Name: Ex Vivo Chick Serebellar Dilimleri Kültür ve Mekansal Elektroporasyon granül hücre öncülerinin Hedefli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Keşfedin tavuk serebellumunun dış granül tabakasına genetik modifikasyon için ex vivo elektroporasyon yöntemini. Bu teknik, granül hücre öncülerinin göç, proliferasyon ve farklılaşmasını inceleyerek gelişimsel nörobiyoloji araştırmalarına değerli bir çerçeve sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu makalede sunulan yöntem BBSRC BB / tarafından finanse edilen çalışma ortaya çıktı I021507 / 1 (TB, RJTW) ve MRC doktora öğrencilik (MH).

Not: Bütün deneyler King College London, İngiltere ve İngiltere Home Office hayvan bakımı kurallarına uygun gerçekleştirilmiştir. E14 Serebellumunda 1. Diseksiyon <ol><li> Embriyonik Gün 14-38 ° C&#39;de kahverengi döllenmiş tavukların yumurtalarını kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Kullanımı yumurta makas ovo civciv embriyo başını kesmek ve buz PBS (Şekil 1A) içeren bir Petri baş kaldırmak. </li><li> Standart forseps kullanarak, gözleri ve üst çene kaldırma, doku içinden her gözün arkasında tüm yol kesiler yapmak. Tüm yol alt çene (Şekil 1B) çıkarılması farenks yoluyla ikinci bir kesi yapmak. </li><li> Standart forseps kullanarak, (Şekil 1C) onu uzak soyulması ile kafatası yüzeyinden tüm cilt kaldırmak ve beyin açığa frontal ve parietal kemikler çıkarın. </li><li> Ventral açıdan, yutak kıkırdak ve yardımcı mezenşimi çıkarın. </li><li> Bir dorsal itibaren dikkatlily pia ve ayrı tüm beyin (Şekil 1D) zarar vermemeye Beyin alarak bakım mezenşimin dorsal çıkarın. </li><li> Tüm yol orta beyin ve arka beyin ve beyincik (Şekil 1E) da dahil olmak üzere ayrı Beyin arasındaki doku içinden kesi yapmak. </li><li> Tüm yol beyincik ve Beyin alar levhanın her iki yanal kavşaklarında doku içinden kesiler yaparak, diseksiyon boyunca pia bütünlüğünü (Şekil 1F) korumak için özen tüm beyincik çıkarın. Oluşturan koroid pleksusu (Şekil 1G) sökün. </li><li> Buz gibi soğuk HBSS içine disseke beyincik taşıyın. </li></ol> E14 Serebellumunda 2. Dilim Kültür <ol><li> Bir spatula ya da ucu ile 3 ml&#39;lik Pasteur pipeti kullanarak Doku Chopper steril platforma bütün beyincik transfer diyafram genişletmek için kesilmiş. Bir pipet kullanarak fazla sıvıyı çıkarın. </li><li> T tüm tüm beyincik CutO maksimum% 50 bir kesim hızı ayarlamak doku kıyıcı kullanarak 300 mikron kalınlığında yönünü gerekli. Doku bütünlüğü en kolay sagital bölümde korunur; Bununla birlikte, yönlendirme hücre analizi için önemli bir husustur (granül hücre aksonları enine çalıştırırken, Purkinje hücresi dendritler sagital Purkinje hücresi dendritler düzlemine dik olan, hizalanmaktadır). </li><li> 3 ml Pasteur pipet kullanarak, buz dilimlenmiş serebellum soğuk HBSS kapsamaktadır. </li><li> Kesme ucu ile 3 mi bir Pasteur pipeti kullanılarak buz gibi soğuk taze HBSS içeren bir 60 mm Petri kabı, HBSS içinde dilimleri aktarın. </li><li> Bir fiber optik ışık kaynağı ile aydınlatılan bir mikroskop altında, saatçilik forseps kullanılarak her dilim ayrılmasını sağlamak. Dilimleri belirleyin onların doku bütünlüğü ve medio-lateral pozisyonda dayalı, electroporated edilecek. Not: kültür ortamında inkübasyon dilim yoluyla embriyo Her diseksiyon yaklaşık 10-20 dk bağlı UPO alırn deneyim. Bu cerebella Dekapitasyon ve ex vivo kültür arasındaki minimum zaman miktarda harcama sağlamak için bir seferde diseksiyonlara birini gerçekleştirin. </li></ol> Dilimleri 3. elektroporasyonu <ol><li> Yalıtım bandı ile 60 mm Petri kabı tabanına bir Elektroporatör anot sabitleme tarafından bir elektroporasyon odasını oluşturun. Elektrot karşılamak için HBSS yaklaşık 1 ml ilave edilir. </li><li> HBSS kaplı elektrodun üstünde 0,4 um kültürü eki yerleştirin. Kültür insert elektrot her zaman uç ile elektrot arasında orada temasa olduğundan emin yapma dinlenmek için izin verin. Not: Bu ayarda, dilim kültür eklemek devresini korumak ama katot mekansal hedefleme sağlayan, çözüm yüzey üzerine duracaktır. </li><li> Aktarım tespit dilimleri (kültür insert başına beş adede kadar) kesme ucu ile 3 ml Pasteur pipeti kullanarak kültür eklemek üzerine. Ayrı bir sagitt kültür insert üzerine yerleşmek için izinal yönelim. </li><li> Dilimler, artık çözelti içinde kalmış, böylece, bir pipet kullanarak, fazla HBSS çıkarın. </li><li> Bir dilim hedeflenen bölgenin yüzeyi üzerinde 20% hızlı yeşil ile seyreltildi (1 ug / ul bir konsantrasyonda) P10 pipet, pipet DNA kullanılarak. % 20 hızlı yeşil viskoz DNA çözümü sağlar ve prohibitively DNA&#39;nın geniş dağılma önler. Her bir dilim (Şekil 2B), yaklaşık 5 ul DNA / hızlı yeşil bir çözelti ekleyin. </li><li> İstediğiniz hedeflenen doku üzerinde katot yerleştirin ve 3 x 10 V, 10 msn süreli darbeleri ile electroporate. Doku ile katot doğrudan temastan kaçının. Bunun yerine, iletkenlik korumak (aslında doku dokunmadan mümkün olduğunca dokuya yakın katot yerleştirin) sıvının yüzey gerilimi yararlanın. </li><li> Istediğiniz gibi her serebellar dilim EGL birden bölgelerine DNA teslimat ve elektroporasyon tekrarlayın. </li><li> Elektroporasyon tamamlanması, devir kültür INSE üzerine30 mm Petri kabı rt. </li><li> Glikoz,% 1 B27 takviyesi, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin - (+) - her bir kültür için, önceden ısıtılmış bir kültür ortamı (Basal Medium Eagle 1 ml% 0.5 (w / v) D ekleme Kültür uç ortamı ile temas halindedir, ancak dilimleri içinde banyo değildir, öyle ki kültür eklemek altında 100 ug / ml streptomisin). </li><li> Kadar 3 gün boyunca 37 ° C /% 6 CO2 kültürlerin inkübe edin. Kültür ortamı, taze, önceden ısıtılmış ortam ile, her 24 saat tüm değiştirin. </li><li> Kültür no kültür ortamı taze bir 30 mm çanak (4 ° C de veya O / N)% 4 paraformaldehid içinde 1 saat süre ile ekler kültürün ardından, dilimleri düzeltin. </li></ol> Serebellar Dilimleri 4. Görüntüleme <ol><li> Tespit sonra, PBS içinde 5 dakika boyunca dilimleri 3 kez yıkayın. </li><li> Bir jilet kullanarak, dilim etrafında kesme ve dilim ve yapıştırılan parçanın bölgesini kaldırarak kültür insert her Electroporated ve kültürlü serebellar dilim teşrih. Yapmakkültür insert yüzeyinden dilim çıkarmayı denemeyin. </li><li> Bir lamel alarak bakım altında (istenirse) DAPI içeren montaj orta yaklaşık 1 ml Mount dilimleri kabarcıkları tanıtmak için değil, ve görüntü lazer tarama konfokal mikroskopi kullanılarak. Not: Görüntüleme parametreler elektropore yapılara göre farklılık ve bireysel kullanıcı takdirine edilebilir. </li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada rapor edilen protokol kesme electroporating ve piliç embriyonik gün 14 beyincik dilimleri kültürlenmesi için bir yöntemi anlatmaktadır. Bu protokol, bireysel serebellar lob izole hedefleme dahil EGL küçük odak bölgelerinde, elektroporasyon hedefleme sağlar. Bu yüksek çözünürlük ve kolaylık genetik analiz ve görüntüleme sağlar ve düşük maliyetle kemirgenler 43-47 kurulan tekniklere göre. Böyle bir analiz sonucu değişiklikler EGL etkileyebilir demektir uzatılmış gelişim süre, fare EGL özgü genetik hedefl...

Beyincik Beyin ön ucunda oturur ve olgun beyindeki duyu ve motor işleme entegrasyonu sorumlu yanı sıra yüksek bilişsel süreçleri 1 düzenleyen olduğunu. Memeliler ve kuşlar, bu yetişkin beyindeki nöronların yarıdan fazlası ürettiği gelişimi sırasında, atalarıdır geniş geçiş amplifikasyon ürünü ayrıntılı bir morfoloji sahip ve ağır foliated edilir. Beyincik yüzyıllardır Nörobiyologlar ve moleküler çağda çalışmanın konusu olmuştur aynı şekilde önemli dikkat çekmiştir. Bu, özünde ilginç biyoloji, ama aynı zamanda ağır gibi en yaygın pediatrik beyin otizm spektrum bozuklukları 2 ve en belirgin serebellar kanser, medulloblastoma 3 gibi gelişimsel genetik bozukluklar da dahil olmak üzere insanlara hastalık bulaştıran gerçeği değil sadece ilgilidir tümör. Önemlisi, bu wh içinde mükemmel bir model sistemich beyin gelişimi 4 sırasında kaderi tahsisi ve nörogenezi incelemek için. Son yıllarda, aynı zamanda omurgalı phylogeny 5-10 arasında görülen serebellar formların büyük çeşitlilik nedeniyle, beyin gelişiminin karşılaştırmalı çalışma için bir model sistem olarak kurulmuştur. Beyincik Beyin 11&#39;de rhombomere 1 dorsal yarısından itibaren gelişir ve gelişimsel iki ana progenitör popülasyonları, eşkenar dudak ve ventriküler zon oluşur. Eşkenar dudak çatı plakası sınırındaki Beyin ve neuroepithelium dorsal bölgenin çevresinde uzanır. Bu beyincik 12-14 glutamaterjik eksitatör nöronların doğduğu yerdir. Ventriküler bölge en belirgin inhibitör GABAerjik serebellar nöronların, büyük Purkinje nöronları 14,15 yol açar. Daha sonra geliştirme (fare embriyonik gün 13.5 ila yaklaşık, civciv 16 e6), glutamaterjik ProGenitors eşkenar dudaktan teğet göç ve atalarıdır bir pial bir tabaka oluşturur: ikincil progenitör bölgesi dış granül tabakası (EGL) çağırdı. Olgun beyinde bulunan granül nöronların büyük sayılara neden kapsamlı geçiş amplifikasyon uğrar bu tabakadır. EGL çoğalma uzun hücre döngüsü çıkışı ve ortasına dış EGL katmandan kendi çıkış ile bağlantılıdır progenitörlerin nöronal farklılaşma anahtarıyla, eşkenar dörtgen şeklinde dudak 17 Tanjansiyal göç kaynaklanan alt Pial konumu ile bağlantılı olmuştur EGL 18. Medial-lateral ekseninde post-mitotik granül hücrelerinin Geniş teğet göç olgun serebellar korteksin iç granül tabakası içine son radyal göç öncesi, orta ve iç EGL 19 oluşur. Serebellar yüzey üzerinde eşkenar dudak hücrelerin göç pia 20-22 den CXCL12 sinyalizasyon bağlıdır </sup&gt; Ve granül hücrelerinin CXCL12 reseptörü CXCR4 ifade eder. Onların teğet migrasyon inhibitör interneuron popülasyonları 23-25 ​​göç neokortikal teğet o böylece anımsatıyor. Şaşırtıcı, elektron mikroskobik çalışmalar 17 proliferatif morfolojiye sahip EGL hücreleri memeli korteks 26 bazal atalarıdır anımsatan tarzda çoğalma yeteneği ile hücre davranışını bağlayan, pial temas halinde olduğunu ileri sürmüşlerdir. Bu 18 imzaların granül ön farklı gen ekspresyonunu sahip farklı hücre dışı durumlar tarafından tanımlanan üç alt katmanlar halinde EGL yukarıda belirtilen tabakalaşma yansıtılır. OEGL progenitörlerin Çoğalma atalarıdır bireysel genetik fare embriyonik gelişim sonunda etiketli, onlar 250-500 postmitotic g medyan ortalama doğuran şekilde klon boyutları normal dağılım oluşurranule nöronlar 27,28. Çoğalma Purkinje nöronları 29-32, altta yatan mitojenik SHH sinyallemesinin bağlıdır. SHH&#39;nin cevap verme transkripsiyon faktörünün Atoh1 hücre bağımsız ekspresyonu üzerine tamamen bağlı olduğu gösterilmiştir, in vitro ve in vivo 33 34,35 hem de. Benzer şekilde, hücre döngüsü çıkışı ve farklılaşması olasılıkla Atoh1 37 doğrudan bir bastırıcısıdır alt transkripsiyon faktörü NeuroD1 36, ifadesine bağımlı olduğu gösterilmiştir. Hücre döngüsü çıkışına 38-42 hücre biyolojik temelini çözmekte bu ilerleme ve önemli ilerleme olmasına rağmen, karar altında yatan temel moleküler mekanizma (lar) hücre döngüsünü çıkmak için bir ayırt nöron bir progenitör geçiş için, ve İç EGL de ilişkili postmitotic teğet göç yanı sıra, daha sonra anahtarradyal göç, anlaşılan eksik kalır. Bu, EGL deneysel inatçılığı büyük ölçüde: geç gelişen ve aynı nörojenik moleküllerin pek çoğu önemli önceki granül öncülerinin hayatta eşkenar paralel dudak altındadır beri genetik hedef zordur. Bu sorunu aşmak için, sayısız yazar kemirgenler 43-48 doğum sonrası beyincik hedeflemek için bir yöntem olarak in vivo ve ex vivo elektroporasyon gelişmiştir. Burada, maliyet ve kolaylık açısından önemli avantajlar temsil EGL, incelemek için civciv ex vivo elektroporasyon kullanımını öncülük. Elektroporasyon ve civciv serebellar doku ex vivo dilim kültürü Bizim yöntemi 14 civciv EGL çoğalması zirvesinde embriyonik Gün doku disseke kullanır. Bu yöntem, eşkenar dudak bağımsız EGL genetik hedefleme izin verir ve granül geçişin genetik diseksiyon için sahne koyacaktırbeyincik postmitotic granül nöron progenitör.

<table><tbody><tr><td>McIlwain doku doğrayıcı</td><td>Mickle Laboratory Engineering Ltd</td><td></td><td>, 300 & mu'da kesin; en iyi sonuçlar için m.</td></tr><tr><td>Bazal Orta Kartal (Gibco)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>41010-026</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>penisilin / streptomisin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>0.4 & mu; m kültür eki</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>TSS20 Ovodyne elektroporatör ve nbsp;</td><td>Intracel</td><td>01-916-02</td><td>Elektroporasyon için 3 x 10 V, 10 msn darbeleri kullanın.</td></tr></tbody></table>

ex vivo chick serebellar dilimleri kültür ve mekansal elektroporasyon granül hücre öncülerinin hedefli

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Serebellar dış granül tabakası (EGL) gelişmekte olan beyinde büyük Transit büyütme site ve nöronal çoğalmasını ve farklılaşmasını çalışmak için mükemmel bir model. Buna ek olarak, çoğalma yeteneği evrimsel değişiklikler beyinciği omurgalı beynin evo-devo çalışmaları için mükemmel bir model haline amniotları serebellar büyüklükte dramatik genişleme sorumlu olmuştur. EGL kurucu hücreleri, serebellar granül ataları da, Medulloblastoma için en yaygın pediatrik nöronal tümör kökenli önemli bir hücreyi temsil etmektedir. Transit amplifikasyon ardından, granül öncüleri olgun memeli beyninde büyük nöronal nüfusu temsil beyincik iç granüler tabaka içine radyal göç. Civciv, EGL çoğalması pik gebelik ikinci hafta sonuna doğru ortaya çıkar. Bu tabakaya genetik değişimine hedeflemek içinproliferasyonunun en yüksek, embriyonik gün 14 civciv embriyolarından serebellum dilimleri ex vivo elektroporasyon yoluyla genetik manipülasyonu için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, in vivo granül nöron geliştirme birkaç önemli yönlerini özetlediği ve beyincik granül hücre çoğalması ve farklılaşması tam bir anlayış oluşturmada yararlı olacaktır ve böylece beyincik geliştirme, evrim ve hastalığın.

Bu bölüm, embriyonik gün 14 hatundan kesit elektroporasyon ve beyincik kültürü kullanılarak elde edilebilir sonuçlarının örneklerini göstermektedir. Beyincik diseksiyon Şekil 1 içinde tasvir edilmektedir ve ayarlamak elektroporasyon haznesi, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Bu başarılı in vitro (Şekil 3A), yapı ve hücresel morfolojik korumak kültür serebellar dilimleri, elektroporasyona ve mümkün olduğunu göstermektedir. Bireysel...

Serebellar dış granül tabakası gelişmekte olan beyinde büyük Transit amplifikasyon sitedir. Burada, embriyonik Gün 14 civciv embriyolardan ex vivo elektroporasyon ve serebellar dilim kültürü kullanarak çoğalması zirvesinde bu tabakaya genetik modifikasyon hedeflemek için bir protokol mevcut.

Ex Vivo Chick Serebellar Dilimleri Kültür ve Mekansal Elektroporasyon granül hücre öncülerinin Hedefli

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Bu prosedürün genel amacı, granül hücre morfolojisini ve davranışını ex vivo bir ortamda gözlemlemek, incelemek ve değiştirmek için genetik modifikasyonu civciv beyinciğinin dış granüler tabakasına yöneltmektir. Bu yöntem, nöral progenitörlerin nasıl göç ettiği, çoğaldığı ve farklılaştığı gibi gelişimsel nörobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çalışmalarla ilişkili olan maliyet ve kolaylık açısından önemli faydaları beraberinde getirmesidir.Bu yöntem tavuk granül gelişimine dair içgörü sağlayabilse de, sürüngenler ve memeliler gibi diğer model organizmalara da uygulanabilir. Başlamak için, döllenmiş kahverengi tavuk yumurtalarını embriyonik 14. güne ulaşana kadar 38 °C sıcaklıktaki bir yumurta inkübatörüne yerleştirin. Embriyonik 14. günde, embriyoyu açığa çıkarmak için yumurtada bir açıklık kesin ve civciv embriyosunun başını in ovo yöntemle kesin.Baş, diseksiyon mikroskobu altında, buz gibi soğuk PBS içeren bir Petri kabına yerleştirildi. Her iki gözün arkasından doku boyunca bir insizyon yapmak, gözleri ve üst çeneyi çıkarmak için standart pensler kullanın. Ardından, alt çeneyi çıkarmak için farenks boyunca ikinci bir insizyon yapın.Ardından, deriyi soyarak kafatası yüzeyinden uzaklaştırmak için standart pensler kullanın. Daha sonra, beyni ventral açıdan ortaya çıkaracak şekilde frontal ve parietal kemikleri çıkarın. Faringeal kıkırdağı ve yardımcı mezenşimi uzaklaştırın.Ardından beyni dorsal tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin ve p'ye zarar vermemeye dikkat ederek arka beynin dorsalindeki mezenkimi dikkatlice uzaklaştırın. Sonra, beyincik dahil olmak üzere arka beyni ayırmak için orta beyin ile arka beyin arasındaki dokuyu tamamen boydan boya kesin. Beyinciğin her iki lateral birleşim yerinde ve arka beynin aller plakasında dokuyu tamamen boydan boya kesin.Diseksiyon boyunca PIA'nın bütünlüğünü korumaya dikkat ederek serebellumun tamamını çıkarın. Son olarak, oluşmakta olan koroid pleksusu uzaklaştırın ve diseke edilmiş serebellumu buz gibi soğuk HBSS içerisine yerleştirin. Serebellumun tamamını, bir spatula veya ucu kesilmiş üç mililitrelik bir pastör pipeti kullanarak bir doku kıyıcının steril platformuna aktarın.Açıklığı genişletmek için, fazla sıvıyı bir pipet yardımıyla uzaklaştırın. Doku doğrayıcının kesme hızını maksimum değerinin %50'sine ayarlayın. Ardından, üç mililitrelik bir pastör pipeti kullanarak serebellumu istenen yönde 300 micrometers kalınlığında kesin.Dilimlenmiş serebellumu soğuk HBSS ile kaplayın. Ardından, HBSS'yi ve dilimleri, ucu kesilmiş üç litrelik bir pastör pipeti kullanarak 20 mL buz gibi soğuk HBSS içeren 60 mm'lik bir Petri kabına aktarın ve Petri kabını fiber optik ışık kaynağı ile aydınlatılmış bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Daha sonra, beyin dokusunun tekil dilimlerini ayırmak için bir saatçi pensi kullanın ve doku bütünlükleri ile mediolateral konumlarına göre elektroporasyon yapılacak dilimleri belirleyin.Bir elektrodun anotunu 60 milimetrelik bir Petri kabının tabanına sabitleyerek bir elektroporasyon odası oluşturun. Elektrodu örtmek için yalıtım bandı kullanarak yaklaşık bir mililitre HBSS ekleyin. Ardından, 0,4 mikrometrelik bir kültür yerleştirin.HBSS ile kaplı elektrodun üzerine yerleştirin. Tanımlanan dilimleri (her bir insert başına beşe kadar) kültür insertine aktarmak için ucu kesilmiş üç mililitrelik bir pastör pipeti kullanın. Ardından dilimleri ayırın ve kültür üzerine çökmelerini sağlayın.Sagital yönelimde yerleştirin. Bir pipet kullanarak beyin dilimlerindeki fazla besiyerini uzaklaştırın. Eklerin insert ile elektrot arasında temas olacak şekilde elektrot üzerinde durmasını sağlayın.Bu düzeneğe göre, dilimleri içeren kültür inserti, devreyi korurken katodun bölgesel olarak hedeflenmesine olanak tanıyacak şekilde besiyeri yüzeyi üzerinde duracaktır. Bir P 10 pipet ucu kullanarak, her dilimin hedeflenen bölgesinin yüzeyine %20 fast green ile seyreltilmiş 5 µL DNA pipetleyin.Fast green eklenmesi, DNA solüsyonunun DNA'nın geniş çaplı dağılımını önleyecek kadar vizkoz olmasını sağlar. Ardından, istenen hedef dokunun katodunu yerleştirin ve örnekleri elektrolize edin. Katodu, dokuya fiilen temas etmeyecek şekilde mümkün olduğunca yakın yerleştirerek katodun dokuyla doğrudan temasından kaçının.Elektroporasyonu, her bir serebellar kesitteki dış granüler tabakanın istenilen çok sayıda bölgesinde tekrarlayın. İşlem tamamlandığında, kültür insertini 30 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Her kültüre, kültür insertinin altına bir mililitre önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin.İnsertin besiyerinin üzerinde yüzmediğinden emin olun. Kültür inserti besiyeri ile temas halinde olmalı, ancak dilimler besiyerinin içine gömülmemelidir. Kültürleri, tüm besiyerini değiştirerek üç güne kadar inkübe edin.Kültürden sonra her 24 saatte bir taze, önceden ısıtılmış besiyeri ile besiyeri değişimi yapın. Kültür insertlerindeki kesitleri, %4 paraformaldehit içeren 30 milimetrelik bir kaba bir saat boyunca aktarın. Paraformaldehidi kültürün üzerine eklediğinizden emin olun.Sabitledikten sonra yerleştirin. Kesitleri, her biri beş dakika sürecek şekilde üç kez PBS ile yıkayın. Ardından, elektropore edilmiş ve kültüre edilmiş her bir serebellar kesiti kültürden ayırmak için oftalmik makas kullanın.Her bir kesitin etrafından keserek ve ekle bağlı olan bölgeyle birlikte çıkararak yerleştirin. Kesiti ek yüzeyinden ayırmaya çalışmayın. Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek, kesitleri yaklaşık bir mililitre seçtiğiniz bir sabitleme ortamı içinde lam ve lamel arasına yerleştirin.Lamlar kuruduktan sonra lamları toplayın ve lazer tarama kullanarak görüntüleyin. Konfokal mikroskopi kalbindin. Kontrol GFP plazmidi ile elektroporasyon sonrası E 14 serebellar dokusunun boyaması; in vitro birinci, ikinci ve üçüncü günlerde kırmızı renkte gösterilmiştir.Tutarlı kalbindin boyaması, doku bütünlüğünün in vitro kültürde en az üç gün boyunca korunduğunu göstermektedir. Burada, çeşitli konumlardaki dış granüler tabakaya başarıyla elektropore edilmiş RFP ve GFP kodlu plazmitlerin düşük büyütmeli görüntüleri yer almaktadır. GFP plazmitle, yıldızla belirtildiği üzere tek bir fum hedef alınmıştır.Burada, 8 0 1 enhancer tarafından yönlendirilen GFP kodlayan bir konstrüktün eksternal granüler tabakaya elektropore edildiği bir örnek gösterilmektedir. 8 0 1 ekspresyonu, eksternal granüler tabaka içindeki granüler hücre öncüllerini tanımlar. İn vitro üç gün sonra çeşitli hücre morfolojileri açıkça görülür ve hücre davranışı izlenebilir.Bu videoyu izledikten sonra, granül hücre gelişimini gözlemlemek ve manipüle etmek için çeşitli genetik araçlar kullanarak bireysel serebellar dilimlerin nasıl seçileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü takiben, dokunun yapısal bütünlüğü ve Purkinje hücreleri veya Bergmann glia hücreleri gibi farklı hücre tiplerinin göreceli konumları hakkında ek soruları yanıtlamak için immünohistokimya gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde bir düzine tavuk embriyosu için yaklaşık iki saatte tamamlanabilir.

ex-vivo-culture-chick-cerebellar-slices-spatially-targeted

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Burada izole etmek için bir yöntem ve postnatal fare kültür serebellar granül nöron progenitör hücreleri ve serebellar granül nöronlar sunuyoruz.

Post-Natal Mouse Serebellar Granül Nöron Progenitör Hücreler ve Nöronlar İzolasyon ve Kültür

Bu videoda civciv embriyo serebellum dilimlerinin raportör gen plazmitleri ile elektroporasyonunu gerçekleştiriyoruz. Teknik, granül tabaka oluşturmak için granül hücre öncülerinin gelişiminin ve göçünün görselleştirilmesini kolaylaştırır.

Civciv Embriyo Serebellar Dilimlerinin Ex Vivo Elektroporasyonu: Granüler Hücre Gelişimini Görselleştirmek için Yeşil Floresan Proteini Kodlayan Plazmid DNA'yı Tanıtma Yöntemi

Video, beyincik dilimlerinin hazırlanışını göstermektedir. Beyinciğin bir civciv embriyosundan izole edilmesi için ayrıntılı bir prosedür gösterir. Dilimler daha sonra daha fazla deneysel analiz için bir doku kıyıcı kullanılarak diseke edilmiş beyincikten hazırlanır.

Embriyonik Civciv Beyninden Beyincik Dilimleri Elde Edilmesi

Source: Chan, U., et al., Serebellar Granül Nöron Morfolojisi ve Sinaps Gelişimini İncelemek için In Vivo Postnatal Elektroporasyonu Kullanma. J. Vis. Exp. (2021).Bu video, floresan proteini ile etiketlenmiş farelerden önceden sabitlenmiş beyin dokusu dilimlerini görüntüleyerek serebellar granül nöron gelişiminin analizini göstermektedir. Konfokal mikroskopla yüksek çözünürlüklü Z-yığını görüntüleri yakalama ve sinaptogenezi incelemek için nörit uzunluğu, dendritik pençe oluşumu, yüzey alanı ve...

Farklı Gelişim Aşamalarında Serebellar Granül Nöronlarının Sinaptogenezinin Görselleştirilmesi

Kaynak: Bénard, M., et al. Ex Vivo Konfokal Makroskopi Kullanılarak Postnatal Serebellar Granül Hücre Migrasyonunun Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm.  (2015)Bu video, doğum sonrası sıçan beyinlerinden serebellar dilimlerdeki granül hücrelerinin ex vivo göçünü izlemek için konfokal makroskopik bir yöntemi göstermektedir.

Postnatal Serebellar Granül Hücre Migrasyonunun Konfokal Makroskopi ile Ex Vivo Görüntülenmesi

Nöronal morfogenezine ve göç doğru beyin gelişimi altında yatan çok önemli olaylardır. Burada, genetik olarak kültürlenmiş nöronlar ve serebellar granül morfolojisi ve nöronların göç özelliklerinin değerlendirilmesi için gelişmekte olan beyincik işlemek için yöntemleri tarif eder.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Doğum sonrası beyincik gelişimi sırasında, germinal bölgeden köken alan olgunlaşmamış granül hücreleri, nihai hedeflerine ulaşmak ve nöronal ağlar kurmak için farklı göç yöntemleri sergilerler. Bu protokol, serebellar kesitlerin hazırlanmasını ve nöronal göçü düzenleyen faktörleri araştırmak için kullanılan konfokal makroskopik yaklaşımı tanımlar.

Konfokal Makroskopi kullanarak Postnatal Serebellar Granül Hücre Göç Ex Vivo Görüntüleme

Bu iletişim kuralı yalıtma ve birincil fare serebral granül neurons (CGNs) 6-7 gün eski pups, CGNs kaybı için verimli iletim ve kazanç işlevi çalışmalar, kültür ve nöronal excitotoxicity NMDA kaynaklı modelleme için basit bir yöntem açıklar, düşük potasyum indüklenen hücre ölümü, DNA hasarı ve oksidatif stres aynı kültür modelini kullanarak.

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Geleneksel işlev kaybı çalışmalar nakavt hayvanlar kullanarak genlerin kez pahalı ve zaman alıcı olmuştur. Somatik mutagenesis CRISPR-aracılı Elektroporasyon tabanlı gen içinde vivoişlevleri anlamak için güçlü bir araçtır. Burada, nakavt fenotipleri beyincik Proliferasyona hücrelerdeki analiz etmek için bir yöntem raporu.

CRISPR-aracılı kaybı serebellar granül işlev analizinin gen transferi Elektroporasyon tabanlı rahim içinde kullanarak hücreleri

Burada, fare beyinciğindeki granül nöronların sinaptogenezini, doğum sonrası beyin gelişiminin zaman boyunca, bu hücreler sinaptik yapılarını rafine ettiklerinde ve kendilerini genel beyin devresine entegre etmek için sinapslar oluşturduklarında görselleştirmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Serebellar Granül Nöron Morfolojisi ve Sinaps Gelişimini Incelemek için In Vivo Postnatal Elektroporasyonun Kullanılması

Burada, primer serebellar granül hücre öncüllerinin (GCP' ler) genetik manipülasyonu için uygun maliyetli, verimli ve uygulanabilir bir tekrarlanabilir in vitro elektroporasyon protokolü sunuyoruz. Ayrıca, bu protokol ayrıca birincil GCP hücrelerindeki birincil ekyuma bağımlı Kirpi sinyal yollarının moleküler çalışması için basit bir yöntem göstermektedir.

Granül Hücre Öncüsünde Birincil Seyuma Bağımlı Sinyal Yollarını İncelemek için Verimli ve Uygun Maliyetli Elektroporasyon Yöntemi

Keşfedin tavuk serebellumunun dış granül tabakasına genetik modifikasyon için ex vivo elektroporasyon yöntemini. Bu teknik, granül hücre öncülerinin göç, proliferasyon ve farklılaşmasını inceleyerek gelişimsel nörobiyoloji araştırmalarına değerli bir çerçeve sunar.

Ex Vivo Chick Serebellar Dilimleri Kültür ve Mekansal Elektroporasyon granül hücre öncülerinin Hedefli

Daha fazla video keşfet