Şartlı kullanarak Fare İnce Bağırsağında Yenileyici içinde Paneth Hücrelerinin Rolü analiz için protokoller Cre-lox Fare Modelleri

Bu diseksiyon prosedürünün genel amacı, fare bağırsağının nasıl izole edileceğini ve sonraki karakterizasyon teknikleri için nasıl hazırlanacağını göstermektir. Bu yöntem, deneysel bir prosedürü takiben bağırsak kök hücrelerinin bağırsağı yeniden doldurma yeteneğini araştırmak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, herhangi bir teknik veya herhangi bir prosedürü takiben veya gen manipülasyonundan sonra kullanılabilmesidir Cray kilit teknolojisini kullanma Ötenazi yapılmış bir yetişkin fareyi sırtüstü pozisyona getirerek ve kürkü% 70 etanol ile ıslatarak başlayın.

Daha sonra makas kullanarak, intraperiton boşluğunu orta hat boyunca uzunlamasına açın ve mideyi forseps ile sabitleyin. Daha sonra, yemek borusu ile olan bağlantıyı kesin ve ince bağırsağı apandise kadar çıkarmak için mideyi hafifçe çekin. Ardından, kalın bağırsağı anüse kadar çıkarmak için apendiksi yavaşça çekin.

Bağırsaklar izole edildikten sonra, ekteki mideyi çıkarın ve bağırsakları PBS ile yıkamak için künt uçlu bir pipet ucu ile donatılmış bir şırınga kullanın, yıkamadan hemen sonra bağırsağı üç eşit boyutta, proksimal, orta ve distal bölüme ayırın. Daha sonra her bölümü bir santimetrelik parçalar halinde kesin ve dokunun üç ila beş parçasını iki ila iki santimetrelik bir cerrahi bant parçasının ortasına yerleştirin. Bir piramit oluşumunda, tüm dokular tutturulduğunda, bir kütük yığını oluşturarak parçaların etrafındaki bandı uzunlamasına kapatın.

Daha sonra bandı, doku hacmine göre en az 10 kat daha fazla nötr, tamponlu, resmi ve fiksatif içeren düz tabanlı bir kaba yerleştirin ve numuneleri gömme ve kesitlere ayırmadan önce dört santigrat derecede saklayın. Fiksasyondan sonra, dokuyu yıkamadan hemen sonra Metcon'da sabitlemek için doku hacmi olarak en az %70 etanol hacminin 10 katı içeren düz tabanlı bir kaba aktarın. Bağırsağı az önce gösterildiği gibi üç eşit büyüklükte bölüme ayırın.

Daha sonra her bir bölümü 15 x 15 santimetrelik bir filtre kağıdına yan yana yerleştirin ve tüm bölümler bölündüğünde FOSS'ta bölümleri açmak için yaylı yay makası kullanın. Filtre kağıdını, fiksasyonun sonunda oda sıcaklığında üç ila 24 saat boyunca taze hazırlanmış Metcon içeren bir cam kaba aktarın, bağırsak parçalarının her birinin ucunu birer birer almak için forseps kullanın ve dokuları forsepslerin etrafına sarın ayrı ayrı İsviçre ruloları oluşturmak için. Forsepsleri hafifçe açarak ve dokudan 25 gauge bir iğne sokarak her ruloyu sabitleyin.

Daha sonra, haddelenmiş dokuları, doku patlamasının tüm Mount gevşek görselleştirmesi için işlemden önce en az bir saat boyunca nötr tamponlu formül hacminin en az 10 katı ve dokular olarak sabitleyici içeren düz tabanlı bir kaba yerleştirin. Mineral yağ ile karıştırılmış erimiş ham balmumu 15 santimetre Petri kaplarına dökün. Daha sonra bağırsakları buz gibi soğuk PBS ile yıkadıktan hemen sonra, dokuları 25 mililitre buz gibi soğuk ekskal fiksatif ile yıkayın.

Sabitlemeden sonra, bağırsakları üç ila beş eşit bölüme kesin ve her bölümü soğutulmuş balmumu plakalarından birine yerleştirin. Plakaların üst kısımlarındaki mezenterik çizgilerle bölümler hafifçe gerilecek şekilde her bir ucu aşağı doğru sabitleyin. Fazla mezenteri kesin.

Ardından, tüm bölümler sabitlendiğinde açılırken bağırsakları uzunlamasına sabitlemek için yaylı yay makası kullanın. Plakaları, dört santigrat derecede en az bir saat sonra tüm dokuları kaplayacak kadar xal fiksatif ile doldurun. Fiksatifi çıkarmak için 25 mililitrelik bir pipet veya şırınga kullanın ve dokuları bir kez 30 mililitre PBS ile yıkayın.

Ardından, oda sıcaklığında sallanma ile 30 ila 60 dakikalık bir inkübasyon için bölümleri 30 mililitre DTTD birleştirici solüsyon ile örtün. İnkübasyonun sonunda, tanrılaştırıcı çözeltiyi 25 mililitrelik bir pipet veya şırınga ile çıkarın ve dokuları 30 mililitre PBS ile doldurun. Ardından, yıkamadan sonra PBS ile mukusu çıkarmak için bir posterior pipet kullanın.

Ertesi sabah sallanan bir platformda hafif çalkalama ile karanlıkta oda sıcaklığında bir gece lekesi için PBS'yi 30 mililitre xal ile değiştirin. Bölümlerde mavi yeşil bir leke oluşmuşsa, xal'ı 30 mililitre PBS ile değiştirin. Üç dakikalık hafif çalkalamadan sonra, az önce gösterildiği gibi İsviçre ruloları yapın ve dokuları, gömmeden ve kesit almadan en az 24 saat önce dört santigrat derece doku hacminin en az 10 katı kadar uygun fiksatif hacmi içeren geniş ağızlı düz tabanlı bir kaba yerleştirin.

ROSA 26 R Laxy koşullu raportör kullanılarak, rekombine beşiklerden ekstrakte edilen DNA kullanılarak ince bağırsakta indüksiyondan üç gün sonra% 100 rekombinasyon gözlemlenebilir. Rekombine aleller için QPCR, potansiyel olarak gözlenmeyen paneth hücrelerindeki rekombinasyon nedeniyle, VI kırışık sistemi içinde rekombinasyonda önemli olmayan bir artış gösterdi. Laxy raportörünü kullanan ah kırışık sistemini kullanarak, her iki sistem de indüksiyondan üç gün sonra tam bir rekombine hücre kaybı gösterdi.

Mitoz ve K kript hücresel yükseklik verileri, ah H Cree sisteminin muhtemelen birleştirilmemiş bağırsak kök hücrelerinin yeniden popülasyonu nedeniyle iyileşebileceğini gösterdi. Tam tersine, kötü adam Cree, epitelyal kript hücrelerini korumasına rağmen iyileşemedi. Ayrıca, vi Cree Cantin B floklu farelerdeki kript hücreleri proliferatif değildi ve bağırsak kök hücre markörünün ekspresyonundan yoksundu.

EM dört. Benzer şekilde, ah cre farelerindeki kriptlerin aksine, PTH hücreleri sadece VI Cree sistemi içinde Caden b delesyonundan sonra apoptoza uğradı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık 10 dakika içinde tamamlanabilir.

Doku bozulmasını önlemek için gecikmeleri en aza indirmek önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, aşağı akış analizi için bağırsağın bir fareden nasıl çıkarılacağını iyi anlamış olmalısınız.