Name: Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi İn Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Öğrenin, Arabidopsis bitkilerinde protein-DNA etkileşimlerini tespit etmek için kromatin immunoprecipitation (ChIP) yöntemini. Bu teknik, bitki biyolojisinde gen düzenlemesi mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bu dergide yayınlanan bazı verilerin, burada Şekil 4'te açıklanan temsili sonuçları detaylandırmak için kullanılmasına izin verdiği için The Plant Cell'e teşekkür etmek isterler. Bu çalışma, AB 7FP Marie Curie-Başlangıç Eğitim Ağı EpiTRAITS (Hibe Anlaşması 316965) ve İspanyol Ministerio de Economìa y Competitividad (BIO2010-15589 ve BIO2013-43098-R hibeleri) tarafından desteklenmiştir.

Bitki Materyali 1. Çapraz (1 saat) <ol><li> Arabidopsis deneyi kullanılan satırları büyütün (- WT - yabani tip mutantlar karşı, ve / veya etiket ifade çizgilerin karşı ilgi protein etiketli sürümünü ifade çizgileri herhangi proteine ​​erimiş değil) büyük Petri kapları üzerinde 12-18 gün (150 mm), MS-agar ortamı (1 L: 1x Murashige &amp; Skoog tuzlan, 10 g sakroz, 0.5 g MES, pH 5.7 (KOH),% 1 agar) ile. Toprak ve vermikülit 1 karışımı: Alternatif olarak, 3 içeren tencere üzerinde bitkiler büyümek. DİKKAT! Formaldehit, cilt ile temasında ve yutulduğunda, inhalasyon yoluyla toksik ve uygun kişisel koruyucu donanımları giyen bir kimyasal kaputu ele alınmalıdır. 1.2 Adımları - 1.6 davlumbaz altında yapılmalıdır. </li><li> Bir laboratuvar brülör ısıtmalı iğne ile 50 ml tüpler kapağındaki küçük delikler yapın. % 1 bir son konsantrasyona 1x PBS 40 mi tampon ekleme ve formaldehitin 1,08 mi (stok 37% szüm). Bu 50 ml tüpler içinde bitki maddesinin 1.5 g toplayın. Çapraz bağlama sırasında buz üzerinde tüpler tutun. </li><li> Kapaklı 50 ml tüpler kapatın. Bir kurutucuda tüpleri yerleştirin ve vakum uygulanır. Vakum daha sonra, 10 dakika boyunca doku infiltrasyonu solüsyonu çalkalama önlemek için dikkatli bir şekilde vakum bırakın. Örneği karıştırın. İki kez tekrarlayın. Infiltrasyon sonra, bitki materyali gözlemlemek ve biraz saydam hale teyit ve tüp (Şekil 2) dibine batmaya eğilimindedir. </li><li> 5 dakika boyunca vakum uygula 0.125 M bir son konsantrasyon elde etmek için 2 M Glisin 2,5 ml ilave edilir. Glisin formaldehid çapraz bağlanma yarışmalı bir inhibitörü olarak görev yapar. </li><li> Kapaktaki delikleri kapalı 50 ml tüp tersini PBS formaldehit-glisin çözüm atın. </li><li> Aşama 1.5&#39;de tarif edildiği gibi, su ile yıkama çözeltisi atılması ile iki kez 1 x PBS ile ve bir kez küçük bitkileri durulayın. Bir kağıt havlu üzerinde kurutun ve sıvı nitroge dondurman. Not: Dondurulmuş doku hafta içinde -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> Antikorların 2. Hazırlık (1 gün) NOT: İmmünopresipitasyon için, bir protein ya da protein G, antikor ağır zincirinin sabit alanı için yüksek afinitesi olan bir bağlayıcı ile antikorlar ile konjuge manyetik boncuk kullanılması tavsiye edilir. DNA-protein kompleksleri, boncuklar-antikor konjugatları yüzeyine spesifik olmayan eklenebilir. Bu nedenle, bu spesifik olmayan bağlanma arka ölçmek için spesifik antikorlar olmayan kontroller gerçekleştirmek için gereklidir. <ol><li> Her bir immüno-çökeltme için, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde manyetik boncuk 15 ul hazırlar. Boncuk tanelerin miktarının, immüno-çökeltme ve ayrıca antikorlar üzerinde kullanılır kromatin miktarına bağlıdır. </li><li> Tu kordonlara Kromatin immüno-çökeltmesi (chip) seyreltme tamponu 1 ml ilave dönmesiyle karıştırın ve 1.5 mL bir mikrosantrfuj koyun yıkamakManyetik bir raf olması. Boncuklar mıknatıs eklemek izin yaklaşık 1 dakika bekleyin. Rafa hala 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler ile pipetleme süpernatant kaldırmak. İki kez tekrarlayın. Not: boncuk ve antikor (Ab) ve bir ikinci antikor, sadece herhangi bir manyetik boncuk (No-Ab) kontrolü ile bir: İki immüno setleri ihtiyaç vardır her bitki soyundan için. </li><li> ChIP seyreltme tamponu 200 ul boncuk tekrar. (Tam seyreltme her Ab için farklıdır ve deneysel olarak optimize edilmesi gereken ya da ticari antikorların durumunda, üretici talimatları takip) her bitki soyundan hazırlanan iki tüpün birine özgü Ab gerekli miktarını ekleyin. Immunoprecipitation için bu örneği kullanın. Negatif kontrol olarak kullanılacak diğer bir tüp için spesifik IgG miktarını kullanın. </li><li> Antikor boncuk eklemek izin 4 ° C&#39;de dönen bir tekerlek üzerinde O / N inkübe edin. </li></ol> 3. Kromatin Ekstraksiyon (4 saat) </p&gt; <ol><li> Toz homojen ve hafif yeşil bir hale gelene kadar havan ve tokmak kullanılarak iyice sıvı azot içinde dondurulmuş bitki materyali öğütün. Yeni 50 ml tüp toz aktarın. </li><li> Davlumbaz altında 3.6, iş - adımların 3.2. Ekstraksiyon tamponu 1 30 ml (EXB 1) ekleyin ve doku tozu emmek için iyice karıştırın. Bu adımından, sürekli 4 ° C&#39;de örnekleri tutmak. Dondurulmuş doku ve sıvı azot kalanlar tamponu donmasına neden olur. Tüpleri 4-5 kez, her 2 dk tersini tamamen donmuş doku çözülme emin olun. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 1000 x g&#39;de, yeni bir 50 ml tüp ve santrifüj içine 22-25 um gözenek boyutuna sahip olan bir filtre doku içinde geçirilerek bulamaç temizleyin. Not: Bu adımda, çekirdekler ve tüm organellerin pelet olacaktır. EXB 1 yüksek yoğunluklu sağlamak ve organel yapısı aksamaması için yeterli sakaroz içerir. </li><li> Yavaşça dekantasyon yoluyla süpernatant kaldırmak. Bu sta atge, yaklaşık 2 ml yeşil pelet gözlemlemek. </li><li> EXB 5 ml pelletini pellet 2. Tekrar süspansiyona, bu noktada zor olacaktır. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüjleyin. NOT: EXB 2% 1 Triton X-100, açık kloroplastları daldı ve klorofil kaldırmak yardımcı içerir. </li><li> Ekstraksiyon Tampon 3 (EXB 3) 300 ul pelletini. </li><li> Temiz mikrofuge&#39;de tüp içinde, EXB 3. 600 ul adım 3.6 den yeniden süspanse pelet alın ve dikkatli bir şekilde temiz EXB 3 üstüne onu katman ekleyin. </li><li> 4 ° C&#39;de 16,000 x g&#39;de 1 saat boyunca spin. NOT: Bu adım örnek deterjan çıkarmadan yardımcı olur. </li><li> Bir pipet ile aspire süpernatantı. Yavaş yavaş Sonication verimliliğini etkileyebilecek olan kabarcık oluşumunu önlemek için yukarı ve aşağı pipetleme sonication tampon 300 ul nükleer pelletini. Dikkatle tüm süspansiyon dışarı pipet ve temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp transfer. NOT: BuTampon çekirdekleri parçalanması ve kromatin serbest bırakmak için, SDS içerir. </li><li> Çekirdekleri parçalanması ve rastgele küçük parçalara kromatin makaslama süspansiyon sonikasyon. (Malzemeleri / reaktiflerin Tablo l&#39;de tarif edilen uygun sonikasyon cihaz için 4 ° C sıcaklıkta 30 sn ayarlar AÇIK / KAPALI 30 saniye 20-30 döngü) 200-800 bp arasındaki parçalar halinde zenginleştirilmiş kromatin oluşturmak sonikasyon koşullarını kullanarak. Sonike kromatin 2 ul (Şekil 3) yüklenmesi, bir agaroz jeli 13 elde edilen DNA fragmanlarının elektroforetik ayrılmasıyla sonikasyon kontrol edilmesi. DİKKAT! Ultrason cihazı ses geçirmez bir kabin içinde yer almayan durumunda sonication adımı sırasında kulak koruyucu ekipman giymek emin olun. Önemli adım! Kromatin parçalanma ölçüde sonication donanımına bağlıdır. Sonikasyon koşulları uygun DNA boyutlarda zenginleştirme elde etmek için ayarlanmalıdır. GörmekKromatin parçalanma nasıl optimize bir örnek için Şekil 3. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 12.000 x g&#39;de çözeltinin bir kez dönerler. Temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp pipetleme süpernatant aktarın. Pelet atın. Yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp süpernatant 1/10 atın -20 ° C&#39;de Giriş ve dondurularak olarak işaretleyin. </li><li> % 0.1 son konsantrasyona SDS seyreltilmesi için fiş seyreltme tampon çözeltisi ile kromatin 10x seyreltin. Not: Örnekler dondurulmuş ve birkaç hafta -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> İlgi Protein ve DNA Rescue 4. immünopresipitasyonu (1 gün, 3 saat) <ol><li> Aşama 2.2 &#39;de tarif edildiği gibi, antikorun fazlasının ayrılması için fiş seyreltme tamponu 1 ml aşama 2,4 üç kez Ab ile kaplanmış boncuk yıkayın. ChIP seyreltme tamponu 200 ul içinde süspanse. İzole kromatin 50 ul ekleyin. 4 ° C&#39;de dönen bir tekerlek üzerinde O / N inkübe edin. NOT: dikkat yoğunluğu kontrolmicrovolume UV-Vis spektrofotometre içinde kromatin üzerinde. İzole kromatin 50 ul DNA fazla 10 ug içermelidir. </li><li> 4 ° C adımlar 4,2-4,5 işler için. Aşama 2.2 &#39;de tarif edildiği gibi Düşük Tuz yıkama tamponu 1 ml iki kez boncuk yıkayın. </li><li> Yüksek tuz yıkama tamponu 1 ml kez boncuk yıkayın. </li><li> LiCİ Yıkama tamponu 1 ml kez boncuk yıkayın. </li><li> TE tamponu 1 ml iki kez boncuk yıkayın. Son yıkamadan sonra, tam bir pipet ile aspirasyon yoluyla tüp içinde sol TE tampon kaldırmak için emin olun. </li><li> GİRİŞ örnekleri (adım 3.9) çıkartın. Yeni 1.5 ml mikrosantrifüj tüp Transfer INPUT 5 ul ve ChIP örnekleri ile olduğu gibi devam ediyor. % 5 kenetleme iyon değişim reçinesi 200 ul ekleyerek çapraz bağlantıyı ters döndürecek ve her 2-3 dakikada çalkalama 95 ° C&#39;de 10 dakika inkübe edilir. 30 saniye için 16,000 xg&#39;de Spin ve dikkatli bir şekilde pipetle yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine süpernatant aktarın. NOT: tra ikenters çapraz bağlamak için ditional metod, bu sebepten, bir protokolü gün daha kısa hale etkin decrosslinking ve 10 dakika DNA&#39;nın elüsyonu sağlar NaCI, 95 ° C de bir kenetleme iyon reçinesi ile kuluçkalama ile O / N inkübasyon içerir. </li><li> Proteinaz K 2 ul (10 mg / ml) ilave edin ve 30 dakika proteinleri sindirimi ve DNA serbest bırakmak için 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 10 dakika boyunca 95 ° C&#39;de inkübe ederek reaksiyonu durdurun. </li><li> Hızla 30 saniye boyunca 16.000 xg&#39;de spin ve pipetleme yeni bir tüp süpernatantı aktarın. </li><li> DNA, standart DNA fragmanları saflaştırma kiti kullanılarak izole temizleyin. NOT: Üreticinin talimatlarına göre hareket edin. </li><li> Yeni 1.5 ml mikrosantrifüj tüp kiti DNA bağlanma sütun aktarın. Sütunun merkezine DNase içermeyen su 20 ul ilave edilmesi ve 60 saniye boyunca 16,000 x g&#39;de eğirme ile saflaştırılmıştır DNA Zehir. Nokta durdurma: Örnekler birkaç hafta -80 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol&gt; 5. qPCR immünopresipitasyona DNA&#39;daki Siteleri Bağlama Bolluk Ölçme (4 saat) Not: Çökelen kromatin izole edilmiş DNA birleşmesinden oluşan ilgilenilen proteine ​​bağlanması ile toplam kromatin yonga-ed edilmiş olan DNA fragmanları belirlemek için analiz edilmesi yer alır. <ol><li> 60 ° C&#39;lik bir erime sıcaklığı (Tm) ve% 30 -80% bir GC içeriğine sahip ilgili genomik bölgelere tasarım primerleri. Kromatin sonikasyon ile parçalanır olarak, amplifiye edilen dizideki uzunluğu 150-200 nükleotidleri (Tablo 1) daha uzun olmamalıdır. NOT: Primer tasarımı için yararlı bir araç Primer 3 program (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Primer tasarımı için ek kurallar 14,15, önceki raporlarda 8 mevcuttur. </li><li> Primerlerin özgü olduğundan emin olmak için bir patlama programı kullanın (özellikle destekleyiciler dizilerinin bağlama benzer TF paylaşabilirsiniz) ve astar verimliliği usin testig giriş DNA (adım 4.9) suda 01:10 dilüsyonları. Genomun belirli bölgeleri diğerlerinden daha iyi saflaştırılmıştır edilecektir. Bu PCR primerleri tasarlamak ve seyreltilmiş giriş DNA onları kontrol etmek önemlidir. </li><li> Her reaksiyon için bir PCR tüpü içinde su ve pipet ile seyreltilmiş DNA 5 ul saflaştırılmış DNA 1:10 seyreltin. NOT: DNA, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler duvarları ekleyebileceğiniz gibi yalnızca gerektiğinde miktarını seyreltin. Çoklu çözülme-donma döngüleri ekli DNA moleküllerinin sayısını artırmak. Giriş, her primer çifti, büyütme için, Ab-Chip ve Resim-Ab ChIP analiz edilmesi yer alır. </li><li> PCR karışımı tamamlamak için, 1x nihai bir konsantrasyona kadar SYBR Green PCR ana karışımı ekleyin ve her bir primerden 0.5 uM. DNaz içermeyen su ile 20 ul kadar doldurun. </li><li> SYBR Green PCR master mix üreticisinin talimatları takip ederek qPCR reaksiyonu gerçekleştirin. </li></ol> 6. Veri Analizi NOT: ex arasındaChIP-verileri analiz yollarını ğu iki en yaygın kullanılmaktadır. Bunlardan ilki, aynı zamanda &#39;no-antikor kontrole göre&#39; göreceli zenginleşme &#39;,&#39; arka plan üzerinde sinyal &#39;olarak adlandırılan veya kat zenginleştirme yöntemidir. İkinci yöntem &quot;girdi%&quot; olarak adlandırılır. <ol><li> Kat zenginleştirme yöntemiyle veri analizi. <ol><li> QPCR reaksiyonundan sonra elde edilmiştir örnekler isimleri ve ham Ct değerleri ile bir tablo oluşturun. </li><li> Her numune için, ham Ct değerine karşılık gelen hiçbir-Ab kontrolü için elde edilen ham Ct değeri çıkarılır. NOT: Bu matematiksel işlemden sonra, No-Ab numunesi için Ct değeri 0 eşit olur. </li><li> Tabanı 2 ve adım 6.1.2 (Tablo 2) &#39;de elde edilen negatif geri kalanına eşit üs (güç) ile üs işlemiyle kat zenginleşme hesaplayın. zenginleştirme kat = 2 - (Ct (örnek) - Ct (No-Ab)) NOT: Bu metho içinded ChIP-ed numunesinde belirli bir DNA fragmanı bolluğu Resim-Ab kontrol Bu fragmanın bolluk ile karşılaştırılır. Bu yöntemin varsayım plan sinyalinin seviyesinin farklı primer setleri, örnekler ve çoğaltma deneylerde tekrar olmasıdır. Ancak, bu&#39;noise&#39; sinyal seviyeleri primer setleri, örneklerin ve deneyler arasında değişir. </li></ol></li><li> Giriş yöntemi% oranında Veri analizi. <ol><li> Numuneler isimleri ve qPCR reaksiyonundan sonra kendileri için elde edilmiş ham Ct değerleri ile bir tablo oluşturun. </li><li> Bir girdi olarak alınmıştır toplam ekstre kromatin fraksiyonu logaritma tabanı 2 değeri çıkartılarak giriş örnekleri için ham Ct değerlerini ayarlayın. NOT: Toplam kromatin% 10, bu protokolde bir girdi olarak çekildiği gibi çıkarılır değer, 3.32 eşittir Bu protokolde. Log 2 (10) 3.32 eşittir. </li><li> 100 ile b üstel işlem değeri çarpılarak giriş% hesaplayınase 2 ve örnek (Tablo 3) ham Ct değerleri çıkarılır düzeltilmiş giriş değerleri geri kalanı eşit üs (gücü). Girişinin% = 100 * 2 (düzeltilmiş girişi - Ct (örnek)) NOT: Bu prosedür ile toplam izole kromatin (giriş örnek) için ChIP-ed örneğindeki spesifik DNA bolluk arasındaki ilişki hesaplanır. Çip veri analizi ile ilgili daha fazla detay Haring ve arkadaşları. 8 bulunabilir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Andres, F., Coupland, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+flowering+responses+to+seasonal+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of flowering responses to seasonal cues.</a> Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).</li>
<li>Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+flowering+by+ambient+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Control of flowering by ambient temperature.</a> J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).</li>
<li>Jarillo, J. A., Piñeiro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+is+everything+in+plant+development.+The+central+role+of+floral+repressors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors.</a> Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).</li>
<li>Pajoro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%28r%29evolution+of+gene+regulatory+networks+controlling+Arabidopsis+plant+reproduction%3A+a+two-decade+history%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history.</a> J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).</li>
<li>He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+regulation+of+flowering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Chromatin regulation of flowering.</a> Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).</li>
<li>Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodeling+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodeling in plant development.</a> International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).</li>
<li>Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+protocol+for+studying+histone+modifications+in+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).</li>
<li>Haring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Methods. 3, 11(2007).</li>
<li>Kaufmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+of+plant+transcription+factors+followed+by+sequencing+%28ChIP-SEQ%29+or+hybridization+to+whole+genome+arrays+%28ChIP-CHIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP).</a> Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).</li>
<li>Gomez-Mena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((early+bolting+in+short+days%3A+An+Arabidopsis+mutation+that+causes+early+flowering+and+partially+suppresses+the+floral+phenotype+of+leafy%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy.</a> Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).</li>
<li>Piñeiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EARLY+BOLTING+IN+SHORT+DAYS+is+related+to+chromatin+remodeling+factors+and+regulates+flowering+in+Arabidopsis+by+repressing+FT%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT.</a> Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).</li>
<li>Lopez-Gonzalez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin-dependent+repression+of+the+Arabidopsis+floral+integrator+genes+involves+plant+specific+PHD-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins.</a> Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor. Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> J. Vis. Exp. , e3998(2012).</li>
<li>Wong, M. L., Medrano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+for+mRNA+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR for mRNA quantitation.</a> Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).</li>
<li>Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+formaldehyde+fixation+and+immunoprecipitation+technique+for+studying+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions.</a> Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).</li>
<li>Yu, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HISTONE+DEACETYLASE6+interacts+with+FLOWERING+LOCUS+D+and+regulates+flowering+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiling+of+histone+H3+lysine+9+acetylation+and+dimethylation+in+Arabidopsis+reveals+correlation+between+multiple+histone+marks+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression.</a> Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).</li>
<li>Lafos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+H3K27+trimethylation+during+Arabidopsis+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation.</a> PLoS Genet. 7 (4), e1002040(2011).</li>
<li>Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection+of+cells+and+isolation+of+high-quality+RNA+after+cryosectioning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning.</a> Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).</li>
<li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li>
<li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).</li>
<li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).</li>
<li>Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).</li>
<li>Kaufmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+genes+of+the+MADS+transcription+factor+SEPALLATA3%3A+integration+of+developmental+and+hormonal+pathways+in+the+Arabidopsis+flower%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower.</a> PLoS Biol. 7 (4), e1000090(2009).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Burada açıklanan ChIP protokolü Arabidopsis bitkileri, in vivo proteinler ve özel DNA dizileri arasındaki etkileşimi analiz etmek için tekrarlanabilir ve güçlü bir tekniktir. Ilgi proteinlerin için bağlayıcı siteleri başarılı bir kimlik ilgili etkileşimler aslında yer alıyor bitki organları ya da gelişimsel aşamaları yeterli bir seçim gerektirir. Buna ek olarak, bitki malzemesinin, uygun bir tespit ve sonikasyon ile kromatin optimal kesme elde etmek için kritiktir. Seçilen protein / etiket etkin immüno-çökeltme...

Son yıllarda, moleküler genetik ve genomik geniş bir araç, model türleri, Arabidopsis thaliana geliştirilmiştir. Bu teknoloji bitki gelişim nasıl düzenlendiğinin anlaşılması muazzam ilerleme kolaylaştırmıştır. Bir model olarak Arabidopsis kullanılarak incelenmiştir gelişim süreçleri arasında, çiçeklenme zamanında genetik kontrolü yaygın analiz edilmiştir. Bu çalışmalar, bitkiler gibi hormonlar ve bitki yaşı gibi endojen uyaranlara yanıt olarak çiçeklenme çok hassas zaman modüle olduğunu göstermiştir ve ayrıca mevsim 1 doğal döngüsü ile vakit çiçekli senkronize gibi fotoperiyot ve sıcaklık gibi çevresel sinyallere, 2. Çiçeklenme zamanında değişiklikler ile Arabidopsis mutantlar ün izolasyonu ve tanımlanması, endojen ve çevresel faktörlere yanıt olarak çiçeklenme süresini düzenleyen genlerin karmaşık bir ağ meydana çıkararak belirleyici olmuştur. Bu genetik devrelerdirÇiçeklenme anahtarları olarak hareket birkaç usta genlerin seviyesinde entegre ve çiçek inisiyasyon tam zamanlama çiçekli teşvik ve çiçek entegratör genlerinin 1,3 yukarısında işe faaliyetlerini bastırmak dengesine bağlıdır. Genomik yaklaşımların son kullanımı ile destekli çiçekli başlama kontrolünde rolü için belirlenen genlerin fonksiyonel karakterizasyonu, çiçeklenme zamanında modülasyonu transkripsiyonel regülasyon merkezi rolünü ortaya koymuştur. Aslında, çiçekli kodlamak transkripsiyon usta genlerin çoğu 4 faktörleri. Buna ek olarak, kromatin remodeling protein komplekslerinin bir dizi çiçeklenme ana genlerin ekspresyonunu etkilemektedir. Gözlemlenmesi, değişen çiçeklenme defa izole Arabidopsis Bir dizi mutantlar kromatin değiştirici çeşitli kodlayan genlerinde mutasyon taşıyan ortaya çıktı. Histon olarak posttranslasyonel modifikasyonlar farklı kromatin remodelerse kuyrukları, DNA&#39;ya göre nükleozom konumlandırmak ya da Arabidopsis&#39;te 5,6 çiçeklenme uygun düzenlenmesi için histon varyantları gerekli kanonik histonları vardır alışverişi. Bu kromatin remodeling aktiviteleri arasında birikmesini veya örneğin belirli histon kalıntılarda asetilasyon veya metilasyon gibi kovalent modifikasyon çıkarılmasını katalizler. Bu histon işaretleri özellikle çiçekli genlerin transkripsiyonel aktivitesini düzenleyen diğer kromatin remodeling kompleksleri, transkripsiyon faktörlerini veya transkripsiyonel makine bileşenleri işe özel etkileyiciler tarafından tanınır. Kromatin immüno-çökeltmesi (chip) in vivo DNA-bağlanma ilgi duyulan proteinler için (Şekil 1) belirlenmesini sağlar. Bu prosedür, DNA çapraz bağlantı belirli kimyasalların yeteneği proteinleri yararlanır. Elde edilen DNA-protein kompleksleri daha sonra özel antikor aga kullanılarak immunopresipite edilebilirinst, transkripsiyon faktörleri, kromatin bağlayıcı proteinler ya da özel bir değişiklik ve heterolog epitopları tercih proteine ​​bağlanmış (genel olarak &quot;etiketi&quot; olarak adlandırılır). Bu İmmüno-saflaştırılmış DNA, ilgi konusu özel dizilerin zenginleşmesine değerlendirmek için kantitatif PCR (qPCR) reaksiyonlarında şablon olarak kullanılabilir. Bu şekilde, transkripsiyon faktörlerinin bağlanma bölgeleri ya da belirli genlerdeki histon işaretleri dağılımı 7,8 kurulabilir. Buna ek olarak, masif paralel sıralama sağlayan Yeni Nesil Dizileme (NGS) ile birlikte, ChIP teknoloji transkripsiyon faktörlerinin bağlanma siteleri yanı sıra histon modifikasyonları meydana çıkarıyor Epigenomik manzara genom kimlik mümkün kıldı. Ayrıca, gen ekspresyonunun eşzamanlı analiz transkripsiyonel düzenleyici bağlanması ya da belirli histon bakışı depozisyon transkripsiyonel Activi orantılı olduğunu izlenmesine olanak verirgenlerin 9 ty. Arabidopsiste ChIP protokollerin kullanılması transkripsiyonel düzenleyiciler çeşitli kromatin çiçeklenme usta genlerinin organizasyonu ve nasıl bu yapısal değişiklikler gen ifadesini etkileyen 5,6 üzerindeki etkisini değerlendirmek izin verdi. Önceki sonuçlar KISA GÜN İÇİNDE Arabidopsis odağı ERKEN cIVATALAMA (EBS) bu gen gösterisinde çiçeklenme ve çiçeklenme FT ana geninin upregülasyonu bir ivme çiçeklenme ve mutantlar bir bastıncısı gibi hareket ettiğini gösterdi. Buna ek olarak, FT-kaybı fonksiyonu mutasyonları tamamen FT ebs mutantlar erken çiçeklenme ve EBS 10 çiçeklenme bu ana geninin bastırılması için gerekli olduğu gerekli olduğunu belirten ebs mutant bitkilerin erken çiçek açan fenotip bastırmak 11. EBS özellikle histon H3 di- bağlamak ve inci de trimethylated bir PHD içeren proteinini kodlayanFT 12 kromatin aracılı bastırılması olarak EBS için bir rolü olduğunu düşündürmektedir e lizin 4 Kalıntı (/ 3 H3K4me2). ChIP yaklaşımının kullanılması Arabidopsis PHD içeren protein EBS 10,11 ifadesini 12 bastırmak için çiçek entegratör gen FT düzenleyici bölgeleri bağlar olduğunu göstermiştir. ChIP teknolojisi kullanımı yoluyla elde edilen ek veriler bu proteinin Arabidopsis gelişmenin ilk aşamalarında çiçeklenme bu ana geninin kromatin histon asetilasyon, aktif transkripsiyon bir damgasını düşük seviyelerde, korumak için gerekli olduğunu göstermiştir. Birlikte genetik ve gen ifadesi verileri Bu gözlemler, bu Arabidopsis PHD içeren protein çiçek entegratör geninin FT 12 ifadesini modüle etmek suretiyle çiçeklenme zamanı ince ayar merkezi bir role sahip olduğunu göstermektedir. Burada sunulan çalışma histonlarının analizi için değil, aynı zamanda diğer için değil, sadece yararlı optimize edilmiş bir yöntem sağlarkromatin proteinleri ilişkili ve artan verimlilik ve deneysel süreyi azalttı. Ayrıca, bu rapor ChIP protokollerin kullanımı Arabidopsis çiçeklenme başlangıcı ile ilgili gen ifadesinin kontrolü etkisi bu kromatin aracılı mekanizmalar kromatin modifikasyonları değişiklikler ve bitki genlerinin transkripsiyonel devletler arasındaki ilişkiye yeni anlayışlar sağladı ve nasıl nasıl gösterir.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>MS (Murashige ve Skoog Bazal Tuz Karışımı)</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit %37&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F8775-25</td><td>Çeker ocak altında kullanın</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü karışımı cOmplete ULTRA Tabletler, Mini, EDTA içermeyen, EASYpack</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Standart sonikasyon cihazı</td><td>Diagenode</td><td>B01010002 (UCD200TO)</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Arıtma Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Protein A veya protein G ile birleştirilmiş Dynabeads manyetik boncuklar</td><td>Life Technologies</td><td>10003D/10001D</td><td>Üreticinin kontrol edin Antikor afinitesi için s kılavuzu</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Merck Millipore</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Yüzey Fact-Amps Deterjan Çözeltisi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>85112</td><td></td></tr> <tr><td>(fare, sıçan, tavşan ve hellip;)-IgG</td><td>Diagenode</td><td>C15400001, C15420001, C15410206</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik raf - DynaMag-2</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>H3K9/14ac poliklonal antikor - Premium&nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>C15410200-10</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100 Reçine</td><td>Bio-Rad</td><td>142-2832</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Life Technologies</td><td>17916</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myc Tag Antikor, klon 4A6</td><td>Millipore</td><td>05-724</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Yeşil I</td><td>Master Roche 4707516001</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

arabidopsis protein-dna etkileşimleri tespiti için kromatin immunoprecipitation deneyi<em&gt; İn vivo</em

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Karmaşık gen düzenleyici ağlar, bitkilerdeki biyolojik süreçleri ve gelişimsel geçişleri düzenler. Genlerin seçici transkripsiyonel aktivasyonu ve susturulması, bitkilerin çevresel sinyallere ve gelişimsel ipuçlarına tepkisine aracılık eder. Bu nedenle, bitkilerde biyolojik süreçlerin nasıl düzenlendiğine dair derin bir anlayış kazanmak için bitki gen ekspresyonunu kontrol eden mekanizmalara ilişkin içgörüler çok önemlidir. Burada tarif edilen kromatin immünopresipitasyon (ChIP) tekniği, Arabidopsis thaliana model türünün genlerindeki veya genomik bölgelerindeki proteinlerin DNA bağlanma bölgelerini tanımlamak için bir prosedürdür. Transkripsiyon faktörleri, kromatin proteinleri veya histonların translasyon sonrası modifiye edilmiş versiyonları gibi ilgilenilen proteinlerin DNA'sı ile etkileşimleri, ChIP protokolü ile verimli bir şekilde analiz edilebilir. Bu yöntem, protein-DNA etkileşimlerinin in vivo olarak fiksasyonuna, kromatinin rastgele parçalanmasına, protein-DNA komplekslerinin spesifik antikorlarla immünopresipitasyonuna ve ilgilenilen protein ile ilişkili DNA'nın PCR teknikleri ile miktar tayinine dayanmaktadır. Bu metodolojinin Arabidopsis'te kullanılması, çeşitli bitki biyolojik süreçlerini kontrol eden transkripsiyonel düzenleyici mekanizmaların ortaya çıkarılmasına önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Bu yaklaşım, Arabidopsis kromatin proteini EBS'nin bağlanma bölgelerinin, çiçeklenme FT'nin ana geninin düzenleyici bölgelerine tanımlanmasına izin verdi. Bu proteinin FT'nin genomik bölgesinde belirli histon işaretlerinin birikimindeki etkisi de ChIP analizi ile ortaya çıkarıldı.

Sekiz temel adım büyüyen ve bitki malzemesi, kromatin çapraz bağlanması, kromatin izolasyon, kromatin parçalanması, DNA arasındaki komplekslerin seçici izolasyonu hasat içeren in vivo protein-DNA etkileşim tanımlanması için bu yonga protokolde saydı edilebilir immüno-protein sindirimi, DNA saflaştırma ve qPCR analizi (Şekil 1), ilgi konusu bir protein. ChIP protokolünde çok önemli bir aşaması, bir çapraz bağlanma reaksiyonunda DNA-protein etkileşimlerinin fiksasyondur. Tipik haliyle, formaldehi...

Kromatin immüno-çökeltmesi DNA in vivo olarak Arabidopsis proteinlerin bağlanma yerlerinin tanımlanması için güçlü bir tekniktir. Bu prosedür, kromatin çapraz bağlama ve parçalanma, ilgi konusu proteine ​​karşı seçici antikorlar ile immünopresipitasyon ve bağlı DNA qPCR analizini içermektedir. Biz, Arabidopsis bitkiler için optimize edilmiş basit ChIP tahlili tarif eder.

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Bu prosedürün genel amacı, arabidopsis hücrelerinin kromatinindeki proteinler ve DNA arasındaki etkileşimleri ortaya çıkarmaktır. Bu yöntem, hangi genlerin belirli bir transkripsiyon faktörü tarafından düzenlendiği veya genlerin transkripsiyonel durumlarıyla hangi sistem modifikasyonlarının ilişkili olduğu gibi bitki biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çapraz bağlama adımı sayesinde, bitki gelişimi sırasında meydana gelen kromatin organizasyonundaki değişikliklerin sabitlenmesini ve yakalanmasını mümkün kılmasıdır.Bu yöntem, Arabidopsis thaliana'daki protein etkileşimleri hakkında bilgi sağlayabilse de farklı bitki takımlarına uygulanabilir ve diğer bitki türlerine uyarlanabilir. Bu prosedürü, laboratuvarımızdaki iki doktora öğrencisi Dorota Komar ve Alfonso Mouriz gerçekleştirecek. Arabidopsis'i metin protokolüne göre yetiştirdikten sonra, 1,5 gram bitki materyalini 50 mililitrelik tüplere toplayın ve çapraz bağlama işlemi sırasında buz üzerinde tutun.Ardından, tüp kapaklarında küçük delikler açmak için laboratuvar beki ile ısıtılmış bir iğne kullanın. Tüplere 40 mililitre 1x pbs ve 1,08 mililitre formaldehit ekleyin. Tüp kapaklarını vidalayarak kapatın ve tüpleri bir desikatöre yerleştirin.10 dakika boyunca vakumla sızdırma işlemi uygulayın, ardından çözeltinin çalkalanmasını önlemek için vakumu dikkatlice serbest bırakın. Numuneyi karıştırdıktan sonra, vakum ve karıştırma adımlarını tekrarlayın. Sızdırma işlemi tamamlandığında, bitki materyalini gözlemleyin ve hafifçe yarı saydam hale geldiğini ve tüpün dibine çöktüğünü doğrulayın.Final konsantrasyonu 0.125 molar olacak şekilde 2,5 mililitre iki molar glisin ekleyin ve beş dakika boyunca vakum uygulayın. Vakumu bıraktıktan sonra, tüpleri ters çevirerek ve çözeltinin kapaklardaki deliklerden damlamasına izin vererek çözeltiyi uzaklaştırın. Bitkiçikleri iki kez durulamak için pbs kullanın ve bir kez su ile durulayın.Ardından, sıvı azotla dondurmadan önce fideleri bir kağıt havlu üzerinde kurulayın. Her immünopresipitasyon için, 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde 15 mikrolitre manyetik boncuk hazırlayın. Boncuklara bir mililitre kromatin immünopresipitasyon veya chip dilüsyon tamponu ekleyin, rotasyonla karıştırın ve 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünü manyetik bir rafa yerleştirin.Boncukların yaklaşık bir dakika boyunca mıknatısa tutunmasını bekledikten sonra, yıkama işlemini tekrarlamadan önce üst fazı uzaklaştırmak için bir pipetman kullanın. Boncukları 200 µL çip dilüsyon tamponu içinde yeniden süspanse edin. İmmünopresipitasyon için, her bir bitki körlemesi için hazırlanan iki tüpten birine gerekli miktarda spesifik antikor ekleyin.Başarılı bir ChIP deneyindeki temel faktör, ilgilenilen proteinin immünopresipitasyonu için seçilen antikordur. Bitki transkripsiyon faktörlerine karşı üretilen antikorlar ChIP deneyleri için faydalı olabilir, ancak serumun kapsamlı bir şekilde test edilmesi gerekir. Örneğin, yalnızca Western blot analizi ile kontrol edilen antikorlar, ChIP için mutlaka geçerli olmayabilir.Negatif kontrol olarak, ikinci tüpe aynı miktarda non-spesifik IGG ekleyin. Antikorun boncuklara bağlanmasını sağlamak için tüpleri dört derece Celsius'ta, döner bir düzenek üzerinde gece boyunca inkübe edin. Donmuş bitki materyalini, toz homojen ve açık yeşil hale gelene kadar sıvı azot içerisinde havan ve eliyle iyice öğütün.Tozu yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın. Bir çeker ocuk altında, 30 mililitre ekstraksiyon tamponu bir ekleyin ve doku tozunu ıslatmak için iyice karıştırın. Bu adımdan itibaren örnekleri her zaman dört derece Celsius'ta tutun ve ilerlemeden önce dokunun tamamen çözüldüğünden emin olun.Süspansiyonu, 22 ila 25 mikrometre gözenek boyutuna sahip bir filtrasyon kağıdından geçirerek yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarıp temizleyin. Ardından 1.000 ×g'de ve dört derece Celsius'ta 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Yaklaşık iki mililitre hacmindeki peletten süpernatantı nazikçe dekante edin.Beş mililitre ekstraksiyon tamponu iki ile peleti yeniden süspanse edin. Ardından, 1,000 ×g ve dört °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı dökten sonra, peleti 300 µL ekstraksiyon tamponu üç içinde yeniden süspanse edin.Ayrı bir tüpe 600 µL ekstraksiyon tamponu üç ekleyin ve ardından yeniden süspanse edilen peleti temiz tamponun üzerine dikkatlice katmanlandırın. Tüpü 4 °C'de, 16.000 ×g'de bir saat boyunca santrifüjleyin, ardından süpernatantı bir pipetle aspire edin. Sonrasında, sonikasyon verimliliğini etkileyebilecek kabarcık oluşumundan kaçınarak, nükleer peleti yavaşça yeniden süspanse etmek için 300 µL sonikasyon tamponu kullanın.Süspansiyonu dikkatlice temiz, 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Çekirdekleri liz etmek ve kromatini rastgele 200 ila 600 baz çifti uzunluğunda fragmanlara ayırmak için süspansiyonu sonikasyona tabi tutun. DNA fragman boyutlarını agaroz jel üzerinde doğrulayın, ardından çözeltiyi 12.000 ×g'de ve dört °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatanı yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın ve pelletini atın. Süpernatanın onda birini yeni bir tüpe alıkotlayın ve -20 °C'de dondurmadan önce "input" olarak etiketleyin. Son olarak, nihai SDS konsantrasyonu %0,1 olacak şekilde, kromatini chip dilüsyon tamponu ile on kat seyreltin.Numuneler daha sonra dondurulabilir ve birkaç hafta boyunca -20 °C'de saklanabilir. Boncuklar antikorlarla gece boyunca inkübe edildikten sonra, boncukları üç kez yıkamak için 1 mL çip seyreltme tamponu kullanın, ardından boncukları 1 mL seyreltilmiş kromatin içinde yeniden süspande edin ve tüpü 4 °C'de bir döner çark üzerinde gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, boncukları 4 °C'de manyetik rafa yerleştirin ve solüsyonu uzaklaştırdıktan sonra, boncukları iki kez yıkamak için 1 mL düşük tuzlu yıkama tamponu kullanın, ardından boncukları bir kez yıkamak için yüksek tuzlu yıkama tamponu kullanın.Boncukları bir kez yıkamak için bir mililitre lityum klorür yıkama tamponu kullandıktan sonra, boncukları iki kez yıkamak için bir mililitre TE tamponu kullanın. TE yıkama tamponunu tamamen uzaklaştırmak için aspire edin. Giriş örnekleri çözündüğünde, her birinden beş mikrolitre yeni 1,5 mililitrelik tüplere aktarın ve bundan sonraki aşamalarda çip örneklerine benzer şekilde işlem yapın.Yüzde beş şelasyonlu iyon değişim reçinesinin 200 µL'sini ekleyerek çapraz bağlanmayı geri döndürün ve her iki ila üç dakikada bir çalkalayarak 95 °C'de 10 dakika inkübe edin. 16.000 ×g'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı dikkatlice yeni mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Proteinleri sindirmek ve DNA'yı serbest bırakmak için 2 µL 10 mg/mL proteinaz K ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.Reaksiyonu durdurmak için 95 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin, 16.000 ×g'de 30 saniye boyunca hızlıca santrifüjleyin ve süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. DNA'yı metin protokolüne göre temizledikten sonra su ile 1/10 oranında seyreltin ve qPCR ile bağlanma bölgelerinin bolluğunu ölçmek için reaksiyon başına 5 µL kullanın. Verileri metin protokolüne göre analiz edin.Arabidopsis yaprakları balmumu tabakalarıyla kaplıdır ve trikomlar hava kabarcıklarının oluşumunu kolaylaştırır; bu durumların her ikisi de çapraz bağlama reaktiflerinin bitki dokusuna nüfuz etmesini zorlaştırır. Burada, fiksasyon verimliliğini artırmak için vakumlu çapraz bağlamaya tabi tutulmuş fidan örnekleri gösterilmektedir. Bu şekil, burada gösterildiği üzere, sonikasyon döngüsü sayısındaki artışın çip örneklerindeki DNA'nın ortalama boyutunu kademeli olarak azalttığını ve 20 ila 30 döngü sonrası 200 ila 600 baz çifti aralığında optimum zenginleşmeye ulaşıldığını kanıtlamaktadır.Bu şekilde görüldüğü üzere, çiçeklenmenin ana geni olan FT lokusunun transkripsiyonel düzenlemesi için önemli dört bölge analiz için seçilmiştir. Chip sonuçları, EBS proteininin test edilen dört bölgeden birine, FT'nin transkripsiyonel başlangıç bölgesine yakın bir düzenleyici diziye bağlandığını göstermektedir. Son olarak, transkripsiyonel olarak aktif kromatinle ilişkili olan, dokuz ve 14 numaralı lizinlerde asetillenmiş histon h3'e yönelik bir antikor kullanılarak gerçekleştirilen chip deneyleri, test edilen FT'nin dört genomik fragmanının tamamında, mutant DBS'de yabani tip bitkilere kıyasla daha yüksek H3K9/14ac bolluğu ortaya koymuştur; bu durum, söz konusu mutanda çiçeklenmenin bu ana geninin gözlemlenen yukarı düzenlemesiyle tutarlıdır. Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, uygun şekilde uygulandığında iki günde tamamlanabilir.Bu prosedürün, gen ekspresyon analizi gibi diğer önlemlerle birlikte uygulanması; proteinin DNA'ya bağlanmasının biyolojik rolü nedir? Transkripsiyonel aktivasyonla mı yoksa represyonla mı ilişkilidir? Ve hangi histon modifikasyonları eşlik etmektedir? gibi diğer soruların yanıtlanmasına katkıda bulunabilir.Geliştirilmesinin ardından bu teknik, bitki epigenetiği alanındaki araştırmacıların redüktif hücrelerimizdeki kromatin durumlarını keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Ve bu, diğer bitki türlerine de genişletilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, ilgilendiğiniz Arabidopsis proteininin in vivo olarak DNA'ya bağlanmasını nasıl analiz edeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.2-metoksietanol, formaldehit veya sonikatör reaktifleri, patojenler ve kök mutasyonlar ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedür uygulanırken koruyucu kıyafetler, eldivenler veya işitme koruyucuları gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

chromatin-immunoprecipitation-assay-for-identification-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Basma, bitki ve memeli üreme bir olgudur. DNA metilasyon, imprinting mekanizmaları önemli bir rol oynar. Endosperm Yalıtımlı ve baskılı genlerinin metilasyon durumunun...

Baskılı Genler DNA metilasyon Belirlenmesi Arabidopsis Endosperm

Özgü bitki genleri histon değişiklikleri algılamak için güvenilir ve faydalı bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yaklaşım, kromatin immunoprecipitation (ChIP) ve gerçek zamanlı kantitatif PCR birleştirir. Çeşitli fizyolojik süreçlerde bir rol ile spesifik genlerin histon modifikasyonları tespiti sağlar.

Bitki Leaves Histon değişiklik tespiti

Biz bitki protein-protein etkileşimleri test etmek için bir teknik geliştirdik. Sarı floresan protein (YFP) örtüşmeyen iki parça halinde bölünmüş durumda. Her parçası füzyon proteinleri ifade sağlayan, Gateway sistemi üzerinden ilgi bir gen-frame klonlanmış. YFP sinyal Sulandırma sadece tahkikat proteinler etkileşime girdiğinde oluşur.

Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti

Bu video, protein-DNA etkileşimlerini göstermek için klasik bir teknik olan kromatin immünopresipitasyon (ChIP) testi için protokolü açıklar. Bu teknik, insan kronik lenfositik lösemi hücrelerindeki hedef genleri tanımlamak için kullanılır.

Kromatin İmmünopresipitasyon Deneyi: Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimlerini İncelemek İçin Bir Teknik

Bu videoda, proteine bağlı kromatin fragmanlarının seçici immünopresipitasyonu yoluyla oligodendrosit öncü hücrelerinin genomik DNA'sının belirli bölgelerindeki protein bağlanma bölgelerini tanımlamak için kromatin immünopresipitasyon tekniğini gösteriyoruz. Bu yöntem, gen regülasyonunda yer alan transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere çeşitli düzenleyici proteinlerin etkileşimini incelemeye yardımcı olur.

Genomik DNA Üzerindeki Hedef Protein Bağlanma Bölgelerini Belirlemek için Kromatin İmmünopresipitasyonu

Biz gelen geliştirmenin erken aşamalarında embriyo izole için etkili ve basit bir yöntem...

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohumlar

Biz İmmunosteyn, floresan in situ hibridizasyon, tüm montaj Arabidopsis thaliana ovüllerindeki kantitatif, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile takip DNA boyama için burada etkin ve güvenilir bir protokol sağlar. Bu yöntem başarıyla kromatin modifikasyonları ve nükleer mimarisi kullanılarak analiz edildi.

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem<em&gt; Arabidopsis</em

Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanan bir etkileşimli yakalama protokolünü sunuyoruz. Bu yöntem kritik olarak in vivo UV çapraz bağlanmaya dayanır ve fizyolojik bir ortamdan bitki mRNA'ya bağlanan proteinlerin izole edilmesine ve tanımlanmasına izin verir.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

Bu el yazması luciferase etkinlik ölçümü temel protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için kolay ve hızlı deneysel bir işlem açıklanır.

Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için

Bu protokol, dondurulmuş dokulardan kromatin preparatına odaklanır ve Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ve ardından kantitatif PCR analizi (X-ChIP-qPCR) veya yeni nesil dizileme yaklaşımları (X-ChIP-seq) için uygundur.

Kromatin İmmünopresipitasyon Analizi için Dondurulmuş Kimerik Karaciğer Dokusundan Kromatin Ekstraksiyonu

Burada, model olarak AT4G18020 (APRR2)-AirID proteini kullanarak salatalıkta (Cucumis sativus L.) yakınlık etiketleme (PL) deneyini gerçekleştirmek için adım adım bir protokol sunuyoruz. Yöntem, bir vektörün inşasını, agroinfiltrasyon yoluyla bir yapının dönüşümünü, biyotin infiltrasyonunu, protein ekstraksiyonunu ve afinite saflaştırma tekniği ile biyotin etiketli proteinlerin saflaştırılmasını açıklar.

Bitkilerde protein-protein etkileşimi için AirID tabanlı yakınlık etiketlemesi

Öğrenin, Arabidopsis bitkilerinde protein-DNA etkileşimlerini tespit etmek için kromatin immunoprecipitation (ChIP) yöntemini. Bu teknik, bitki biyolojisinde gen düzenlemesi mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi

Daha fazla video keşfet