Petrol Emülsiyonlar Su: Hidrofobik Pigmentler ile Suda çözünür Klorofil bağlayıcı Proteinler Montaj için Yeni Bir Sistem

Bu tekniğin genel amacı, suda çözünmeyen klorofillerin suda çözünür proteinlerin bağlanma bölgelerine dahil edilmesini sağlamaktır. Bu yöntem, klorofillerin rekombinant proteinlerle birleştirilmesini sağlar, bu da klorofil-protein etkileşimlerinin titiz çalışmalarına izin verir ve yeni klorofil-protein kompleksleri oluşturmak için yeni olanaklar açar. Bu tekniğin temel avantajı, proteinlerin etiketlenmesini veya hareketsiz hale getirilmesini gerektirmemesidir.

Bu nedenle, tarama testleri için çok uygundur. Prosedürü göstermek, araştırma grubumda bir doktora sonrası olan Dominica Bednarczyk olacak. Aşağıdaki stok çözeltilerini hazırlarken, fotoğraf hasarını en aza indirmek için tüm klorofil hazırlama adımlarını kimyasal bir başlık altında, yeşil ışık altında veya karanlıkta gerçekleştirin.

Pigmentleri depolama için dondurmadan önce daima nitrojen veya argon ekleyin ve tüm çözücülerin analitik kalitede olduğundan emin olun. Başlamak için, yaklaşık beş gram liyofilize Spirulina platensis hücresi veya tilakoid zarlarda sadece klorofil a veya klorofil-a içeren diğer siyanobakteri hücrelerini tartın ve ezmek için bir havan ve havan tokmağı kullanın. Klorofil ekstraksiyonu sırasındaki kritik adım, siyanobakteri hücrelerinin tamamen liyofilize edildiğinden emin olmak ve aseton ile birkaç yıkama ile DEAE-Sepharose'dan suyun tamamen uzaklaştırılmasını sağlamaktır.

Ezilmiş hücreleri bir cam sütuna yükleyin ve yaklaşık 50-100 mililitre% 100 aseton ile karotenoidleri çıkarmak için dokuyu yıkayın. Yıkadıktan sonra, ayrıştırılmış turuncu-yeşil fraksiyonu atın. Gerçek renk, siyanobakteri kültürüne ve büyüme koşullarına bağlı olarak turuncu-yeşilden yeşile değişebilir.

Asetonu %100 metanol ile değiştirin ve klorofil a içeren yeşil fraksiyonu toplayın. Ayrıştırılan fraksiyonun rengi koyu yeşilden soluk yeşile döndüğünde, elüsyonu durdurun. Daha sonra, 30 santigrat dereceyi aşmayan bir su banyosuna sahip döner bir buharlaştırıcı kullanarak, ekstrakt tamamen kuruyana kadar metanolü buharlaştırın, ardından kurutulmuş ekstraktlardan pigmentleri tamamen çözmek için küçük bir hacimde dietil eter kullanın ve çözeltiyi pamuk yününden süzün, pigmentleri pamuk yününden yıkamak için ek küçük hacimde eter kullanarak.

Pigmentler tamamen kuruyana kadar dietil eteri buharlaştırın. Bu noktada durursanız, kuru pigmentleri nitrojen veya argon altında karanlıkta 20 santigrat derecede tutun. Klorofil bir preparat ile devam etmek için, kuru pigmentleri mümkün olan en küçük hacimde% 100 aseton olarak kısmen çözün, daha sonra süspansiyona 4 mililitre aseton ekleyin ve pigmentleri tamamen çözmek için şişeyi döndürün.

Bir Pasteur pipeti kullanarak numuneyi nazikçe %100 asetonda dengelenmiş bir DEAE-Sefaroz kolonuna yükleyin ve %100 aseton ile karotenoidleri elüte edin. Ardından, klorofil a'yı elüte etmek için 3: 1 hacim-hacim aseton-metanol karışımı kullanın. Gerçek pigment renklerini gözlemlemek için elüsyon sırasında sütunu kısaca aydınlatmak için bir el feneri kullanabilirsiniz.

İnce tabaka kromatografisi ile, numuneyi elüte etmek için 68:25:5:2 hacim-hacim diklorometan ve heksan, izopropanol ve metanol kullanarak klorofilin saflığını doğrulayın. Daha sonra, döner bir buharlaştırıcı kullanarak, klorofil a tamamen kuruyana kadar çözücüyü buharlaştırın. Bir klorofil hazırlamak için, bir stok çözeltisi, kuru klorofil a'yı 2-4 mililitre% 100 metanol içinde yeniden çözün.

Emülsiyonun organik fazını hazırlamak için, 50 mililitrelik bir tüpte 0.2 gram Tween 80, 1.8 gram Span 80 ve 38 gram mineral yağ ağırlığındadır. Bileşenleri iyice karıştırın ve çözeltiyi soğuması için buzun üzerine koyun. Saflaştırılmış suda çözünür klorofil bağlayıcı protein veya WSCP içeren sulu bir faz hazırlamak için, WSCP genini içeren E.coli BL21 bakterilerini 37 santigrat derecede 1 litre LB ortamında 0.3 ila 0.6'lık bir OD600'e büyütün.

Protein ekspresyonunu indüklemek için 1 milimolar IPTG ekleyin ve bakterileri 12-16 saat boyunca 30 santigrat derecede büyütün, ardından bakterileri 5000 G ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleme ile hasat edin. Afinite kromatografisi için uygun bir tampon ile peleti çözün, bakteri süspansiyonunu daha küçük tüplere aktarın ve buz üzerinde sonikat yapın. Lizatı döndürdükten sonra, üreticinin talimatlarını izleyerek protein saflaştırması için ticari olarak mevcut uygun afinite kromatografi sistemini kullanarak rekombinant etiketli WSCP proteinlerini saflaştırın.

Tamponu 50 milimolar fosfat tampon pH 7.8 ile değiştirerek ve saflaştırılmış WSCP konsantrasyonunu mililitre başına 0.5 ila 1 miligram olarak ayarlayarak emülsiyonun sulu fazını hazırlayın. WSCP ile ham bakteri lizatı içeren sulu bir faz hazırlamak için, günlük fazına 37 santigrat derecede 250 mililitre LB içinde WSCP eksprese eden bir plazmit içeren E.coli BL21 hücrelerini büyütün. Protein ekspresyonunu indüklemek için 1 milimolar IPTG ekleyin ve bakterileri gece boyunca 30 santigrat derecede büyütün.

Ertesi gün, bakteri hücreleri toplandıktan sonra, peleti çözmek için 1-2 mililitre 50 milimolar sodyum fosfat tamponu pH 7.8 kullanın. Daha sonra, sonikasyondan sonra, lizatı 30 dakika boyunca 12.000 G ve 4 santigrat derecede santrifüjleyin. 0.125 mililitre süpernatanı 0.875 mililitre 50 milimolar sodyum fosfat tamponu pH 7.8 ile karıştırarak emülsiyonun sulu fazını hazırlayın.

WSCP'yi emülsiyonda klorofil a ile birleştirmek için, 5 mililitre iyice karıştırılmış bir yağ yüzey aktif madde karışımını bir cam şişeye aktarın ve buz üzerinde soğutun. Yeni hazırlanmış 1 mililitre buz gibi soğuk sulu faz ekleyin ve her iki fazı karıştırmak için buz üzerinde iki dakika boyunca 9.500 RPM'de bir doku homojenizatörü kullanın. Bu noktadan itibaren, fotohasarı en aza indirmek için tüm adımları yeşil ışık altında gerçekleştirerek, emülsiyona 20 mikrolitre 25 milimolar klorofil bir stok çözeltisi ekleyin.

Klorofil a'nın emülsiyon içinde eşit olarak dağılmasını sağlamak için cam şişeyi hafifçe vurarak ve ters çevirerek dağıtın, ardından karanlıkta 1-2 saat buz üzerinde inkübe edin. Emülsiyon hazırlama sırasındaki kritik adım, karıştırmadan önce hem su fazını hem de organik fazı soğutmaktır. Daha sonra, emülsiyonu parçalamak ve su damlacıklarını organik fazdan ayırmak için, emülsiyonu 1.5 mililitrelik plastik tüplere aktarın ve oda sıcaklığında 14.000 G'de beş dakika santrifüjleyin.

Üst yağ fazını atın ve alt faza 1 mililitre mineral yağ ekleyin, ardından girdaplama veya tüpü çevirerek iyice karıştırın. Numuneyi döndürdükten sonra, üst yağ fazını çıkarın ve sulu ve mineral yağ fazlarını bir ara emülsiyon olmadan ayıran berrak bir menisküs elde edilene kadar mineral yağ ve santrifüjleme ilavesini tekrarlayın. Şimdi, sulu faza 1 mililitre suya doymuş dietil eter ekleyin.

Daha sonra, numuneyi girdapladıktan sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 14.000 G'de döndürün. Üçüncü santrifüjlemeden sonra, davlumbazda, dietil eteri çıkarın ve tüpleri 5-20 dakika açık bırakın. Son olarak, WSCP-klorofil a kompleksini içeren sulu fazı bir tuzdan arındırma kolonuna yükleyin ve gelecekteki deneyler için uygun bir tampon ile elüte edin.

Numuneyi 4 santigrat derecede ışıktan uzakta bir aya kadar saklayın. Bu videoda açıklanan protokol kullanılarak, rekombinant WSCP apoproteinleri, su ve yağ emülsiyonlarında klorofil a ile birleştirildi. Burada, dört rekombinant WSCP varyantına sahip klorofil a komplekslerinin absorbansları ve CD spektrumları gösterilmektedir.

Sonuçlar, bant şeklindeki son konumda, ilgili doğal komplekslerin daha önce bildirilen spektrumlarına benzer. Bu şekil, sulu fazın yeşil rengiyle görüldüğü gibi, WSCP eksprese eden hücrelerden lizatlarda WSCP'nin klorofil a ile pozitif montajını göstermektedir. Bu sonuç, WSCP'lerin klorofillerle pozitif montajı için hızlı bir tarama sistemi olarak su ve yağ emülsiyonlarının potansiyelini göstermektedir.

Burada gösterildiği gibi, WSCP içeren lizatların damlacıkları, konfokal mikroskop görüntülerinde belirgin klorofil bir floresan özelliğine sahiptir. Bu, WSCP-klorofil komplekslerinin başarılı bir şekilde birleştirilmesinin doğrudan su damlacıklarında tespit edilebileceği ve su ve yağ emülsiyonu bazlı tarama sistemleri için bir temel sağlayabileceği anlamına gelir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa beş saat boyunca yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, klorofilleri ışığa ve oksijene maruz bırakmadan klorofillerle çalışmanın hızlı bir şekilde yapılması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, protein ortamının klorofillerin elektrolitik ve spektral özellikleri üzerindeki etkisini araştırmak için kullanılan çok çeşitli suda çözünür klorofil bağlayıcı proteinler hazırlamamızı sağladı. Bu videoyu izledikten sonra, siyanobakterilerden klorofillerin nasıl ekstrakte edilip saflaştırılacağını ve su ve yağ emülsiyonları kullanılarak suda çözünür proteinlerde nasıl birleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Eter, metanol veya aseton gibi organik çözücülerle çalışmanın zararlı olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman kimyasal bir başlıkta çalışmak gibi önlemler alınması gerektiğini unutmayın.