Gata4, Mef2c ve Tbx5 Optimal Oranı ifade bir polisistronik Construct kullanma Kaynaklı kardiyomiyositlerde Geliştirilmiş Nesil

Bu protokolün genel amacı, poli siyonik MGT yapısına sahip kardiyak fibroblastlardan indüklenmiş kardiyomiyositlerin nasıl verimli bir şekilde üretileceğini göstermektir ve gata dört, F iki C ve TBX beşin optimal oranını ifade eder. Bu yöntem, indüklenmiş kardiyomiyosit araştırmaları için değerli bir platform sağlar ve indüklenmiş kardiyomiyosit programlamasının tarama sonrası ve mekanik çalışmaları yoluyla yüksek düzeyde kolaylaştırırken, aynı zamanda alanı klinik uygulamalara doğru hareket ettirecektir. Bu tekniğin ana avantajı, sadece tek bir retroviral yapı kullanarak, kardiyo fibroblastların verimli bir şekilde kardiyomiyositlere dönüştürülebilmesidir.

Yenidoğan alfa miyozin ağır zincirli GFP transgenik fareyi hacimce %75 ile temizleyin. Etanol ötenazi gerçekleştirir. Daha sonra steril, künt ve bükülmüş forsepsler kullanarak bir koltuk altından diğerine yatay bir kesi yaparak vücut boşluğunu açın.

Kalbi inceleyin ve buz içeren 24 oyuklu bir plakanın bir kuyusuna yerleştirin. Soğuk PBS, floresan mikroskobu kullanarak kalp boyunca GFP ekspresyonunu gözlemler. Steril forseps ve makas kullanarak üç ila 4G FP pozitif kalbi 60 milimetre merkezli bir kuyu kültür kabına yerleştirin, kalpleri bir milimetre küpten daha küçük parçalar halinde doğrayın.

Kıyılmış kalpleri 10 santimetrelik bir tabağa aktarın ve iki mililitre fiberblast veya FB ortamı ile kaplayın. Plakaları 37 santigrat derece inkübatörde en az üç saat boyunca rahatsız edilmeden bırakın. İnkübasyonun ardından, kıyılmış kalp dokusunu içeren tabağa yavaşça sekiz mililitre ön ısıtmalı FB ortamı ekleyin.

Daha sonra, ortamı her üç günde bir değiştirmek dışında dokuyu rahatsız etmeden inkübe edin. Yedinci günde, kültür ortamını aspire edin ve hücreleri DPBS ile yıkayın. Her plakaya EDTA'da üç mililitre% 0.05 trip ekleyin ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Tripsini devre dışı bırakmak için beş mililitre FB ortamı ekleyin ve ardından hücreleri bir hücre kazıyıcı ile nazikçe ayırın. Daha sonra, hücreleri toplayın ve kalp dokusu parçalarıyla kontaminasyonu önlemek için 40 mikronluk hücre süzgeçlerinden süzün. Hücreleri, izole edilmiş yenidoğan fare kalplerinden başlayarak beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleme ile peletleyin.

Her kalbi hala gevşek bir şekilde bağlı olan dört parçaya bölün. Kalpleri sekiz mililitre ılık% 0.05 tripsin EDTA içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tripsin EDTA'yı atın ve orta hızda bir dakika boyunca beş mililitre ılık tip iki kollajenaz girdabı ekleyin ve ardından tüpü 37 derece santigrat derece su banyosunda üç ila beş dakika inkübe edin.

Ardından tüpü bir dakika boyunca tekrar girdaplayın. Doku parçalarının yerleşmesine ve süpernatanı beş mililitre soğuk FB ortamı içeren yeni bir tüpe toplamasına izin verin. Doku parçalarına beş mililitre taze tip iki kollajenaz ekleyin ve girdap ve inkübasyon adımlarını tekrarlayın.

Süpernatant içeren tüm hücreleri 40 mikronluk bir hücre süzgecinden süzerek birleştirin. Bu hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin. Her iki kardiyak fibroblast izolasyon yönteminin ardından.

Son hücre peletini 10 mililitre manyetik aktif hücre sıralamasında veya maksimum tamponda bir kez yıkayın. Canlı hücre sayımı için 10 mikrolitreyi çıkarın ve kalan hücreleri 200 kez G'de beş dakika boyunca dört santigrat derecede bir defadan daha az bir süre için 10 ila yedinci hücrelere santrifüjleyin. Hücre peletini 10 mikrolitre uyluk 1.2 konjuge manyetik mikro boncuk ile 90 mikrolitre soğutulmuş maksimum tamponda yeniden süspanse edin ve karıştırın.

Boncukları 30 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri peletlemek için 10 mililitre maksimum tampon ekleyin ve numuneleri beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin. 10 mililitre maksimum tampon ile bir kez yıkayın ve hücre peletini bir hücre kültürü davlumbazında toplam iki mililitre hacimde yeniden süspanse edin.

Bir maksimum ayırıcı ayarlayın ve bir LS sütunu ekleyin. Sütunu üç mililitre maksimum tampon ile dengeleyin. Hücre süspansiyonunu LS kolonundan geçirin ve iki mililitre maksimum tampon ile üç kez yıkayın.

Ardından LS sütununu ayırıcıdan çıkarın ve iki mililitre maksimum tampon ile üç kez elüte edin. EIT'nin 50 mililitrelik konik bir tüpte toplanması. EIT'yi beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin.

İzole fibroblastları 10 mililitre FB ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın, kardiyak fibroblastları yeniden programlamak için hücreleri önceden kodlanmış 24 oyuklu bir jelatin plakasında uygun yoğunluklarda doku kültürü kaplarına tohumlayın. Hücrelerle oturtulmuş 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 500 mikrolitre indüklenmiş kardiyomiyosit veya poli beyin içeren ICM ortamı ekleyin. İzole fibroblastların her bir kuyusuna 10 mikrolitre retrovirüs ekleyin.

Plakayı bir hücre kültürü inkübatöründe 24 ila 48 saat boyunca retroviral partiküllerle inkübe edin. Daha sonra virüs içeren ortamı 500 mikrolitre taze ICM ortamıyla değiştirin ve ortamı her iki ila üç günde bir değiştirin. ICM ortamını mililitre saf misin başına iki mikrogram ile takviye ederek viral transdüksiyonlu hücrelerin pozitif seçimine başlayın.

Üç günlük seçimden sonra, kardiyak fibroblastın kardiyomiyositlere dönüşümünü görselleştirmek için ortamı mililitre saf misin başına bir mikrogramlık bir idame dozuna değiştirin. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak GFP ekspresyonu için saf misin seçilen plakaları gözlemleyin. Son olarak, viral tedaviden 14 gün sonra, ICM besiyerini B 27 ile değiştirin.

Orta spontan atan hücre lokusları, kardiyak troponin t ve alfa dahil olmak üzere kardiyak belirteçlerin viral transdüksiyon ekspresyonunu takiben üç ila dört hafta içinde ortaya çıkabilir. Aktinin, immünokimya ile 10 ila 14. günlerde tespit edilebilir. Burada, fibroblastlardan dönüştürülen I CMS'de kardiyak troponin T ekspresyonu görülürken, ICM'lerde GFP alfa aktinin ekspresyonu burada görülebilir.

Akış sitometrisi ile yapılan analiz, özellikle indüklenmiş kardiyomiyositlerin saf misin seçimini takiben, kardiyak troponin T ekspresyonunda benzer artışlar gösterir. Burada açıklanan mitoloji, NGT transkripsiyon faktörlerinin tek bir yapıda retro viral olarak verilmesine dayalı olarak indüklenmiş kardiyomiyositlerin verimli bir şekilde üretilmesine izin verir.