkım, biz, darbe-kovalamaca etiketleme sonrasında, bir sistem kurulmuş tüm hücre popülasyonlarında siklin B proteoliz izleme sağlar ve tetiklenir anafaz için metafaz mitotik geçiş noktasından müdahale tespitini kolaylaştırır.

Tüm Cep Populasyonlarının Tek Hücre Düzeyinde Siklin B Proteoliz incelenmesi

Bu protokol, DNA hasarının yanı sıra, mitoz sırasında lokalizasyonu cevap olarak aktive bir çift iplikli DNA mola sinyal protein görüntülenmesi için bir yöntem açıklanır.

DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme

Bu videoda, mikrokokal nükleaz enzimatik sindirimi kullanarak kromatin kesme protokolü açıklanmaktadır. Kromatin kesme, insan kronik miyeloid lösemi hücrelerinde protein-DNA etkileşimini araştırmaya yardımcı olan Kromatin immünopresipitasyonu veya ChIp iş akışında önemli bir adımdır. Özellik protokolünde kromatin kesme, sonikasyon kullanılarak gerçekleştirilir.

Kromatin kesme: Enzimatik sindirim kullanarak kromatin parçaları oluşturmak için bir yöntem

Biz primer T hücreleri kullanarak kromatin immunoprecipitation için bir sağlam bir yöntem tarif. Metodu standart yaklaşımlar üzerine kurulmuştur, ama hücrelerin sınırlı bir miktarda için verimliliği artırmak koşulları ve reaktifler belirli bir kümesi kullanır edilir. Önemli olarak, veriler analiz aşaması bölgesinin, bir ayrıntılı bir açıklama sunulmaktadır edilir.

Biyokütle Limit Tutarlar kullanarak Verimli Kromatin Immunoprecipitation

Oogenesis memelilerde özellikle kromozom missegregation nedeniyle hataya, olduğu bilinmektedir. Bu el yazması için fare profaz, yaymak Kromatin hazırlama yöntemleri açıklar metafaz ı ve II sahnelenen yumurtalar. Bu temel teknikler Kromatin bağlı proteinler ve kromozom morfolojisi memeli oogenesis boyunca çalışma sağlar.

Kromatin fare oosit ilerleme profaz metafaz II analizi için hazırlıklar yaymak

Nükleer mimari plastisite kodlamayan RNA'ların, DNA metilasyonu, nucleosome yeniden konumlandırma gibi Histon kompozisyon ve değiştirme işlemleri de dahil olmak üzere dinamik epigenetik mekanizmalar tarafından kontrol edilir. Burada tekrarlanabilir, ucuz ve basit bir şekilde Kromatin erişilebilirlik belirlenmesi sağlayan bir Formaldehyde-Assisted yalıtım, Düzenleyici öğelerini (dürüst) protokolünü açıklar.

Düzenleyici elemanlarının ölçü Kromatin erişilebilirlik memeli hücrelerinde formaldehit destekli izolasyon

Canlı hücre görüntüleme bilgi hazinesi tek hücreler veya tüm nüfus üzerinde ulaşılamaz olan sabit hücre tek başına Imaging tarafından sağlar. Burada, hücre kader kararlar tedavi Anti-Mitotik uyuşturucu Paklitaksel ile aşağıdaki değerlendirmek için canlı hücre görüntüleme iletişim kuralları açıklanır.

Uzun vadeli canlı hücre kader Paklitaksel karşılık olarak değerlendirmek için Imaging hücreli

Bu iletişim kuralı etiket ve canlı kromozomlar Mitotik hücre Histone2B-GFP BacMam 2.0 etiket ve bir iplik kaset confocal mikroskobu sistemi kullanarak görselleştirmek için basit ve uygun bir yöntem açıklanır.

Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme

Chromatin immünoprecipitation (ChIP) gen yönetmeliğinin moleküler mekanizmalarını anlamak için güçlü bir araçtır. Ancak, yöntem mekanik kesme tarafından tekrarlanabilir kromatin parçalanma elde zorlukları içerir. Burada, enzimatik sindirim kullanarak bir çip tahlil için geliştirilmiş bir protokol sağlar.

Mammalin hücrelerinde Micrococcal Nüklenleri kullanarak kromatin Immünopmamitasyon tahlil

Hızlandırılmış mikroskopi, tomurcuklanan mayadaki mayozu incelemek için değerli bir araçtır. Bu protokol, mayotik kromozom ayrışması sırasında belirli bir proteinin işlevinin nasıl çalışılacağını göstermek için hücre döngüsü senkronizasyonunu, hızlandırılmış mikroskopiyi ve bir hedef proteinin koşullu tükenmesini birleştiren bir yöntemi açıklar.

S. cerevisiae'de Mayozu İncelemek için Hızlandırılmış Mikroskopi ve Proteinlerin Aşamaya Özgü Nükleer Tükenmesinin Kullanılması

Öğrenin mitoz sonu kromatin dekondenzasyonunu HeLa hücreleri ve Xenopus laevis yumurta ekstresi kullanarak hücre dışı testte yeniden oluşturmayı. Bu yöntem kromatin dinamikleri ve hücre döngüsü biyolojisi araştırmaları için değerlidir.

Hücre Testi Mitoz Sonu Kromatin dekondenzasyon Eğitim için

Daha fazla video keşfet