Gerçek zamanlı Ekstrasellüler Flux Analizi Polarize M1 ve M2 Kemik İliği-türevli Makrofagların Metabolik Karakterizasyonu

Bu hücre dışı akı analizinin genel amacı, iki polarize kemik iliği türevi makrofaj olan naif M1 ve M'nin metabolik özelliklerini değerlendirmektir. Bu yöntem, belirli sitokinlerin, bileşiklerin veya geno kodlarının makrofajların metabolik fenotipini nasıl etkilediğini araştırmak için bir çerçeve görevi görebilir. Bu tekniğin temel avantajı, sadece az miktarda makrofaj gerektirmesidir.

Ayrıca, ilgili tüm glikoliz ve mitokondriyal parametreleri tek bir tahlilde ölçer. Bu yöntem, kemik iliği kaynaklı makrofajların metabolik fenotipi hakkında bilgi sağlasa da, tüm makrofaj veya bağışıklık hücresi türlerine de uygulanabilir. Bu yöntemi J'de yayınlama fikrimiz vardı, çünkü diğer bilim adamlarından metabolik erişim hücresel akı deneylerinde onlara yardımcı olmaları için sık sık talepler alıyoruz Kültürün sekizinci gününde, olgun makrofajların varlığını görsel inceleme ile doğrulayın ve olgun kemik iliği türevi makrofajları 10 mililitre sitrat salin içinde beş dakika boyunca inkübe edin.

Hücreler ayrıldığında 37 santigrat derece. Kültürü 10 mililitre PBS ile yıkayın ve canlı hücrelerin sayısını sayın. Daha sonra kuyucuk başına 10 ila dördüncü hücreye beş kez tohumlayın.

Bir XFE 96 hücre kültüründe, pipeti her bir oyuğun kenarının yaklaşık yarısına kadar bir açıyla tutarak, oyuk başına 100 mikrolitre kültür ortamında mikroplaka. Hücreleri dağıtmak için, arka plan düzeltme kuyuları A bir, A 12, H one ve H 12'ye tek başına ortam ekleyin. Daha sonra hücrelerin bir saat boyunca bir hücre kültürü davlumbazında oda sıcaklığında çökmesine izin verin.

Yapışma kültürünü onayladıktan sonra, hücreler 37 derece Santigrat derece% 5 karbondioksit inkübatörinde. Kaplamadan üç saat sonra, 24 saat boyunca uygun olduğu şekilde koşul başına dört ila altı kuyu hücresini uyarın. Hücre dışı akı testinden bir gün önce kemik iliğinden türetilmiş makrofajları polarize etmek için, sensör kartuşunu yardımcı plakanın yanına baş aşağı yerleştirin ve her plakayı 200 mikrolitre krin solüsyonu ile iyice doldurun.

Ardından, sensörleri Cain çözeltisine daldırmak için sensör kartuşunu yardımcı plakaya indirin ve Cain çözelti seviyesinin sensörü su altında tutacak kadar yüksek olduğunu doğrulayın. Ardından kartuşu gece boyunca karbondioksit olmayan 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. Ertesi gün, süpernatanı polarize makrofajlardan nazikçe çıkarın ve hücreleri 100 mikrolitre taze hazırlanmış tahlil ile yıkayın.

Kuyu başına orta. Her oyuğa 180 mikrolitre tahlil ortamı ekleyin ve hücrelerin yıkanmadığını doğrulamak için mikroskobu kullanın. Hücreler hala bağlıysa, hücreler inkübe edilirken plakayı tahlil çalışmasından bir saat önce 37 santigrat derece karbondioksit olmayan inkübatöre yerleştirin.

Tabloda belirtildiği gibi 10 x enjeksiyon bileşiği karışımını hazırlayın ve karışımları 37 santigrat dereceye ısıtın. Ardından, hücre dışı akı tahlili ile polarize makrofajların biyoenerjisini karakterize etmek için sağlanan yükleme kılavuzlarını kullanarak sensör kartuşunu uygun hacimlerde bileşik ve A, B, C ve D portları ile yükleyin. İki dakikalık karışım ve üç dakikalık ölçüm süreleri ve dört enjeksiyonun her birinden önce ve son enjeksiyondan sonra en az üç karışım ve hız ölçüm döngüsü içeren bir tahlil şablonu oluşturmak için tahlil sihirbazını kullanın.

Ardından testi başlatın ve aparat tarafından belirtilen talimatları izleyin. Cihaz ve hücre plakası tarafından kalibrasyona izin vermek için kartuş plakasının hidratlı problarla yüklenmesi. Talimat verildiğinde, tahlilin sonunda, tüm tahlil ortamını dikkatlice atın ve analiz edilen hücre kültürü mikroplakasını normalizasyona kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Hücre proliferasyon tahlil kitini kullanarak hücreleri normalleştirmek için, plakayı çözün ve hücreleri, oda sıcaklığında beş dakika boyunca oyuk başına 200 mikrolitre taze hazırlanmış hücre lizis tamponunda inkübe edin. Son olarak, floresansı yaklaşık 480 nanometre uyarma ve yaklaşık 520 nanometre emisyon maksimumu ile ölçün. Tüm naif makrofaj kuyularının ortalama hücre sayısının bir olarak ayarlandığı oranı hesaplamak için elde edilen floresan ölçümlerini kullanarak, daha sonra bu oranları denizatı dalga analiz yazılımına aktarın.

Verileri normalleştirmek için, bir hücre dışı akı tahlili tipik olarak hücre dışı asitleşme oranı veya ECAR ve oksijen tüketim oranı veya OCR grafikleri verecektir Glikoz enjeksiyonundan sonra bu temsili şekilde gösterildiği gibi, ECAR'da gözlenen artış glikoliz oranını temsil eder. Tüm liga misin ile bir TP sentaz inhibisyonundan sonra ECAR'da gözlenen ek artış, glikolitik rezerv ve kapasite hakkında daha fazla bilgi sağlar. OCR değerlerini analiz ederken, CIN enjeksiyonu mitokondriyal A TP sentezi için kullanılan oksijen tüketiminin hesaplanmasını kolaylaştırır, FCCP mitokondriyal solunumu ayırır.

Karşılık gelen OCR ölçümleri, bilinen maksimum ve yedek solunum kapasitesi çürüklüğü ve antimisin a enjeksiyonu hakkında veri verir, bununla birlikte, mitokondriyal olmayan oksijen tüketimini temsil eden kalıntı OCR ile mitokondriyal kompleksleri bir ve üç bloke eder. LPS ile makrofaj aktivasyonu, artmış bir glikolitik metabolizmaya neden olur. LPS ve IL arasındaki farklarla, tedavi edilen dört makrofaj, oksijen tüketim oranları gözlendiğinde daha da belirgin hale gelir.

Gerçekten de, LPS ile tedavi edilen makrofajlarda maksimal oksidatif metabolizma yüksek oranda baskılanırken, IL dört, M, iki makrofajda sağlam bir solunuma neden olur. Bir kez ustalaştıktan sonra, hücre dışı grip testi, uygun şekilde yapılırsa iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, ayrılma sırasında maksimum solunumu beslemek için veterinere FCCP ile birlikte enjekte etmeyi unutmamak önemlidir.

Bu teknikten sonra, verimli makrofaj polarizasyonunu değerlendirmek için Eliza gibi ek testler yapılabilir. Bu teknik, immünoloji alanındaki araştırmacıların çok çeşitli bağışıklık hücrelerinin metabolik özelliklerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, makrofajların metabolik fenotipini değerlendirmek için hücre dışı akı analizinin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.