Name: Şartlı kullanarak Fare İnce Bağırsağında Yenileyici içinde Paneth Hücrelerinin Rolü analiz için protokoller Cre-lox Fare Modelleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Keşfedin fare ince bağırsağı izolasyonu ve Cre-lox teknolojisi kullanarak Paneth hücrelerinin intestinal epitel kök hücrelerini yenilemedeki rolünü. Bu yöntem gastrointestinal sağlık araştırmaları için temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Mark Bishop, Mathew Zverev, Victoria Marsh-Durban, Adam Blackwood ve Sylvie Robine'e teşekkür eder. Bu çalışma, Cancer Research UK tarafından sağlanan bir program hibesi ile finanse edilmiştir.

<ol><li>Cheng, H., Origin Leblond, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((differentiation+and+renewal+of+the+four+main+epithelial+cell+types+in+the+mouse+small+intestine.+V.+Unitarian+Theory+of+the+origin+of+the+four+epithelial+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types.</a> Am J Anat. 141 (4), 537-561 (1974).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).</li>
<li>Clevers, H. The gut, a clonal conveyor belt. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.molecularmovies.com/movies/view/96">http://www.molecularmovies.com/movies/view/96</a> (2015).</li>
<li>Snippert, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143 (1), 134-144 (2010).</li>
<li>Lopez-Garcia, C., Klein, A. M., Simons, B. D., Winton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+stem+cell+replacement+follows+a+pattern+of+neutral+drift%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intestinal stem cell replacement follows a pattern of neutral drift.</a> Science. 330 (6005), 822-825 (2010).</li>
<li>Buczacki, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+label-retaining+cells+are+secretory+precursors+expressing+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal label-retaining cells are secretory precursors expressing Lgr5.</a> Nature. 495 (7439), 65-69 (2013).</li>
<li>Basak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+early+fate+determination+in+Lgr5%2B+crypt+stem+cells+using+a+novel+Ki67-RFP+allele%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Mapping early fate determination in Lgr5+ crypt stem cells using a novel Ki67-RFP allele.</a> EMBO J. 33 (18), 2057-2068 (2014).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).</li>
<li>Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+the+best+routes+to+effectively+model+human+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+oncology%22%5BJournal%5D)">What are the best routes to effectively model human colorectal cancer.</a> Molecular oncology. 7 (2), 178-189 (2013).</li>
<li>Sauer, B., Henderson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+DNA+recombination+in+mammalian+cells+by+the+Cre+recombinase+of+bacteriophage+P1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85 (14), 5166-5170 (1988).</li>
<li>Brault, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+beta-catenin+gene+by+Wnt1-Cre-mediated+deletion+results+in+dramatic+brain+malformation+and+failure+of+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the beta-catenin gene by Wnt1-Cre-mediated deletion results in dramatic brain malformation and failure of craniofacial development.</a> Development. 128 (8), 1253-1264 (2001).</li>
<li>Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%CE%B2-catenin+is+essential+for+intestinal+homeostasis+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Wnt/β-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (21), 7551-7559 (2007).</li>
<li>Ireland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+Cre-mediated+control+of+gene+expression+in+the+murine+gastrointestinal+tract%3A+effect+of+loss+of+beta-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Inducible Cre-mediated control of gene expression in the murine gastrointestinal tract: effect of loss of beta-catenin.</a> Gastroenterology. 126 (5), 1236-1246 (2004).</li>
<li>Kemp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+background+recombination%3A+somatic+induction+of+Cre+by+combined+transcriptional+regulation+and+hormone+binding+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity.</a> Nucleic Acids Res. 32 (11), e92(2004).</li>
<li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis+elements+of+the+villin+gene+control+expression+in+restricted+domains+of+the+vertical+%28crypt%29+and+horizontal+%28duodenum%2C+cecum%29+axes+of+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cis elements of the villin gene control expression in restricted domains of the vertical (crypt) and horizontal (duodenum, cecum) axes of the intestine.</a> J Biol Chem. 277 (36), 33275-33283 (2002).</li>
<li>Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+crucial+role+of+paneth+cells+in+mediating+the+intestinal+response+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Evidence for a crucial role of paneth cells in mediating the intestinal response to injury.</a> Stem Cells. 31 (4), 776-785 (2013).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).</li>
<li>el Marjou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+and+inducible+Cre-mediated+recombination+in+the+gut+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium.</a> Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).</li>
<li>Guillemot, F., Nagy, A., Auerbach, A., Rossant, J., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+Mash-2+in+extraembryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Essential role of Mash-2 in extraembryonic development.</a> Nature. 371 (6495), 333-336 (1994).</li>
<li>Gregorieff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+Wnt+signaling+components+in+the+adult+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of Wnt signaling components in the adult intestine.</a> Gastroenterology. 129 (2), 626-638 (2005).</li>
<li>van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OLFM4+is+a+robust+marker+for+stem+cells+in+human+intestine+and+marks+a+subset+of+colorectal+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells.</a> Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).</li>
<li>Merritt, A., Allen, T., Potten, C., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+small+intestinal+epithelial+from+p53-null+mice%3A+evidence+for+a+delayed%2C+p53-independent+G2%2FM-associated+cell+death+after+gamma-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in small intestinal epithelial from p53-null mice: evidence for a delayed, p53-independent G2/M-associated cell death after gamma-irradiation.</a> Oncogene. 14 (23), 2759-2766 (1997).</li>
<li>Marshman, E., Ottewell, P., Potten, C., Watson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activation+during+spontaneous+and+radiation-induced+apoptosis+in+the+murine+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Caspase activation during spontaneous and radiation-induced apoptosis in the murine intestine.</a> J Pathol. 195 (3), 285-292 (2001).</li>
<li>Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+is+essential+for+intestinal+homeostasis+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells.</a> Mol Cell Biol. 27 (21), 7551-7559 (2007).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crypt+stem+cells+as+the+cells-of-origin+of+intestinal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer.</a> Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).</li>
<li>Tian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reserve+stem+cell+population+in+small+intestine+renders+Lgr5-positive+cells+dispensable%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable.</a> Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486 (7404), 490-495 (2012).</li>
<li>Adolph, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+as+a+site+of+origin+for+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells as a site of origin for intestinal inflammation.</a> Nature. 503 (7475), 272-276 (2013).</li>
<li>Marsh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Pten+is+dispensable+for+intestinal+homeostasis+but+suppresses+adenoma+development+and+progression+after+Apc+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Epithelial Pten is dispensable for intestinal homeostasis but suppresses adenoma development and progression after Apc mutation.</a> Nat Genet. 40 (12), 1436-1444 (2008).</li>
<li>Jardé, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+models+for+the+therapeutic+targeting+of+Wnt+signaling+using+a+Tet-O%CE%94N89%CE%B2-catenin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro models for the therapeutic targeting of Wnt signaling using a Tet-OΔN89β-catenin system.</a> Oncogene. 32 (7), 883-893 (2013).</li>
<li>Hung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+mouse+model+for+sporadic+and+metastatic+colon+tumors+and+its+use+in+assessing+drug+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1565-1570 (2010).</li>
<li>Dacquin, R., Starbuck, M., Schinke, T., Karsenty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+alpha1%28I%29-collagen+promoter+is+the+best+known+promoter+to+drive+efficient+Cre+recombinase+expression+in+osteoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Mouse alpha1(I)-collagen promoter is the best known promoter to drive efficient Cre recombinase expression in osteoblast.</a> Dev Dyn. 224 (2), 245-251 (2002).</li>
<li>Hinoi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+colonic+adenoma-carcinoma+progression+based+on+somatic+Apc+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse model of colonic adenoma-carcinoma progression based on somatic Apc inactivation.</a> Cancer Res. 67 (20), 9721-9730 (2007).</li>
<li>Sansom, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Apc+allows+phenotypic+manifestation+of+the+transforming+properties+of+an+endogenous+K-ras+oncogene+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (38), 14122-14127 (2006).</li>
<li>Wong, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lrig1+controls+intestinal+stem-cell+homeostasis+by+negative+regulation+of+ErbB+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling.</a> Nat Cell Biol. 14 (4), 401-408 (2012).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+Derivation+of+a+Living+Organoid+Biobank+of+Colorectal+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective Derivation of a Living Organoid Biobank of Colorectal Cancer Patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Genler ve hücrelerin fonksiyonunu incelemek için koşullu CRE-LOX transgenik fareler kullanılarak yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu modeller belirlemek ve tanımlamak kök hücreleri 2,4-6 ve hastalık 25 rollerini anlamak için bağırsaklarda büyük bir başarı ile kullanılmaktadır. Tam bu modeller yararlanmak için doğru yorumlanmalıdır verileri sağlamak için sistemin kapsamlı bir karakterizasyonu gerektirir. Bu sistemlerin tam anlaşılması nedeniyle genleri nadiren yalnız hücre tipi veya konumu, biyolojik bilgi ve Cre ifadesini uyarmak için kullanılan sistemlerin verimsizlik eksikliği özgü olmasının elde etmek zordur. Burada açıklanan yöntemler deneysel tasarım ve mevcut bilginin uygulanması yoluyla bu sorunları aşmak nasıl gösterilmektedir. Burada sunulan genel ve muri araştıran herhangi araştırma için istismar edilebilir teknikler belirli bir araştırma soruyu cevaplamak için bu yöntemleri kullanmasına rağmenne bağırsak. Bağırsak Doku Hazırlanması Sağlam sonuçlar sağlamaya yönelik önemli bir adım kesinlikle uyulması zamanında bir şekilde ve tespit protokollerinde işlenmesi gereken doku hasat ve işleme. Hemen hemen tüm önemli konular aşağı doku kuruma ve / veya eksik fiksasyonu ile ilişkili eserler isnat edilebilir. Zamanlama doku mimarisi ve / veya nükleik asitlerin ve proteinlerin bozulmasını önlemek için çok önemlidir. Eksik veya overzealous tespit histokimyasal çözünürlük kaybına neden olabilir. Yeterli zaman veya fiksatif penetrasyon İHK analizi üzerine bir &quot;gelgit işareti&quot; olarak görülebilir bağırsak kriptlerin içinde çözünürlük kaybına neden olabilir izin vermek için çok kalın bölümlere bağlı Eksik tespit. Bundan başka, nükleer β-katenin hemen yanlısı sürece çekirdeğin dışına dağılacaktır gibi tespit, çok uzun süre uzatmak etmediğini önemlidirulaşıldığı ve formalin fiksasyonu aşağıdaki gömülü balmumu. ISC Niche Paneth Hücrelerinin Rolü Burada sunulan veriler etkili bir ISC kaybını takiben yetişkin bağırsakta kript rejenerasyonu Paneth hücrelerinin önemini göstermektedir. Ancak orada Ah-CRE o vil-Cre-ER T2 hedefleri ISCs nüfusu yedek ihtimalini kalmıştır. Tian ve diğ. 26 zarif Lgr5 hi ISCs Lgr5 lo karşılık ISCs nüfusu ile ikame edildiğini göstermiştir. Şimdi bu ISCs nedeniyle rezerv nüfus salgı hücre öncüleri 6,7 olarak tespit edilerek için Ah-CRE sisteminde bağışladı olduğu muhtemel görünüyor. ISC duruma dönmek için gerektiğinde bu salgı hücre öncüleri destekleyen olgun Paneth hücrenin önemi cevaplanması gereken kalır. Paneth hücrelerinin I teşkil gibiSC niş 8 ve onların hemşirelik işlevleri kendi öncüleri uzatmak olasıdır kalır kalori alımı 27 ve inflamasyon 28 ISC yanıtlarını düzenlenmesinde rol oynamaktadır. Yeni Yaklaşımlar ve Teknoloji Etkili Model İnsan Kolorektal Kanser için ISC keşfi şimdi Clarke ve diğerleri tarafından gözden 9 barsak biyoloji ve hastalık, gen ve hücre rollerini araştırmak için yeni fare modelleri oluşturmak için kullanılan genlerin belirlenmesine yol açmıştır. Bu teknik için tek sınırlama, Cre proteinini ifade etmek için genlerin tanımlanmasıdır. Şu ISCs rutin Lgr5 gen ekspresyon modeline göre koşullu transgenik fareler kullanılarak incelenmiştir. Lgr5 promoterinden Cre ifade Fareler aPC, en yaygın olarak kolorektal kanserde mutasyona uğramış gen (CRC silmek için kullanılmıştır), Orijin 25 hücre olarak ISC gösteren. Seçerek silme bu hücrelerde diğer CRC genleri hastalığın ilerlemesi içgörü sağlanması ve yayılır örneğin. PTEN 29. ISC işlevi ayrıntılı fikir özellikle ablasyon Lgr5 insan difteri toksini reseptörü kullanılarak farelerde hücrelerin -expressing tarafından alındığını (DTR) geninin Lgr5 içine lokusu 26 çaldı. Diğer stratejiler mutant proteinlerin 30 devam eden geri dönüşümlü ifadesini sağlayan Tet-O sistemi kullanın. Farklı hücreler 31 ve yerlerde 32,33 yılında gen (ler) değiştirmek için bu araçları kullanarak kanser başlatmak nasıl anlamak, ilerleme ve 34 metastaz için kullanılır. Alternatif uyuyan güzellik transpozon sistemi kullanılarak mutajenez ÇHS yeni sürücüleri tespitidir. Farelerde, teknikleri ve genetik değişim stratejileri sürekli gelişimi daha sabırlı, ilgili modeller geliştirmeye devam ediyor. Yeni methods bağırsak epitel ve ISCs karakterizasyonu için geliştirilmiştir. Akış kullanılarak elde edilebilir epitel hücre tiplerinin oranı karakterizasyonu sitometri Lektin ve CD24 35 farklı ekspresyonu göre. Potansiyel büyük anlayış ISC biyolojide kaydedilen ilerleme ve hastalık rolleri ex vivo organoid kültür sistemi kullanılarak 36 yapılacaktır. Bu sistem, bu çoğaltma ve fizyolojik olarak daha uygun bir şekilde ayırt 3B, kültür normal ve habis ISCs sağlar. Bu kişiselleştirilmiş tıp 37 önünü, in vitro hasta örnekleri üzerinde ilaçların doğrudan test sağlayacak umulmaktadır.

Memeli bağırsak lümen yüzeyi projeksiyonları gibi kriptalarının ve parmak tekrar birimlerinden özellikleri, lümen içine çıkıntı villus olarak adlandırılan. 4 gün 1 - Bu yüzey, yaklaşık her 3 tam kendini yenileme uğrar epitel sürekli bir tabakadır. Bu dinamik Doku hızla kök hücreleri bisiklet nüfusu tarafından desteklenmektedir (ISCs, aynı zamanda kript baz kolon hücreleri olarak da bilinir) ilk olarak Lgr5 geni 2,3 kendi ifadesi ile tanımlandı. Bu hücreler Lieberkühn kript altındaki özel bir niş bulunmaktadır. Başlangıçta, ISCs hızla bisiklet vardı keşif kök hücre doğada sakin olduğunu hakim fikri ile uyumsuz oldu. O durgun etiket nüfus crypt tabanına göre 4 pozisyonunda hücreleri, istinat öne sürülmüştür Lgr5 + ISC tanımlanmasına Önceki, ISCs 1 idi. Son zamanlarda yapılan araştırmalar hşimdi öncelikle kader komşuları 4,5 düzenlenir her crypt ekipotent bisiklet ISCs bir havuz olduğunu göstererek bu gözlemleri barıştırdı. Halinde bunlar, bu normalde salgı soyu adadık ancak ISC nüfus 6 hasar görmüşse ISCs dönebilirsiniz durgun hücreleri tarafından değiştirilebilir kaybolur. ISC komşuları ISCs veya kızları hücreler olabilir ya. ISCs çarpma ve hangi hatlar bağırsak lümen 1 epitel tabaka oluşturan özelleşmiş hücre tiplerine ayırt naif kızı hücreleri üretirler. Goblet, enteroendokrin, enterositler, püskül ve M hücreleri çeşitli emici ve düzenleyici işlevleri sağlamak lümen yüzeyine yukarı göç, ancak, Paneth hücreleri ISCs ile iç içe bulunmamakta crypt dibinde kalır. Son yıllarda ortaya konmuştur, bu naif kız çocuğu bir kısmınınbir salgı soy için mukadder er hücreleri yaralanma 6,7 üzerine bir ISC geri döndürme yeteneğine Lgr5 lo hücrelerini koruyarak hareketsiz etiket vardır. Nedeniyle kript rejenerasyon önemi bir öncelik ISCs ve komşuları, özellikle Paneth hücreleri arasındaki etkileşimleri anlamaya yerleştirildi. Paneth hücrelerinin ISCs 8 destekleyen niş önemli bir rol oynamaktadır. Bakterisit ürünlerinin yanı sıra Paneth hücrelerinin ISC yenileme veya farklılaşmasını düzenleyen yolları aktive sinyal molekülleri üretirler. Önceki çalışmalar onların kızları Paneth hücreleri 8 tarafından sağlanan temel niş sinyalleri için rekabet edebilecek ne zaman Lgr5 + ISCs sadece var olduğunu gösterdi. Bu çalışmalar, normal Lgr5 + ISCs üzerinde değil, onlar zarar ve bir Lgr5 lo nüfus ikmal gerektiren bir durumda Paneth hücrelerinin rolü incelenmiştir. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Biz transgenik fare modelleri 9,10 kullanılarak hücrelerin ve / veya genlerin işlevsel rolünü incelemek bağırsak biyoloji ve model hastalığını anlamak için. Sıkça bu modeller şartlı gen (ler) 9,10 değiştirmek için CRE-lox teknolojisini kullanmaktadır. Cre rekombinaz bakteriyofaj P1 izole integraz ailesinin bir site özgü rekombinaz olduğunu (rekombinasyon Nedenleri). Cre tanımlanan 34 bp arasındaki alana özgü rekombinasyon katalize &#39; Lox P &#39;siteleri (geçit P1 odağı χ). Fareler genetik Cre rekombinazın ifadesi üzerine eksize ilgi alanları kuşatan LoxP siteleri içerecek şekilde tasarlanmıştır. Bir hücre ya da gelişimsel belirli bir promotere Cre geni ekspresyonunu bağlama işleminin tahrip edici bir mekansal biçimde 9,10 yapılabilmesi için, bu oluşum safhasındaki ölümcül mutasyonlar aşılmasında özellikle yararlıdır sağlar. Ayrıca, bir alıcı yolu Cre ifade bağlayanBu yapay aktive edilebilir, zamansal değişiklikler izin verir. Bu teknolojiyi kullanarak, biz bağırsak epitel CatnB genini 11 inaktive. β-katenin, CatnB gen ürünü, ISC homeostazı tabi doğal Wnt sinyal yolunun bir anahtar düzenleyicisidir. Bu stratejiyi kullanarak iki önceki çalışmalarda çelişkili sonuçlar 12,13 üretti. AEVR ve ark., 12 tarafından yapılan çalışmada, kök hücre ve bağırsak homeostazisinin kaybı gösterdi. İrlanda ve ark. Oysa 14 çalışma hücre canlılığında bir azalma, aşağıdaki kript-villus ekseni CatnB eksprese vahşi tip hücrelerden yeniden doldurulur olduğunu bildirdi. Bu çalışmalarda önemli fark bağırsak epitel Cre ifade etmek için kullanılan promotör oldu. AEVR ve diğ., Çalışma t tatbik edilmesiyle aktive edilebilir östrojen reseptörüne bağlanmış villin gen promotörü kullanılıramoxifen (vil-Cre-ER T2) 15,16. Buna karşılık Ireland ve arkadaşlarının., Ksenobiyotik β-naphthoflavone (Ah-CRE) yanıt olarak Cre sentezlenmesini tahrik etmek için, sıçan sitokrom P450A1 (CYP1A1) geni promoter dizisi kullanılmıştır. Bu farklı sistemlere dair özellikler bu farklı gözlemler için hesap, iki hipotez oluşturulur. CatnB daha verimli ve böylece alt repopulation seviyelerine ISCs sayısını azaltarak, Ah-CRE kıyasla vil-Cre-ER T2 sistemi kullanılarak ISC silinir ilk. Alternatif olarak farklılaşmış bir hücre popülasyonunda CatnB silme diferansiyel kaynaklanıyordu. Vil-Cre-ER T2 sistemi hedefleri Ah-CRE sistemi ise crypt ve villuslarının tüm epitel hücreleri yalnızca ISC niş ve crypt olmayan Paneth hücreleri hedefliyor. Bu sistemler Behav incelenmesi için ideal araçlar teminISCs ve ior ve Paneth hücreleri ile etkileşimi. İşte biz Paneth hücrelerinin yaralanma 17 bağırsak cevabı aracılık önemli bir rol oynadığını belirlemek için bu sistemlerin nasıl kullandığını dayalı birçok detaylı protokoller sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>Asetat tamponu</td><td>*</td><td>*</td><td>100 ml yapmak için: 4,8 ml 0,2 M Asetik asit, 45,2 ml 0,2 M Sodyum asetat ve 50 ml damıtılmış su</td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>C/0400/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Asetik anhidrit</td><td>Sigma</td><td>A6404</td><td></td></tr><tr><td>Asetik anhidrit çözeltisi</td><td>*</td><td>*</td><td>2 M Asetik anhidrit 0,1 M trietanolamin hidroklorür</td></tr><tr><td>Alcian Blue</td><td>Sigma</td><td>A5268</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue pH 2.5</td><td>*</td><td>*</td><td>500 ml yapmak için: 15 ml asetik asit, 5 g Alcian Blue & 485 ml damıtılmış su</td></tr><tr><td>anti-digoksijenenin alkalin fosfataz konjuge antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab119345</td><td></td></tr><tr><td>B(beta)-Naftoflavon</td><td>Sigma</td><td>N3633</td><td>BNF, çözeltinin çok fazla soğumasına izin vermeden enjekte edin, çünkü bileşik çözeltiden düşecektir. Çözüm yeniden kullanılabilir &ndash; -20 & °C'de saklayın; C kullanımlar arasında, iki defadan fazla ısıtmayın.</td></tr><tr><td>Bloxall</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>SP-6000</td><td></td></tr><tr><td>BM mor</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td>Sığır serum albümini</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C/4920/17</td><td></td></tr><tr><td>Sitrat Tamponu/Antijen Maskeleme</td><td>Çözme Çözeltisi Vektör Laboratuvarları</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>Mısır yağı</td><td>Sigma</td><td>C8627</td><td></td></tr><tr><td>Ayrıştırma çözeltisi</td><td>*</td><td>*</td><td>500 ml için: 50 ml gliserol, 50 ml Tris 0.1M pH8.8, 100 ml EtOH, 300 ml salin (suda %0.9 NaCl), DTT 1.7 g.&nbsp; Mucikiye edici çözelti önceden yapılabilir ve saklanabilir, ancak DTT inkübasyondan hemen önce eklenir (340 mg / 100 ml).</td></tr><tr><td>DEPC arıtılmış su</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>750023</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>101509944</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>O3690</td><td>0.5M</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/17</td><td></td></tr><tr><td>Filtre kağıdı</td><td>Whatman</td><td>3000917</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Formalin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>SLBL11382V</td><td>Nötr tamponlu formalin</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>F5786</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehye</td><td>Sigma</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksilen</td><td>Raymond A Kuzu</td><td>12698616</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-053</td><td>HBSS (-MgCl2+; -CaCl2)</td></tr><tr><td>Hibridizasyon tamponu</td><td>*</td><td>*</td><td>&nbsp; 5&kez; SSC, %50 formamid, %5 SDS, 1 mg/ml heparin, 1 mg/ml buzağı karaciğeri tRNA</td></tr><tr><td>Hidrokinon</td><td>Sigma</td><td>H9003</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB Peroksidaz</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Immpress HRP Anti-Fare IgG Kiti</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>MP-7402</td><td></td></tr><tr><td>Immpress HRP Anti-Tavşan IgG Kiti</td><td>Vektör Labs</td><td>MP-7401</td><td></td></tr><tr><td>Bağırsak dokusu tozu</td><td>*</td><td>*</td><td>5 yetişkin farenin ince bağırsakları birleştirildi ve minimum buz gibi soğuk PBS hacminde homojenize edildi. Homojenize edilmiş bağırsağa 4 hacim buz gibi aseton ilave edildi, bu bağırsaklar iyice karıştırılarak 30 dakika buz üzerinde inkübe edildi. Bu santrifüjlendi ve pelet buz gibi soğuk aseton kullanılarak yıkandı. Bu daha fazla santrifüjlendi ve elde edilen pelet filtre kağıdına yayıldı ve kurumaya bırakıldı. İyice kuruduktan sonra, malzeme bir havan tokmağı ve havan topu kullanılarak ince bir toz haline getirildi.</td></tr><tr><td>K-ferrisiyanür</td><td>Sigma</td><td>P-3667</td><td></td></tr><tr><td>K-ferrosiyanür</td><td>Sigma</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>Levamizol</td><td>Sigma</td><td>L0380000</td><td></td></tr><tr><td>Metakarn</td><td>*</td><td>*%</td><td>60 Metanol:%30 Kloroform:%10 Asetik asit</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4000/17</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Normal keçi serumu</td><td>Vector Labs</td><td>S-1012</td><td>NGS</td></tr><tr><td>Normal tavşan serumu</td><td>Dako</td><td>X0902</td><td>NRS</td></tr><tr><td>NTMT</td><td>*</td><td>*</td><td>100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, %0.1 Tween20, 2 mM Levamisol</td></tr><tr><td>PAP kalemi</td><td>Vector</td><td>H-400</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBT</td><td>*</td><td>*</td><td>0.5 M NaCl, 10 mM TrisHCL pH7.5, %0.1 Tween 20</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100x çözünürlük.</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su (10x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td> 1x PLL slaytları <td>yapmak için damıtılmış su ile 1:10 dilluted</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>P0425-72EA</td><td>Poli-L-lizin mikroskobu slaytları</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz k çözeltisi</td><td>*</td><td>*</td><td>Proteinaz K'yi 200 & mikroda seyreltin; 50 mM Tris, 5 mM EDTA'da g/ml.</td></tr><tr><td>Ralwax</td><td>BDH</td><td>36154 7N</td><td></td></tr><tr><td>Düşürücü Solüsyon</td><td></td>*<td>*</td><td>100 ml yapmak için: 1 gr Hidrokinon, 5 gr sodyum sülfit ve 100 ml damıtılmış su</td></tr><tr><td>RnaseA</td><td>Sigma</td><td>R6148</td><td></td></tr><tr><td>Salin</td><td>*</td><td>*</td><td>Damıtılmış suda %0,9 NaCl</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>I3771</td><td></td></tr><tr><td>Koyun serumu</td><td>Sigma</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>Gümüş nitrat</td><td>Sigma</td><td>S/1240/46</td><td></td></tr><tr><td>Gümüş çözelti</td><td>*</td><td>*</td><td>100 ml yapmak için: 10 ml Asetat tamponu, 87 ml distile su, 3 ml %1 gümüş nitrat</td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/2120/53</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Sigma</td><td>S6753</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Sodyum sülfit</td><td>Sigma</td><td>239321</td><td></td></tr><tr><td>SSC</td><td>Sigma</td><td>93017</td><td>20x salin sodyum sitrat</td></tr><tr><td>Cerrahi bant</td><td>Fisher Scientific</td><td>12960495</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td>TAM, bileşik çözeltiden düşeceği için çözeltinin çok fazla soğumasına izin vermeden enjekte edin. Çözüm yeniden kullanılabilir &ndash; -20 & °C'de saklayın; C kullanımlar arasında, iki defadan fazla ısıtmayın.</td></tr><tr><td>TBS/T</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td> <td># 9997</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolamin hidroklorür</td><td>Sigma</td><td>T1502</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>TP9416</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1500</td> <td>ile VectaShield Sert Montaj Ortamı</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC Kiti</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>PK-4001</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Promega</td><td>V3941</td><td></td></tr><tr><td>X-gal sabitleyici</td><td>*</td><td>*</td><td>%2 formaldehit, 1x PBS X-gal boyasında %0,1 glutaraldehit</td></tr><tr><td></td><td>*</td><td>*</td><td>X-gal boyası; 200 &# 956; l 50 ml çözelti B içinde X-gal (A) (500 ml PBS'de 0.214 g MgCl2, 0.48 g K-ferrisiyanür, 0.734 g K-ferrosiyanür).&nbsp; Çözelti B önceden hazırlanabilir ve 4 ° C'de saklanabilir; C</td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>X/0200/21</td><td></td></tr></tbody></table>

Şartlı kullanarak fare İnce bağırsağında yenileyici içinde paneth hücrelerinin rolü analiz için protokoller<em&gt; cre-lox</em&gt; fare modelleri

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

7 gün - memeli bağırsak epitel yüzeyi her 3 yenileyen dinamik bir dokudur. Hızla Lgr5 geninin kendi ifadesi ile karakterize bağırsak kök hücreleri (ISCs) bisiklet nüfusu bu yenilenme sürecini belirlenen anlama. Bunlar yaralanma durumunda bunların yerine yeteneğine Bmi-1 ifadesi ile işaretlenmiş bir sakin kök hücre popülasyonu, tarafından desteklenmektedir. Bu nüfus arasındaki etkileşimi araştıran hastalığı ve kanser rollerini anlamak için çok önemlidir. ISCs bağırsak yüzeyindeki crypts içinde var, bu nişler epitel Yenileyici de ISC destekliyoruz. Bir önceki Lgr5 ISC&#39;nin &#39;stemness&#39; yakından komşu Paneth hücreleri varlığına bağlı olduğunu göstermiştir edildiği gibi, aktif ve pasif ISCs arasındaki etkileşim olasılığı, kovan içinde diğer farklılaşmış hücreleri içerir. Koşullu CRE-lox Fareyi kullanarakmodeller Paneth hücreleri varlığında veya yokluğunda aktif ISCs çoğunluğu silme etkisi test edilmiştir. Burada bağırsak karakterize ve taahhüt teknikler ve analiz Paneth hücrelerinin önemli hakaret aşağıdaki kurtarma yardım ISC niş içinde çok önemli bir rol oynadığını göstermektedir açıklar.

Bağırsak epitel kök hücreler (ISCs) Paneth hücreleri ile iç içe. Bu hücreler ISCs destekleyen ve antibakteriyel koruma sağlamak ISC, soyunu ayırt edilirler. İşte biz Paneth hücrelerinin bağırsak epithelia sürdürmek çok önemli bir rol oynadığını kurmak için transgenik fare koşullu modellerini nasıl kullandıklarını göstermektedir.

Şartlı kullanarak Fare İnce Bağırsağında Yenileyici içinde Paneth Hücrelerinin Rolü analiz için protokoller<em&gt; Cre-lox</em&gt; Fare Modelleri

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Bu diseksiyon prosedürünün genel amacı, fare bağırsağının sonraki karakterizasyon teknikleri için nasıl izole edileceğini ve hazırlanacağını göstermektir. Bu yöntem, deneysel bir işlem sonrası intestinal kök hücrelerin bağırsağı yeniden populate etme yeteneğini araştırmak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, herhangi bir teknik veya prosedürden ya da gen manipülasyonundan sonra kullanılabilmesidir. Cray lock teknolojisi kullanarak, ötanazi uygulanmış yetişkin bir fareyi sırtüstü pozisyona getirerek ve kürkünü %70 ethanol ile ıslatarak başlayın.Ardından makas kullanarak intraperitoneal boşluğu orta hat boyunca boylamasına açın ve mideyi forsepsle sabitleyin. Sonra, özofagusla olan bağlantıyı kesin ve ince bağırsağı apandikse kadar çıkarmak için mideyi nazikçe çekin. Daha sonra, kalın bağırsağı anüse kadar çıkarmak için apandiksi nazikçe çekin.Bağırsaklar izole edildikten sonra, apandisteki mideyi çıkarın ve kör uçlu bir pipet ucu takılmış bir şırınga kullanarak bağırsakları PBS ile yıkayın; yıkamanın hemen ardından bağırsağı proksimal, orta ve distal olmak üzere üç eşit büyüklükte bölüme ayırın. Daha sonra her bölümü bir santimetrelik parçalar halinde kesin ve dokunun üç ila beş fragmanını, ikiye iki santimetrelik bir cerrahi bant parçasının ortasına yerleştirin. Tüm dokular yapıştırıldığında, bandı parçaların etrafından boylamasına mühürleyerek bir piramit formasyonuyla odun yığını oluşturun.Ardından bandı, doku hacminin en az 10 katı hacminde nötr, tamponlu formal fiksatif içeren düz tabanlı bir kaba yerleştirin ve örnekleri gömme ve kesit alma işlemlerinden önce dört derece Celsius'da saklayın. Fiksasyondan sonra, yıkama işleminin hemen ardından dokuyu Metcon'da sabitlemek için doku hacminin en az 10 katı hacminde %70 etanol içeren düz tabanlı bir kaba aktarın. Bağırsak, az önce gösterildiği gibi üç eşit büyüklükte bölüme ayırın.Ardından, her bir bölümü 15 x 15 santimetrelik bir filtre kağıdı üzerine yan yana yerleştirin ve tüm bölümler ayrıldığında, bölümleri FOSS üzerinde açmak için yaylı kavisli makaslar kullanın. Filtre kağıdını, taze hazırlanmış Metcon içeren bir cam kaba aktararak oda sıcaklığında 3 ila 24 saat bekletin; fiksasyonun sonunda, pensle bağırsak parçalarının uçlarını tek tek tutun ve dokuları pens etrafında sararak tekil "İsviçre ruloları" oluşturun. Pensleri hafifçe açıp doku üzerinden 25 gauge bir iğne geçirerek her bir ruloyu sabitleyin.Ardından, rulo haline getirilmiş dokuları, işlem öncesinde doku hacminin en az 10 katı kadar nötr tamponlu formül ve fiksatif içeren düz tabanlı bir kaba yerleştirin ve doku patlamasının whole mount laks görselleştirmesi için işlemeden önce en az bir saat boyunca bekletin. Mineral yağı ile karıştırılmış erimiş ham mumu 15 santimetrelik Petri kaplarına dökün. Ardından, bağırsakları buz gibi soğuk PBS ile durulamanın hemen ardından dokuları 25 mililitre buz gibi soğuk ex cal fiksatif ile durulayın.Fiksasyondan sonra, bağırsakları üç ila beş eşit bölüme ayırın ve her bir bölümü soğutulmuş balmumu plakalarından birinin üzerine yerleştirin. Bölümlerin hafifçe gergin olması için her iki ucunu iğneleyin ve mezenterik hatların plakaların üst kısmında kalmasını sağlayın. Fazla mezenter kısımlarını kesin.Ardından, yaylı kavisli makas kullanarak bağırsakları boylamasına kesin ve tüm bölümler iğnelendikten sonra açıldıkça sabitleyin. En az bir saat boyunca dört derece Celsius'ta beklettikten sonra, plakaları tüm dokuları kaplayacak kadar xal fiksatif ile doldurun. Fiksatifi uzaklaştırmak için 25 mililitre pipet veya şırınga kullanın ve dokuları bir kez 30 mililitre PBS ile yıkayın.Ardından, kesitlerin üzerine 30 mililitre DTTD birleştirici çözeltisi ekleyip oda sıcaklığında, sallayarak 30 ila 60 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, çözeltiyi 25 mililitrelik bir pipet veya şırınga ile uzaklaştırın ve dokuları başka bir 30 mililitre PBS ile yıkayın. Daha sonra, yıkama işleminden sonra mukusu PBS ile uzaklaştırmak için bir posterior pipet kullanın.Ertesi sabah oda sıcaklığında, karanlıkta ve bir sallama platformu üzerinde hafif ajitasyonla gece boyu boyama yapmak için PBS'yi 30 mililitre xal ile değiştirin. Kesitlerde mavi yeşil bir boyanma gelişmişse, xal'i 30 mililitre PBS ile değiştirin. Üç dakikalık hafif ajitasyonun ardından, az önce gösterildiği gibi Swiss roll'lar yapın ve dokuları, gömme ve kesme işleminden önce en az 24 saat boyunca dört derece Celsius'ta, doku hacminin en az 10 katı kadar uygun fiksatör içeren geniş ağızlı ve düz tabanlı bir kaba yerleştirin.ROSA 26 R Laxy kondisyonel raporcu kullanılarak, rekombine olmuş dokulardan ekstrakte edilen DNA kullanılarak ince bağırsakta indüksiyondan üç gün sonra %100 rekombinasyon gözlemlenebilir. Rekombine aleller için yapılan QPCR, VI kreaz sisteminde rekombinasyonda anlamlı olmayan bir artış olduğunu göstermiştir; bu durum potansiyel olarak Paneth hücrelerindeki rekombinasyonun gözlemlenmemesinden kaynaklanmış olabilir. Laxy raporcusu kullanılarak yapılan ah kreaz sistemi ile her iki sistem, indüksiyondan üç gün sonra rekombine hücrelerin tamamen kaybettiğini göstermiştir.Mitoz ve K kript hücresi yüksekliği verileri, ah H Cree sisteminin muhtemelen birleşmemiş bağırsak kök hücrelerinin yeniden popülasyonu sayesinde kendini toparlayabildiğini göstermiştir. Buna tam zıt olarak, villain Cree, epitel kript hücrelerini korumasına rağmen kendini toparlamada başarısız olmuştur. Ayrıca, vi Cree Cantin B uygulanan farelerdeki kript hücrelerinin proliferatif olmadığı ve bağırsak kök hücresi markörü ekspresyonunun eksik olduğu görülmüştür.EM dört. Ah Cre farelerindeki kriptlerin aksine, PTH hücreleri yalnızca VI Cree sisteminde Caden b delesyonundan sonra apoptoza uğramıştır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik yaklaşık 10 dakika içinde tamamlanabilir.Doku bozulmasını önlemek için gecikmelerin en aza indirilmesi önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, ileri analizler için bir fareden bağırsağın nasıl çıkarılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

protocols-for-analyzing-role-paneth-cells-regenerating-murine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu videoda, fare proksimal kolon halkası veya pcLoop segmenti oluşturmak için cerrahi bir prosedürü ve ardından bağırsak epitel geçirgenliğini incelemek için segmente intraluminal floresan belirteçleri enjeksiyonunu açıklıyoruz.

Fare Proksimal Kolon Döngü Modelinin Oluşturulması: İntraluminal Enjeksiyonu Takiben Serumda Floresan İşaretleyicilerin Saptanmasıyla Proksimal Kolon Halkası Oluşturmak ve Bağırsak Geçirgenliğini Ölçmek İçin Cerrahi Bir Prosedür

Doğru kimlik ve bağırsak mukoza zarının üzerinde epitel hücreleri konumu farklı hücre soyları tanımlamak için gereklidir. bağırsak dokuların uygun görüntüleme maksimum çözünürlük ile protein ekspresyonu belirlenmesi için çok önemlidir. Bu çalışma işleme fare bağırsak dokuları için en uygun yöntem ve koşulları belirginleştiren amaçlamaktadır.

Immünohistokimyasal ve immünofloresan Analizleri için Bağırsak Doku Hazırlama için geliştirilmiş Swiss-haddeleme Tekniği

Saydam C. elegans bağırsak "sırasında çok hücreli tubulogenesis apicobasal membran ve Lümen Biyogenez tek hücre ve hücre altı düzeyde çalışmak için birvivo içinde doku odası" olarak hizmet edebilir. Bu protokolü nasıl standart etiketleme birleştirmek için işlev kaybı genetik/RNAi ve moleküler düzeyde bu işlemleri incelemek için mikroskobik yaklaşımları açıklar.

C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme

Bağırsak organoid kültürler tüm kriptalarının kurulur ve kendini yenileme ve farklılaşma analizi bir hücre özgü biçimde izin vermez. Bu iletişim kuralı sulandırma sıralanmış kök (Lgr5+) açıklar ve neden olmaktadır organoids için onların önceki biyokimyasal ve genetik modifikasyon ve fonksiyonel analiz etkinleştirilirken (Paneth) hücreleri niş.

Fonksiyonel analiz bağırsak kök ve niş hücre Organoid sulandırma tahlil (ORA)

İntravital mikroskopiden yararlanan burada sunulan yöntem, canlı hayvanlarda bağırsak epitel hücresi dökülmesinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesidir. Bu nedenle anestezili farelerin topikal lekeli bağırsak mukozası (acriflavine ve rhodamineB-dextran) konfokal mikroskopi kullanılarak tek hücreçözünürlüğe kadar görüntülenir.

İntravital Mikroskopi Tabanlı Bir Yaklaşım Bağırsak Geçirgenliği ve Epitel Hücre Dökülme Performansını Değerlendirmek için

Düzensiz bağırsak epitel bariyer fonksiyonu ve immün yanıtlar, fizyolojik modellerin eksikliği nedeniyle kötü araştırılmaya devam eden enflamatuar bağırsak hastalığının ayırt edici özellikleridir. Burada, mukozal geçirgenliği ve lökosit işe alımını vivo olarak incelemek için iyi vaskülerleştirilmiş ve dışlanmış bir bağırsak segmenti kullanan bir fare bağırsak döngüsü modelini tarif ediyoruz.

Standartlaştırılmış Bağırsak Döngüsü Modeli Kullanılarak Farelerde Bağırsak Geçirgenliği ve Nötrofil Transepithelial Göçün Fonksiyonel Değerlendirmesi

Bu protokolde, murine primer epitel kolon monolayerlerinin doğrudan bağırsak mahzenlerinden nasıl üretılacağını açıklıyoruz. Geçirgen filtreler üzerinde birleştirici monolayerler, çizik yarası iyileşmesi ve biyokimyasal çalışmalar için birikme monolayerleri ve immünofluoresans analizi için seyrek ve birleştirici monolayerler üretmek için deneysel yaklaşımlar sunuyoruz.

Bağırsak Mezarlarından Murine Primer Kolon Epitel Monolayerlerinin Üretimi

Bu protokol, murin ince bağırsak organoidlerinin oluşturulması, tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücrelerin murin ince bağırsak lamina propriasından izole edilmesi ve bağırsak epitel hücreleri ile tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücreler arasındaki çift yönlü etkileşimleri incelemek için her iki hücre tipi arasında 3 boyutlu (3D) ortak kültürlerin oluşturulması için ayrıntılı talimatlar sunmaktadır.

Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

Gastrointestinal sistem, radyoterapötik kanser tedavileri üzerine yaralanmaya karşı en hassas organlardan biridir. Aynı zamanda, bu tür hakaretleri takiben en yüksek rejeneratif kapasitelerden birine sahip bir organ sistemidir. Sunulan protokol, bağırsak epitelinin rejeneratif kapasitesini incelemek için etkili bir yöntem tanımlamaktadır.

İyonlaştırıcı Işınlamaya Yanıt Olarak Bağırsak Epitelyal Rejenerasyonu

Burada, lazerle indüklenen yaralama üzerine bağırsak görüntülerini elde etmek için bir yöntem sunuyoruz. Fare bağırsağını bir multifoton lazere maruz bırakarak, tek veya birden fazla kript (ler) in kaybı yerel olarak indüklenir. Hasarlı bölgeyi aylar boyunca tekrar tekrar görüntüleyerek, bağırsak iyileşmesinin gerçek zamanlı dinamikleri yakalanır.

Bağırsak Yeniden Şekillenmesini İncelemek için Lazer Ablasyon ve İntravital Mikroskopi

3 boyutlu kolonoidlerin gelişimi için murin kolonik kriptlerinin izolasyonunu detaylandıran bir protokol açıklıyoruz. Yerleşik kolonoidler daha sonra, enflamatuar bir meydan okuma almadan veya bir epitelyal tek tabaka oluşturmaya yönlendirilmeden önce konakçı epitelinin hücresel bileşimini yansıtacak şekilde terminal olarak farklılaştırılabilir.

İntestinal İnflamasyonun Yerleşik Murin Kolonoidleri Üzerindeki İn Vitro Epitelyal Etkilerinin İncelenmesi

Keşfedin fare ince bağırsağı izolasyonu ve Cre-lox teknolojisi kullanarak Paneth hücrelerinin intestinal epitel kök hücrelerini yenilemedeki rolünü. Bu yöntem gastrointestinal sağlık araştırmaları için temel oluşturur.

Şartlı kullanarak Fare İnce Bağırsağında Yenileyici içinde Paneth Hücrelerinin Rolü analiz için protokoller Cre-lox Fare Modelleri (Video) | JoVE Journal

Şartlı kullanarak Fare İnce Bağırsağında Yenileyici içinde Paneth Hücrelerinin Rolü analiz için protokoller

Daha fazla video keşfet