Yara Scratch Testi optimizasyonu Çözünür Sigara Duman Özü ile Hasar sonrası Fare Mezenkimal Stromal Hücre Göç Değişiklik Algılama

Bu testin genel amacı, çözünür sigara dumanı ekstraktı ile hasar gördükten sonra akciğer mezenkimal stromal hücrelerinin göç kapasitesindeki değişiklikleri tespit etmektir. Bu yöntem, akciğer progenitör hücrelerinin göç kapasitesinin akciğer onarımına yardımcı olmak için nasıl geliştirilebileceği de dahil olmak üzere, akciğer rejeneratif biyolojisi alanındaki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin ana avantajı, hücre göçü için daha iyi kantitatif ölçümler sağlamak üzere optimize edilmiş olması, aynı zamanda gerçekleştirmesi ekonomik ve bizi özelleştirmesi kolay olmasıdır.

Bu gösteride, çizik testi, murin akciğer mezenkimal stromal hücrelerinin veya MSC'lerin göç kapasitesini ölçmek için kullanılacaktır. Çözünür sigara dumanı ekstraktına maruz kaldıktan sonra, MSC'ler 60 milimetrelik plakalar üzerinde tam ortamda büyütülür ve protokol metninde açıklandığı gibi hasar görür. Çizik tahlili için uygun bir birleşme önemlidir, çünkü görüntüleme yazılımının çiziğin sınırlarını doğru bir şekilde tanımlayabilmesini sağlar.

Bu örnek, steril bir ortamda çizilmeye uygun %95 birleşimde MSC'leri göstermektedir. Hasarlı MSC'lerin bulunduğu bir plakanın kapağını çıkarın ve plakanın üst kenarı boyunca sterilize edilmiş plastik bir cetvel gibi düz bir kenar yerleştirin. Düz bir kenar, daha sonra görüntüleme için mikroskop aşamasına yerleştirildiğinde plaka için gereken dönme ayarlamalarının miktarını en aza indirir.

Ortamı çıkarmadan, plaka boyunca yaklaşık beş milimetre aralıklı ve 50 milimetre uzunluğunda dört paralel çizik yapmak için steril düz kenar tarafından yönlendirilen steril bir 200 mikrolitrelik pipet ucu kullanın. 60 milimetrelik bir plaka üzerinde birden fazla çizik oluşturmak, mikro çevreyi MSC'ler için hücre göçünü etkileyecek şekilde değiştirmez, ancak diğer hücre tipleri için dikkate alınabilir. Ortamı aspire edin ve plakayı iki mililitre ön ısıtma tam ortamıyla nazikçe yıkayın.

Bu, hücrelerin çizik merkezine yapışmasını önler ve çizik nedeniyle gevşemiş hücreleri uzaklaştırır. Steril, kalıcı bir işaretleyici etiket kullanarak dört mililitre taze tam ortamla değiştirin, her çizik plakanın alt tarafında, görüntülemeyi engellemeyecek yerlerde bir ila dört çizik. Çizikler Her çiziğin ilk görüntüleri alınmalıdır, çünkü çizik genişliğinde farklılıklar olabileceğinden, aynı çizikten alınan görüntülerin migrasyondan önce ve sonra karşılaştırılması önemlidir.

Çizik tahlili birden fazla plaka üzerinde gerçekleştirilirse, bir sonraki plakada çizikler yapılmadan önce tek bir plaka üzerindeki tüm çiziklerin ilk görüntülerinin alınması önerilir. Analiz için gerekli görüntüleri elde etmek için kameralı ters faz kontrast mikroskobu kullanın. Kültür plakasını mikroskobun üzerine yerleştirin ve çiziği bulmak için düşük güç objektifini kullanın.

Bir numara. Çiziğin ekranda tamamen yatay görünmesi, çiziği tamamen yatay ve görüş alanının merkezinde tutarken, çizik uzunluğunun %90'ını kapsayacak şekilde gerektiği kadar çok görüntü elde edilmesi zorunludur. Görüntüler arasında çakışma olmadan çiziğin farklı bölümlerinden görüntüler elde edin.

Çizik uzunluğunun ilk ve son %5'lik kısmından görüntü almayın çünkü kültür kabının kenarlarındaki ışığın kırılması görüntüleri aşırı açığa çıkarır ve analiz edilmelerini imkansız hale getirir. Görüntüleri sıfırdan, bir klasörde bir numara olarak kaydedin. İki, üç ve dört çizikler için aynı şekilde görüntüler elde edin ve her çizikteki görüntüleri ayrı bir klasöre kaydedin.

Bu ilk görüntülemeden hemen sonra plakaları inkübatöre geri koyun. Bu teste başlamadan önce hücrelerin dört ila yedi saat göç etmesine izin verin. Image J yazılımını indirin ve yara iyileştirme aracı eklentisini yükleyin.

Görüntü dosyasını görüntü J'de açın, ardından işleme tıklayın ve yara iyileştirme aracı için çiziği çevreleyen hücreleri vurgulamak için kenarları bulun. Karalama alanını hesaplamak için görüntü ayarı ve renk eşiğine tıklayın ve eşik rengi etiketli açılır menüde, renk eşiği menüsünde değeri BNW olarak değiştirin. Görüntüyü tamamen siyah yapmak için alt kaydırıcıyı tamamen sağa hareket ettirin ve ardından çizik ile hücre önü arasında maksimum kontrast oluşturmak için üst kaydırıcıyı ayarlayın.

Görüntü çiziğin konturunu net bir şekilde gösterene kadar üst parlaklık kaydırıcısını soldan sağa yavaşça ayarlayın. Çiziğin kenarları belirlendikten sonra, daha fazla araç'a tıklayın. Görüntü J araç çubuğunda, açılır menüden MRI yara iyileştirme aracını seçin ve çizik alanını vurgulamak ve hesaplanan alanın çıktısını almak için M düğmesine basın.

Sonuçlar açılır penceresinde, sonuçlar penceresindeki tüm sayıları kopyalayıp bir Excel elektronik tablosuna yapıştırın. Verileri tek tek çiziklerden ayırdığınızdan emin olun. Hücreler dört ila yedi saat boyunca yer değiştirdikten sonra, çizikler için görüntü elde etme prosedürünü tekrarlayın, plakaları çizildikleri sırayla görüntüleyin, böylece her plakadaki hücrelerin göç etmek için eşit zamanı olur.

Hücreler, hem sıcaklık hem de pH değişikliklerine duyarlılıklarına bağlı olarak birden fazla zaman noktasında görüntülenebilir. Son çizik görüntüleri daha sonra Görüntü J kullanılarak, ilk çizik görüntüleri için gösterildiği gibi analiz edilir. Çizik alanları, göçü ölçmek için de hesaplanabilir, doğru.

Izdiham, çizik testinin başarısı için kritik öneme sahiptir. Murin akciğer MSC'lerinin %95 birleşmede başarılı bir çiziği burada gösterilmiştir. Buna karşılık, %70'lik bir birleşme başarılı bir çizik için çok düşüktür ve yanlış sınırlar oluşturabilir.

Bunlar, görüntüleme yazılımı tarafından tanımlandığı şekilde karşılık gelen çizik alanı sınırlarına sahip temsili geçiş öncesi ve geçiş sonrası orijinal görüntülerdir. Bu grafikler, %0 veya %4 sigara dumanı ekstraktına maruz kalma ile migrasyondan önce veya sonra %95 birleşmede bir murin akciğer MSC plakası boyunca yapılan dört çiziğin her biri için piksel cinsinden hesaplanan ortalama çizik alanını gösterir. Çizik alanındaki hesaplanan ortalama değişimin karşılaştırılması,% 4 sigara dumanı ekstraktına maruz kaldıktan sonra murin akciğer MSC'sinin daha az migrasyonunu ortaya çıkardı.

Bu prosedürü denerken, birlikte çalıştığımız belirli hücre tipi için hücre birleşmesini optimize etmeyi ve dikkatli bir şekilde izlemeyi hatırlamak ve mümkün olduğunca homojen olduklarından emin olmak için çizikler oluşturma alıştırması yapmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, hücre göçünü etkileyebilecek değişiklikler ve protein ekspresyonu hakkında ek soruları yanıtlamak için immünohistokimya gibi diğer teknikler uygulanabilir.