Name: Deniz Memelileri Miyoglobin Tespiti için bir Kolloidal Altın merkezli İmmunokromatografik Testi Strip Gelişimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Keşfedin, deniz memelileri miyoglobini için kolloidal altın immünokromatografik test şeridi geliştirme yöntemini. Bu teknik, yasadışı ticareti önlemek amacıyla saha taramasında beş ila on dakikada hızlı sonuç verir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tayvan Deniz Memelileri Derneği, Ulusal Cheng Kung Üniversitesi Deniz Biyolojisi ve Deniz Memelileri Araştırma Merkezi, Farglory Okyanus Parkı ve Ulusal Chiayi Üniversitesi Hayvan Hastalıkları Teşhis Merkezi'ndeki meslektaşlarımıza örnek toplama için teşekkür ederiz. Bu proje, Tayvan Tarım Konseyi'nden (100AS-02.1-FB99) WCY'ye hibe ile finanse edilmiştir.

Etik Beyanı: Çalışma Ulusal Chiayi Üniversitesi, onay numarası Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından uluslararası kurallarına uygun olarak yapılan ve kabul edildi: cetacean örnek kullanımı Tayvan Tarım Konseyi (Araştırma İzni tarafından izin verildi 99022. 100M-02.1-Cı-99). 1. Kas Numune Hazırlama ve SDS-PAGE Not: Deniz memelilerinin 16 türün, karasal memeli 5 türler de dahil olmak üzere 23 türe kas örnekleri, ton balığı ve tavuk Bu çalışmada (Tablo 1) kullanılmıştır. cetacean kas örnekleri mahsur kişiler, balıkçılık hedef dışı av ve müsadere elde edilmiştir. Tavşan, fare, köpek ve tavuk kas dokuları Ulusal Chiayi Üniversitesi Hayvan Hastalıkları Teşhis Merkezi&#39;nden elde edilmiştir. sığır, domuz, kuzu ve orkinos örnekleri yerel bir süpermarketten satın alındı. Liman foku (Phoca vitulina kas örneği </em&gt;) Farglory Ocean Park tarafından sağlandı. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamit jel elektroforezi (SDS-PAGE), kas örnekleri, farklı moleküler ağırlıklara sahip çözünebilir proteinlerin ayrılması için kullanılmıştır. <ol><li> kullanılana kadar -20 ° C&#39;de tüm örnekler saklayın. </li><li> -20 ° C&#39;de ön-serin harcı. Sonra içine donmuş kas örnek 3 g koydu. </li><li> Bir doku homojenleştirici kullanarak soğuk fosfat tamponlu salin içinde 10 ml (PBS) ile örnek homojenize edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de homojenize santrifüjleyin. süpernatantlar toplamak ve kullanılana kadar -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> (5 mi,% istifleme jeli (3.07 ml damıtılmış suya, pH 6.8,% 40 akrilamid 625 ul,% 10 amonyum persülfat (APS), 50 | il ve tetrametiletilendiamin 5 ul 4x üst jel tamponu 1.25 ml 5 hazırlanması TEMED)) ve 10 ml% 15 ayırma jeli (damıtılmış su 3.65 mi, 4 kere pH 8.8 alt jel tamponu, 2.5 ml% 40 akrilamid 3.75 mi,% 10, 100 ul APSve TEMED 4 ul). <ol><li> Elektroforez hücresinde, ikinci katılaşmasından sonra ayırma jeli (% 15 akrilamid) üzerine jel (% 5 akrilamid) istifleme dökün. istifleme jel jel tarak yerleştirin. </li></ol></li><li> Aşağıdaki koşullara göre PAGE gerçekleştirin: İlk çalışma koşulu: 100 volt, 20 dakika ve son durum: 120 volt, 40 dk. </li><li> Jel renk eşit mavi olana kadar 30 dakika oda sıcaklığında Coomassie parlak mavisi ile jel leke. Not: Jel artık boya çözeltisi görünür olduğunda Boyama tamamlanır. </li><li> 1 saat süre ile, oda sıcaklığında asetik asit çözeltisi (% 10) ile destain. Bantları görünmeye başlayacaktır. Arka plan temizlenene kadar bir gecede 4 ° C&#39;de lekenin devam edin. </li></ol> 2. Peptid Sentezi ve Tek klonlu Antikor Üretimi <ol><li> ton balığı, tavuk, devekuşu, evcil hayvanlar, mühür ve 18 tür dahil olmak üzere, GenBank&#39;tan Mb amino asit sekanslarını almakdeniz memelileri (Tablo 2). </li><li> Uygun yazılım 16 kullanarak dizileri hizalayın: <ol><li> Hizala seçerek Hizalama Explorer&#39;ı başlatın: başlatmak çubuğunda Hizalama kurmak / Edit; Yeni Hizalama Oluştur&#39;u seçin ve Tamam&#39;a tıklayın. Bir iletişim soran görünecektir &quot;Bir DNA veya protein dizi hizalama oluşturuyor musunuz?&quot; </li><li> &quot;Protein&quot; etiketli düğmesini tıklayın; Açık: Verileri seçmek Dosya seçin ve dizi dosyasından dizileri Al; Düzenle&#39;yi seçin: Bir çoklu dizi hizalaması oluşturmak için veri seti her dizisi için tüm siteleri seçmek için Tüm menü komutunu seçin. </li><li> Seç Hizalama: ClustalW algoritması kullanılarak seçilen dizileri veri hizalamak için ana menüden ClustalW tarafından hizalayın; Tamam düğmesini tıklatın Protein Kilo Matrix olarak &quot;BLOSUM&quot; i seçin. </li></ol></li><li> dizi hizalama analiz: <ol><li> 5 antijenik reaktif si odaklanıntes 17: Alanı 1 (AKVEADVA, 15-22), Alanı 2 (KASEDLK, 56-62), Alanı 3 (ATKHKI, 94-99), Alanı 4 (HVLHSRH, 113-119) ve site 5 (KYKELGY, 145- 151) ve deniz memelileri arasında muhafaza fragmanı bulmak. Bir * (yıldız; hizada konsensüs sembolü (Protokol 2.2.3)) tek, tamamen korunmuş kalıntısı pozisyonları gösterir. deniz memelileri aşağıdaki korunmuş parçaları bulundu: (siteyi 2 dahil) dizisi KASEDLKKHG ve dizi HVLHSRHP (hangi siteyi 4 içerir). </li></ol></li><li> ticari hizmetlerini kullanarak taşıyıcı protein olarak ovalbümin proteininin (OVA) ile sekans analizi ve konjugat göre aday dizisi fragmanları sentezlemek. <ol><li> Ayrışma peptidin önlemek için antijenik reaktif site N-terminali hidrofobik amino asitler (örneğin, metionin) ilave (örneğin, E-KASEDLKKHG). </li><li> immünosit çekirdek bir antijenik yeri sergilemek için antijenik reaktif sitenin C-terminal uzatır. Bundan başka, konjugatKapı Cı-terminal sistein (Cys; C) eklenerek OVA peptid (örneğin, E-KASEDLKKHG-NTVL-C). </li></ol></li><li> imünojen 1 ya da PBS içinde, her sentetik peptit, eşit hacimde (3 mL, nihai konsantrasyon 30-50 g / 100 ul) ile imünojen 2 tam olmayan Freund katkı maddesi için tam Freund katkı maddesi emülsiyon. </li><li> deri altından 5 dişi BALB / c farelerinin her birine imünojen 1 (0.1 mg), inoküle. </li><li> İki haftalık aralıklarla subkutan güçlendirici enjeksiyonları immünojen 2 kullanılarak beş kez gerçekleştirin ve her güçlendirici önce farelerden alınan kuyruk klip örnekleme test serumları toplamak. </li><li> İlk tarama için, sera titresi belirlenir. <ol><li> 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna, reaksiyon tamponu ve kısım çözeltisi 50 ul 25 ml serbest peptidin 100 ug çözündürülür. Her kuyuya 10 ul birleştirme reajanı solüsyonu eklenir ve plaka karıştırın. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübasyona bırakılır. </li><li> , Kuyunun içeriğini kaldırdamıtılmış su ile her bir oyuğa 3 kez yıkama ve bloke etme çözeltisi 200 ul ilave edilerek plaka engeller. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. içeriğini çıkarmak ve damıtılmış su ile her bir oyuğa 3 kez yıkayın. </li><li> İlk tarama için sera titresinin belirlenmesi için dolaylı ELISA (Protokol 5,1-5,7) gerçekleştirin. dalak koleksiyonu için en yüksek titre (en yüksek optik yoğunluk) ile fare seçin. </li></ol></li><li> Üç gün önce dalak koleksiyonuna, deri altı yüksek titreye sunan fare içine immünojen 1 0.1 mg aşılamak. </li><li> MAb nesil 18 için hibridoma hücreleri elde etmek için fare miyelom hücreleri F0 (sp2 / 0-Ag14) ile seçilmiş aşılanmış farelerde ve sigorta dalak hücreleri toplamak. </li><li> 14 gün füzyon sonra, dolaylı ELISA kullanılarak içermeyen sentetik peptid doğru hibridom üst fazları (Protokol 5,1-5,7) reaktivitesini tarama ile pozitif klonlar seçin. </li><li> maximiz için oyuk başına uygun sayıda hücreleri sulandırmaksadece tek bir klon (seyreltme klonlama) içeren havuzlara oranını ing. <ol><li> Boş kalan de A1 hariç 96 oyuklu plaka içerisinde tüm oyuklara hücre kültür ortamının 100 ul ekle. </li><li> de A1 hücre süspansiyonu 200 ul ekle. Sonra hızlı bir şekilde B1 A1 100 ul transferi ve hafifçe pipetleme karıştırın. Tüm sütun boyunca 2 dilüsyonları, ve bunun üstünde kuyuları ile aynı hacmi ile biter böylece daha sonra H1 100 ul atmak: Bu 1 tekrarlayın. </li><li> 8 kanallı mikropipet ile sütun 1, orta ve ek bir 100 ul ekle. Daha sonra hızlı bir şekilde, aynı pipet kullanarak sütun 2&#39;de kişilerce sütun 1 kuyuların herbirinden 100 ul transfer ve yavaşça pipetleme karıştırın. </li><li> tüm plaka üzerinde 2 dilüsyonları: Aynı ipuçlarını kullanarak, bu 1 tekrarlayın. son sütunda kuyuların her birinden 100 ul atın. </li><li> Her bir oyuğa 100 ul ortamı eklenerek 200 ul tüm oyuklara nihai hacim getirin. pla inkübeTe nemlendirilmiş CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C ısıda. </li><li> Her çukurun kontrol edin ve sadece tek bir koloni içeren tüm kuyuları işaretlemek. Tek klonlar içeren kuyuların&gt;% 90 antikor üretimi için pozitif olana kadar iki veya daha fazla klonlama yürütmek. </li></ol></li><li> Western blot ve Dot blot (protokol 3,1-4,6) ile klonları taramak. Sonra daha büyük kaplara kuyulardan alt kültür koloniler mAb elde etmek için hücreleri genişletmek için. Genellikle, her klon 12 veya 24 oyuklu bir plaka içerisinde, tek bir kuyunun içine aktarılır. </li><li> mAbs ve inek, keçi, domuz, köpek, tavşan, ton balığı, tavuk, mühür kas özleri ve western blot ve dot blot (protokol 3,1-4,6) dört temsilci cetacean türler arasındaki yakınlık ölçün. </li><li> Assitler ikna etmek için farelerin periton içine (en fazla 3 x 10 6) seçilen hibridoma hücreleri aşılamak. Karın şişliği 7-10 gün hibridoma enjeksiyon sonrası içinde genellikle açıktır. bir hipodermik bir iğne kullanılarak sıvının toplama(Az 20 ölçü). </li><li> Santrifüj asit sıvısı (10 dakika 10.000 xg) hücreleri ve enkaz kaldırmak için. 0.45 um&#39;lik bir filtre ile filtrelenir. Protein G Sefaroz kolonuna örnek 1 ila 20 ml bağlama tamponu 15 mi, ve elüsyon tamponu 3 ila 5 ml ilave edilir. farenin asit sıvısı arıtılmış antikor içeren ayırma fraksiyonu toplamak. </li><li> Üreticinin talimatlarını kullanarak Antikor İzotipleme Kiti ile antikor izotipini belirlemek. </li></ol> 3. Western Blot <ol><li> BME 50 ul 2x Laemmli numune tamponu 950 ul karıştırılarak β-merkaptoetanol (BME) ihtiva eden 2 x yükleme tamponu hazırlayın. Poliklonal tavşan anti-insan Mb antikoru kullanıldığında 5 (evcil hayvanlar ve ton balığı) ve: 01:50 (, deniz memelileri ve mühür) ve 1: iyi sinyaller elde etmek için uygun oranda yükleme tamponu kas üst fazlar (protokol 1.1-1.4) seyreltin 1: 1 (domuz, tavşan, tavuk ve ton balığı), 1: 5 (inek, keçi ve köpek) ve 01:25 (deniz memelileri ve mühür) zamanntibody Hibridom yüzey arasındadır. </li><li> 5 dakika boyunca 95 ° C&#39;de ısı örneği. moleküler ağırlık belirteçleri ile birlikte SDS-PAGE jel (% 4 akrilamit yığınlama ve% 12 akrilamid ayırma) oyuklarına Numuneleri. V sonra yaklaşık 1 saat içinde koşmak bitirmek için 150 V gerilimi artırmak 50 ° C&#39;de 5 dakika boyunca jel çalıştırın. </li><li> 15 dakika boyunca 1 x transfer tampon maddesi içinde jel yerleştirin. nitroselüloza ayrılan protein aktarın (NC) membranlar da PAGE ile ayrıldıktan sonra. Aktarım 60-90 dakika boyunca 100 V&#39;ta yapılabilir. </li><li> engelleme çözeltisi hazırlayın: 1X PBS,% 5 yağsız kuru süt ile% 0.1 Tween 20 ihtiva etmektedir. 1 saat boyunca oda sıcaklığında bloke etme çözeltisi 25 ml Carolina membran engeller. Tween 20 (PBST), 15 ml fosfat tamponlu tuzlu su ile her biri 5 dakika için üç kez yıkayın. </li><li> Antikor Seyreltme tampon maddesi gece boyunca 4 ° C &#39;de% 5 engelleme çözeltisi ile seyreltildi, 10 ml membran ve primer antikor (assit sıvısı veya hibridom üst faz) inkübe edin. </li><li> zarı yıkayınYine PBST ile e üç kez aşırı antikor temizlemek için. </li><li> 1 ile alkalin fosfataz konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG&#39;si ile membran inkübe: 1,250, oda sıcaklığında 1 saat süre ile hafif bir çalkalama ile engelleyici çözelti içinde. </li><li> Yine zarın yıkanması ve 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat / p-nitro mavi tetrazolyum klorit içinde inkübe (BCIP / NBT) fosfataz alt-tabaka karışımı 10 ila 20 dakika süreyle renk gelişimi kadar. </li><li> damıtılmış su çeşitli değişiklikler membranın yıkama ederek reaksiyonu durdurun. </li></ol> 4. nokta leke <ol><li> iyi sinyaller elde etmek için uygun bir oran ile PBST içinde% 5 sığır serum albumin (BSA), kas üst fazlar (protokol 1.1-1.4) seyreltilir: 1: evcil hayvanlar ve ton 5 ve 1:25 deniz memelileri ve conta için. Noktası zarı üzerine numune 5 ul. Çözelti yavaşça uygulayarak (genellikle 3-4 mm çapında) nüfuz bölgeyi en aza indirin. </li><li> Oda sıcaklığında (zar kurutun, örneğin &lt;30-60 dakika boyunca, bir laminar akış / em&gt;), oda sıcaklığında, 1 saat süre ile Petri kabındaki çözüm engelleme ile bloke eder ve PBST ile yıkayın. </li><li> primer antikor ile membran inkübe (mAb 1 ile hibridoma süpernatanından: 10,000 veya assit sıvısı ile 1: 5% engelleme çözeltisi içinde seyreltildi 100,000), oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca (% 5 Bloklama çözeltisi, 1.250 1 alkalin fosfataz konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG&#39;si) kullanımı PBST fazla antikor kaldırmak ve daha sonra sekonder antikor ile inkübe edilmesi her biri 5 dakika MEMBRAN üç kez yıkamak . </li><li> Yine membran yıkayın ve renk gelişimi kadar 10 ila 20 dakika içinde BCIP / NBT fosfataz substrat karışımı içinde kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> damıtılmış su çeşitli değişiklikler membranın yıkama ederek reaksiyonu durdurun. </li></ol> 5. Dolaylı ELISA <ol><li> Yıkama tamponu (% 0.02 Tween 20 ile 0,002 M imidazol tamponlu tuz) hazırlayın. plaka yıkama ile 3 kere yıkayınHer bir sonraki aşamada (protokol 5.2-5.5) arasında tampon. </li><li> kaplama tamponu kas süpernatanları (protokol 1.1-1.4) ve 01:25 seyreltme hazırlayın. Ceket 96-çukurlu bir ELISA gece boyunca 4 ° C&#39;de 100 ul seyreltilmiş supernatantlar plaka ve oda sıcaklığında 1 saat süre ile tampon (PBS içinde% 1 BSA) ile bloke ile bloke eder. </li><li> İnceltilmiş tampon ile saflaştırılmış mAb 2.000 seyreltme ve her bir seyreltilmiş, mAb 100 ul 1 hazırlayın. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona bırakılır. </li><li> daha inkübasyon için: (seyreltilmiş tampon maddesi içinde 200 seyreltme 1) keçi anti-fare IgG yaban turpu peroksidaz ile konjüge edilmiş ekleyin. </li><li> her bir (100 ul / çukur) peroksidaz substratı ilave edin ve 10-15 dakika inkübe edilir. </li><li> Renk gelişimi gözlemlenir peroksidaz durdurma çözeltisi (100 ul / oyuk) enzim reaksiyonu durdurun. </li><li> Bir mikrolevha spektrofotometre kullanılarak 450 nm&#39;de optik yoğunluk okuyun. </li></ol> Kolloidal Altın etiketli mAb 6. hazırlanması </p&gt; Not: koloidal altın çözüm ve karışımın rengi her zaman kırmızı olmalıdır. Siyah çökelti fark edildiğinde pH, mAb konsantrasyonu, santrifüj hızını ayarlayın. 6.1 Adımları ve 6.2 optimizasyon adımlardır. <ol><li> 5-9 arasında değişen pH değerleri ile, koloidal altın çözeltisi 100 ul mAb (50 ug / ml, 3 ul) tespit saflaştınlmış ekleyin. İki saat süre ile kırmızı rengi tutan en az optimum pH değeri pH olarak kabul edilir. Not: Bu çalışmada, 0.1 M potasyum karbonat kolloid altın (40 mil), pH 8.0 (optimum pH) çözüm ayarlamak için kullanıldı. </li><li> pH 8.0&#39;da koloidal altın çözeltisi 100 ul mAb tespit saflaştırılmıştır çeşitli bir miktar (500 mg / ml, 1-20 ul) eklenir. Not: Bu çalışmada, optimum konsantrasyonu 6 ng / ml (siyah tortu) &#39;dir. </li><li> Yukarıdaki sonuçlara göre, arıtılmış, mAb damla damla kolloid altın çözeltisi 10 ml saptama 60 ug ekleyin. 10 dakika süre ile, oda sıcaklığında, karışımın hafifçe emülsifiye. ilankarışıma PBS içinde% 5 BSA çözeltisi (pH 7.4), 2 ml ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında yavaşça emülsifiye D interferansı azaltır. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüjleyin karışımı. </li><li> dikkatli bir şekilde konjüge edilmemiş antikor ile süpernatantı ve% 1 BSA ve% 0.1 Tween 20 içeren PBST ile 4 ml elde pelet askıya ve santrifüj ve süspansiyon birkaç kez tekrarlayın. </li><li> 1 ml PBST son çökeltiler askıya alma ve kullanılana kadar 4 ° C sıcaklıkta saklayın. </li></ol> Bağışıklık Strip 7. İnşaat Not: Şekil 1, bağışıklık şerit tasarımı gösterir. Hazırlayın ve &lt;(1 yıl) uzun süreli depolama ömrü için (% 20 Bağıl Nem düşük nem laboratuarı çevre durumda şeritler)&gt; monte edin. pedleri ve zarın boyutları: Birleşmiş Yastığı, 300 mm x 10 mm, emici ped, 300 mm x 24 mm, Örnek Yastığı, 300 mm x 24 mm, NC membranı 300 mm x 25 mm, 300 çalışma alanınamm x 80 mm. <ol><li> Birleşmiş Yastığı, doyurulması ve sonra monte edilmeden önce 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de kurutmak için mikropipet ile adım 6.6 arasında kolloid altın etiketli mAB solüsyonu eklenir. </li><li> Bir pipet ya da İmmunoStrip yazıcı kullanılarak Kuzey Carolina zar üzerinde mAb saptanması için kontrol alanının spesifik antijen yakalama test bölgesi üzerinde mAb (500 ug / ml) ve tavşan anti-fare IgG (500 ug / ml) dağıtın. bir girişimi engellemek için iki bölge arasındaki mesafeyi (&gt; 5 mm) tutun. </li><li> çift ​​taraflı bant ile çalışma alanında konjuge pad, emici ped ve NC membran yapıştırın. Not: yaklaşık 2 mm NC zarın her iki tarafındaki pedleri üzerinden geçin. Uygunsuz şerit inşaat tamamlanmamış bir testte neden olur. </li><li> eşlenik pedi üzerinde numune pedi (2 mm) yerleştirin ve çalışma alanındaki yapıştırın. </li><li> Bir kağıt kesici ile 6 mm çapında şeritler oluşturun. kurutucu ile alüminyum folyo çanta içinde şeritler paketleyin ve kullanılana kadar 4 ° C sıcaklıkta saklayın. </li></ol> 8. Çapraz reaktivite Testi <ol><li> 1.5 ml santrifüj tüpüne 1 ml PBS içeren (% 0.1 BSA) bambu çubuk kullanarak ya da çubuğu taşlama ham kas numunesi 0.03 g homojenize edilir. </li><li> Test alanlara son tersi şeridi tutun ve 5-10 dakika süreyle numune içine numune pedi parçası daldırma ve doğrudan sonucu gözlemleyin. <ol><li> İsteğe bağlı: 500 ul süpernatant toplayın ve yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Not: şerit doğrudan süpernatant içine batırılmış zaman sinyal açık değilse, bu adım önerilir. </li></ol></li><li> üç nüsha olarak çeşitli kas örnekleri test edin. Not: Burada orkinos, tavuk, mühür, deniz memelileri 15 tür ve karasal memeli 5 tür test. </li><li> , Beş bağımsız müfettişler, yani beş kez 8.3 tekrarlayın sahip toplam 575 şeritler kullanın. </li></ol>

<ol><li>Robards, M. D., Reeves, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+extent+and+character+of+marine+mammal+consumption+by+humans%3A+1970-2009%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Conserv%22%5BJournal%5D)">The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009.</a> Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).</li>
<li>Booth, S., Zeller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mercury%2C+food+webs%2C+and+marine+mammals%3A+implications+of+diet+and+climate+change+for+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Mercury, food webs, and marine mammals: implications of diet and climate change for human health.</a> Environ. Health Perspect. 113, 521-526 (2005).</li>
<li>Endo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+mercury%2C+methyl+mercury%2C+and+selenium+levels+in+the+red+meat+of+small+cetaceans+sold+for+human+consumption+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Total mercury, methyl mercury, and selenium levels in the red meat of small cetaceans sold for human consumption in Japan.</a> Environ. Sci. Technol. 39, 5703-5708 (2005).</li>
<li>Tryland, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pathogens+in+marine+mammal+meat%5BTitle%5D)+AND+%22Norwegian+Scientific+Committee+for+Food+Safety+%28VKM%29%22%5BJournal%5D)">Human pathogens in marine mammal meat.</a> Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM). , (2011).</li>
<li>Matsunaga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick+and+simple+method+for+the+identification+of+meat+species+and+meat+products+by+PCR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Sci%22%5BJournal%5D)">A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay.</a> Meat Sci. 51, 143-148 (1999).</li>
<li>Dalebout, M. L., Helden, A. V., van Waerebeek, K., Baker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+identification+of+southern+hemisphere+beaked+whales+%28Cetacea%3A+Ziphiidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic identification of southern hemisphere beaked whales (Cetacea: Ziphiidae).</a> Mol. Ecol. 7, 687-694 (1998).</li>
<li>Dalmasso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+PCR+assay+for+the+identification+of+animal+species+in+feedstuffs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs.</a> Mol. Cell. Probes. 18, 81-87 (2004).</li>
<li>Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+assay+for+the+identification+of+animal+species+in+cooked+sausages%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Sci%22%5BJournal%5D)">PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages.</a> Meat Sci. 77, 649-653 (2007).</li>
<li>Liu, L., Chen, F. -C., Dorsey, J. L., Hsieh, Y. -H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+Monoclonal+Antibody-based+Sandwich+ELISA+for+the+Detection+of+Porcine+Skeletal+Muscle+in+Meat+and+Feed+Products%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Sci%22%5BJournal%5D)">Sensitive Monoclonal Antibody-based Sandwich ELISA for the Detection of Porcine Skeletal Muscle in Meat and Feed Products.</a> J. Food Sci. 71, 1-6 (2006).</li>
<li>Kotoura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sandwich+ELISA+for+the+Determination+of+Beef+Meat+Content+in+Processed+Foods%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Sci.+Techno.+Res%22%5BJournal%5D)">A Sandwich ELISA for the Determination of Beef Meat Content in Processed Foods.</a> Food Sci. Techno. Res. 15, 613-618 (2009).</li>
<li>Hsieh, Y. H., Chen, Y. T., Gajewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody-based+sandwich+ELISA+for+reliable+identification+of+imported+Pangasius+catfish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Sci%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody-based sandwich ELISA for reliable identification of imported Pangasius catfish.</a> J. Food Sci. 74, 602-607 (2009).</li>
<li>Ross, H. A., et al. DNA surveillance: web-based molecular identification of whales, dolphins, and porpoises. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoss%2C+HA+%22J.Hered%22">J.Hered</a>. 94, 111-114 (2003).</li>
<li>Ngom, B., Guo, Y., Wang, X., Bi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+lateral+flow+test+strip+technology+for+detection+of+infectious+agents+and+chemical+contaminants%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review.</a> Anal. Bioanal. Chem. 397, 1113-1135 (2010).</li>
<li>Muldoon, M. T., Onisk, D. V., Brown, M. C., Stave, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targets+and+methods+for+the+detection+of+processed+animal+proteins+in+animal+feedstuffs%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Targets and methods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs.</a> Int. J. Food Sci. Technol. 39, 851-861 (2004).</li>
<li>Rao, Q., Hsieh, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+commercial+lateral+flow+feed+test+for+rapid+detection+of+beef+and+sheep+content+in+raw+and+cooked+meats%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a commercial lateral flow feed test for rapid detection of beef and sheep content in raw and cooked meats.</a> Meat Sci. 76, 489-494 (2007).</li>
<li>Tamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA5%3A+molecular+evolutionary+genetics+analysis+using+maximum+likelihood%2C+evolutionary+distance%2C+and+maximum+parsimony+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods.</a> Mol. Biol. Evol. 28, 2731-2739 (2011).</li>
<li>Atassi, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+structure+of+myoglobin%3A+the+complete+immunochemical+anatomy+of+a+protein+and+conclusions+relating+to+antigenic+structures+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins.</a> Immunochemistry. 12, 423-438 (1975).</li>
<li>Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridoma+technology+for+the+generation+of+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hybridoma technology for the generation of monoclonal antibodies.</a> Methods Mol. Biol. 901, 117-135 (2012).</li>
<li>Kao, D. J., Hodges, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+a+synthetic+peptide+immunogen+over+a+protein+immunogen+in+the+development+of+an+anti-pilus+vaccine+for+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol.+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Advantages of a synthetic peptide immunogen over a protein immunogen in the development of an anti-pilus vaccine for Pseudomonas aeruginosa.</a> Chem. Biol. Drug Des. 74, 33-42 (2009).</li>
<li>Dolar, M. L., Suarez, P., Ponganis, P. J., Kooyman, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoglobin+in+pelagic+small+cetaceans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Myoglobin in pelagic small cetaceans.</a> J. Exp. Biol. 202, 227-236 (1999).</li>
<li>Lo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+immune+colloidal+gold+strip+for+cetacean+meat+restraining+illegal+trade+and+consumption%3A+implications+for+conservation+and+public+health%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Rapid immune colloidal gold strip for cetacean meat restraining illegal trade and consumption: implications for conservation and public health.</a> PLoS ONE. 8, e60704(2013).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

taşıyıcı proteine ​​konjüge edilmiş sentetik bir peptidin kullanımıyla kognat proteine ​​kıyasla önemli ölçüde daha etkilidir. mAb bilinen göreceli yerle epitopları kullanılarak geliştirilmiştir, çünkü sandviç temelli bir yöntem için, bu çalışmada iki mAb hedef antigen epitopu ile birbirlerinin etkileşime müdahale olası değildir. Ayrıca, doğal proteinin, sentetik peptit bağı ile bağışıklaştırılan farelerin antikor arasında tepkime nativ protein ve doğal proteinin 19 üretilen antikorun arasındaki reaktivite da...

Tarihsel olarak deniz memelisi eti dünyanın birçok yerinde tüketilmiştir ve bu tüketim günümüzde de devam etmektedir1. Deniz memelilerinin trofik seviyesi nedeniyle, etlerinde yüksek düzeyde cıva ve diğer toksinlerin bulunduğu bilinmektedir2. Bu nedenle, deniz memelisi etinin tüketimi sadece hamile kadınlar gibi yüksek riskli gruplar için değil, aynı zamanda genel popülasyon için de bir sağlık sorununa yol açabilir3. Ayrıca, deniz memelisi etinin zoonotik veya potansiyel olarak zoonotik patojenlerle kontaminasyonu, işlenmesi ve depolanması sırasında da meydana gelebilir4. Deneyimli ajanların bile deniz memelisi etlerini yalnızca görünümlerine göre tanımlaması zordur. Bu nedenle, deniz memelisi etini diğer etlerden ayırt etmek için güvenilir bir bilimsel tanımlama yöntemi gereklidir. Bu, deniz memelisi eti tüketimini sınırlamaya yardımcı olacaktır.
Mevcut tür tanımlama yöntemleri arasında moleküler teknikler ve immünolojik yöntemler bulunmaktadır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve DNA dizilimi gibi moleküler teknikler, yalnızca çiğ etten5 ve ayrışmış numunelerden6 değil, aynı zamanda pişmiş sosis ve yem maddeleri7,8 gibi işlenmiş gıdalardan alınan numuneleri tanımlamak için de kullanılabilir. Enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) gibi immünolojik yöntemler, örneğin domuz eti 9, sığır eti10 ve yayın balığı11'in et içeriğini tespit etmek için gıda üretiminde yaygın olarak uygulanır. Cetéan etinin tanımlanması için PCR tabanlı DNA analizi mevcuttur12 ve Japonya, Güney Kore, Filipinler, Tayvan, Hong Kong, Rusya, Norveç ve Amerika Birleşik Devletleri'nde yasa dışı uluslararası deniz memelisi eti ticaretinin önlenmesine yardımcı olmuştur1. Bu yöntemler etkili ve güvenilirdir, ancak tamamlanması saatler veya günler alabilir ve zahmetli adımlar içerebilir. Cetean etlerinin tanımlanması genellikle moleküler tekniklere dayanmaktadır ve şu anda mevcut bir immünolojik yöntem bulunmamaktadır. Düzenleyici kurumlar için, deniz memelisi etlerini tanımlamak için sahada kullanılabilecek güvenilir ve hızlı bir tekniğin geliştirilmesi son derece arzu edilir. 
İmmünokromatografik şeritler, sahada kullanıma uygun basit bir protokol ile hızlı sonuç üretme avantajı ile tespit araçları olarak kullanılır. İmmünokromatografik şerit ve ELISA'nın prensipleri çok benzerdir ve antikorları, antijenleri ve etiketleri içerir. İmmünokromatografik şeritlerin geliştirilmesinde kolloidal altın, karbon ve lateks gibi birçok farklı etiket kullanılmıştır. Şu anda, bu yöntem antibiyotikleri, toksinleri, bakterileri ve virüsleri tespit etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır13, ancak etteki proteinleri tanımlamak için nadiren kullanılmaktadır14,15. Burada, deniz memelisi miyoglobinin (Mb) hızlı tespiti için bir yanal akış kromatografik enzim immünolojik testi öneriyoruz.

<table><tbody><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>AMRESCO</td><td>J373</td><td></td></tr><tr><td>Protein G HP SpinTrap&nbsp;</td><td>GE&nbsp; Sağlık Hizmetleri</td><td>28-9031-34</td><td>Protein G Sefaroz</td></tr><tr><td>IsoStrip Fare Monoklonal Antikor İzotipleme Kiti</td><td>Roche</td><td>11493027001</td><td>İzotipleme Şeritleri içeren spin kolonu, alt sınıfa ve hafif zincire özgü anti-fare-Ig antikorları ile önceden kaplanmıştır</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3935</td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz membran</td><td>Whatman</td><td>Z613630</td><td></td></tr><tr><td>Antikoru Engelleyici Çözüm&nbsp;</td><td>LTK BiyoLaboratuvarları</td><td></td><td>Numunelerde spesifik olmayan IgG'nin spesifik olmayan bağlanma etkileşimlerini en aza indirmek</td></tr><tr><td>için BCIP/NBT fosfataz substratı&nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-81-00</td><td></td></tr><tr><td>Protein Dedektörü HRP Microwell Kiti, Anti-Fare</td><td>KPL</td><td>54-62-18</td><td></td></tr><tr><td>Nunc İmmün Plakası MaxiSorp ELISA plakası</td><td>Termo&nbsp; Fisher Scientific</td><td>EW-01928-08</td><td></td></tr><tr><td>Multiskan&nbsp; EX ELISA okuyucu&nbsp;</td><td>Termo&nbsp; Elektron&nbsp; Corporation</td><td>51118170</td><td></td></tr><tr><td>Kolloid altın (40 nm) çözeltisi&nbsp;</td><td>REGA Biyoteknoloji A.Ş.</td><td></td><td>40-50 nm immünostrip,</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Gibco</td><td>15561-020</td><td></td></tr> için uygundur, <tr><td>Hızlı test, immno-strip yazıcı</td>, <td>REGA biyoteknoloji A.Ş.</td><td>AGISMART RP-1000&nbsp;</td><td>Yalnızca araştırma ve geliştirme amaçlı küçük ölçekli immünoplast üretimi için uygundur</td></tr><tr><td>Şerit bileşenleri (NC membranlar, numune pedleri (# 33 cam, S & S), eşlenik pedler (#16S, S & S) ve emici pedler (CF6, Whatman))</td><td>REGA biyoteknoloji A.Ş.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freund' s adjuvan ve eksik Freund' s adjuvan&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5881, F5506</td> Akrilamid immünojenleri, jel tamponu, amonyum persülfat (APS), tetrametiletilendiamin (TEMED) <td>yağda su emülsiyonlarını üretmek için kullanılır</td></tr><tr><td>;</td><td></td><td>SDS-PAGE Coomassie</td>parlak mavi R-250 Bio-Rad 1610436 için Protech <td></td> Jel hazırlama</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>SDS-PAGE jellerinde protein boyama</td></tr><tr><td>Laemmli numune tamponu ve &beta;-merkaptoetanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610737, 1610710</td><td>SDS-PAGE jellerine yüklemeden önce protein örneklerini seyreltin</td></tr></tbody></table>

deniz memelileri miyoglobin tespiti için bir kolloidal altın merkezli İmmunokromatografik testi strip gelişimi

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

Bu protokol, deniz memelilerinin miyoglobinini (Mb) fokların ve diğer hayvanlarınkinden ayırt etmek için kullanılabilecek sandviç formatına dayalı bir kolloidal altın immünokromatografik test şeridinin geliştirilmesini açıklar. Şerit, deniz memelisi eti için hızlı ve yerinde tarama sağlayarak yasa dışı ticaretini ve tüketimini kısıtlar. Cetaceanların Mb'sine karşı reaktiviteye sahip iki monoklonal antikor (mAb) geliştirilmiştir. Çeşitli hayvanlardan alınan Mb antijenik reaktif bölgelerin amino asit dizileri, iki sentetik peptit (genel bir peptit ve spesifik bir peptit) tasarlamak ve daha sonra mAbs'yi (alt sınıf IgG1) yükseltmek için analiz edildi. mAb'ler indirekt ELISA, western blot ve dot blot ile taranan hibridomlardan seçildi. CGF5H9, tavşanların, köpeklerin, domuzların,, keçilerin ve deniz memelilerinin Mbs'sine özgüyken, tavukların, ton balığının ve fokların Mbs'sine zayıf veya hiç afinasyon göstermedi. CSF1H13, fokları ve deniz memelilerini güçlü bir afiniteye bağlayabilir, ancak diğer hayvanlara afinite göstermemiştir. Bu çalışmada dört familyadan (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae ve Kogiidae) deniz memelisi örnekleri kullanıldı ve sonuçlar, bu iki mAb'nin farklı deniz memelilerinden alınan Mbs'ye geniş bağlanma yeteneğine sahip olduğunu gösterdi. Bu mAb'ler, sandviç tipi bir kolloidal altın immünokromatografik test şeridi üzerine uygulandı. Birçok türü tanıyan CGF5H9, kolloid altın etiketliydi ve tespit antikoru olarak kullanıldı. Test bölgesi üzerine kaplanan CSF1H13, deniz memelisi ve fok balığı Mbs'nin varlığını tespit etti. Ton balığı, tavuk, fok, beş karasal memeli türü ve 15 deniz memelisi türünden alınan kas örnekleri üç nüsha halinde test edildi. Tüm deniz memelisi örnekleri pozitif, diğer tüm örnekler negatif sonuçlar göstermiştir.

Monoklonal antikor özelliklerinin Bu memeli Mb sırasıyla iki sentetik peptidler (MKASEDLKKHGNTVLC ve AIIHVLHSRHPAEFGC) tanıyan, iki IgG 1 mAb (CGF5H9 ve CSF1H13) geliştirildi ve bu memeli Mb hızlı tespiti için yapılan bir sandviç tipi koloidal altın immünokromatografik test şeridi oluşturmak için kullanıldı. Şekil 2, CGF5H9 yaklaşık 17 kDa&#39;lık tahmini bir moleküler ağırlığında tek bir boyanmış bandın olarak, deniz memelileri ve diğer memeliler...

Bu protokol, deniz memelilerinin miyoglobine güçlü bir şekilde reaktif olan iki IgG sınıfı monoklonal antikorun (mAb) gelişimini açıklar. Bu mAb'ler, deniz memelilerinin Mb'sini fok ve diğer hayvanlardan ayırt etmek için sandviç formatına dayalı bir kolloidal altın immünokromatografik test şeridi üzerine uygulanır.

Deniz Memelileri Miyoglobin Tespiti için bir Kolloidal Altın merkezli İmmunokromatografik Testi Strip Gelişimi

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to ...

Bu kolloidal altın immünokromatografik test şeridinin genel amacı, cetaceanların miyoglobinini, fokların ve diğer hayvanlarınkinden ayırt etmektir. Bu yöntem, cetacean etleri için hızlı ve yerinde tarama sağlayarak, böylece bu etlerin yasa dışı ticaretini ve tüketimini engelleyebilir. Bu tekniğin temel avantajı, 0,3 gram kas dokusunun homojenize edilmesinden sonra beş ila on dakika içinde, üstün özgünlük ve hassasiyetle başarılı bir sonucun doğrudan gözlemlenebilmesidir.Böylece bu yöntem, sahada setase etlerinin hızlı bir şekilde tespit edilmesini sağlayabilir. Ayrıca at eti veya domuz eti gibi diğer et türleri için de uygulanabilir. Setaselerin miyoglobinine karşı reaktivite gösteren monoklonal antikorların üretilmesi için sentetik peptitler tasarlamak amacıyla, çeşitli hayvanların miyoglobin antijenik reaktif bölgelerinin amino asit dizileri analiz edilir.Öncelikle GenBank'tan ton balığı, tavuk, devekuşu, evcil memeliler, fok ve 18 balina türünden miyoglobin amino asit dizilerini geri çağırın. Ardından, dizileri uygun yazılımı kullanarak hizalayın. Başlatma çubuğundaki Align Edit/Build Alignment seçeneğini belirleyerek Alignment Explorer'ı başlatın.Yeni Hizalama Oluştur (Create New Alignment) seçeneğini belirleyin ve Tamam'a tıklayın. DNA mı yoksa Protein Dizisi hizalaması mı oluşturduğunuzu soran bir iletişim kutusu görünecektir. Protein etiketli düğmeye tıklayın, Veri Aç (Data Open) kısmından Dosyadan dizileri getir (Retrieve sequences from File) seçeneğini belirleyin ve dizi dosyasını seçin. Veri setindeki her dizinin tüm bölgelerini seçerek çoklu dizi hizalaması oluşturmak için Düzenle (Edit) menüsünden Tümünü Seç (Select All) komutunu belirleyin.Ana menüden Hizalamayı Seç (Select Alignment) ve ardından ClustalW ile Hizala (Align by ClustalW) seçeneğini seçin. Protein ağırlık matrisi olarak BLOSUM'u seçin ve ardından Tamam (OK) düğmesine tıklayın. Üçüncü adım, sekans hizalamasını analiz etmektir.Beş antijenik reaktif bölgeye odaklanın ve setaseler arasında korunan fragmanı bulun. Hizalamadaki bir yıldız işareti konsensüsü simgeler ve tamamen korunan tek bir kalıntıya sahip bir konumu belirtir. Setaselerde iki korunan fragman bulunmuştur.Ardından, aday sekans fragmanları sentezlenir ve monoklonal antikorların üretilmesi için kullanılır. Bu prosedüre, monoklonal antikor ve kolloidal altın çözeltisi karışımını iki saat boyunca kırmızı renkte tutan minimum pH olarak tanımlanan kolloidal altın çözeltisi için optimal pH'ı belirleyerek başlayın. pH değerleri beş ile dokuz arasında değişen 100 µL kolloidal altın çözeltisine 0,15 µg saflaştırılmış saptama monoklonal antikoru ekleyin.Bu demonstrasyon amacıyla, pH 6 ve pH 8 test edilmiştir. Bu optimizasyon adımıyla pH 8 optimal pH olarak belirlenmiştir. Ardından, pH 8'deki 100 µL kolloidal altın çözeltisine farklı miktarlarda saflaştırılmış saptayıcı monoklonal antikor ekleyerek monoklonal antikorun optimal konsantrasyonunu belirleyin.Bu çalışmada mililitre başına altı mikrogram olan optimum konsantrasyon, karışımın rengini siyah çökelek oluşmadan kırmızı tutacaktır. Optimizasyon adımlarından elde edilen sonuçlara dayanarak, 10mL kolloidal altın çözeltisine 60 mikrogram saflaştırılmış saptama monoklonal antikorunu damla damla ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında on dakika boyunca nazikçe emülsifiye edin.Arka plan girişimini azaltmak için karışıma PBS içinde %5 BSA çözeltisinden iki mililitre ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca nazikçe emülsiye edin. Karışımı 4 °C'de 30 dakika boyunca 10.000 xg'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, konjuge olmamış antikor içeren süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın ve oluşan peleti %1 BSA ve %0,1 Tween-20 içeren 4 mL PBS-T içinde süspande edin.Santrifüj ve süspansiyon işlemini bir veya iki kez tekrarlayın. Nihai çökelekleri 1mL PBS-T içinde süspanse edin ve kullanıma kadar dört derece santigrat sıcaklıkta saklayın. İmmün şerit tasarımının bir grafiği burada gösterilmiştir.Kartonun, pedlerin ve nitroselüloz membranın boyutları protokol metninde listelenmiştir. Saklama ömrünü uzatmak için, immün şeritler düşük nemli bir laboratuvar ortam koşulunda hazırlanmalı ve monte edilmelidir. Konjuge pedi doyurmak için kolloidal altın etiketli monoklonal antikor çözeltisini eklemek için bir mikropipet kullanın ve montajdan önce pedi 37 °C'de bir saat boyunca kurutun.Konjugat ped kuruduktan sonra, çift taraflı bant kullanarak önce nitroselüloz membranı kartona yapıştırın. Bir immunostrip yazıcısı kullanarak, nitroselüloz membran üzerindeki test bölgesine spesifik antijen yakalayıcı monoklonal antikoru ve kontrol bölgesine hızlı anti-mouse IGG'yi dağıtın. İki bölge arasında beş milimetreden fazla mesafe bırakın.Ardından, konjugat pedini nitrocellulose membranının bir tarafına, absorban pedini ise diğer tarafına yapıştırın ve her iki taraftaki pedleri yaklaşık iki milimetre kadar üst üste getirin. Örnek pedini, konjugat pedinin üzerine iki milimetre gelecek şekilde yerleştirin ve kartona yapıştırın. Altı milimetre genişliğinde şeritler oluşturmak için bir kağıt kesici kullanın.Şeritleri kurutucu içeren bir alüminyum folyo torbaya yerleştirin ve kullanana kadar dört derece Celsius'ta saklayın. Çapraz reaktivite testi için bir örnek hazırlamak üzere, 0,03 gram çiğ kas dokusuna 0,1% BSA içeren 1mL PBS ekleyin. Örneği homojenize etmek için bir bambu çubuk veya öğütme çubuğu kullanın.İmmün şeridi test alanının karşı ucundan tutun ve örnek pedi kısmını numuneye beş ila on dakika boyunca daldırın. Sonucu doğrudan gözlemleyin. Çeşitli kas örneklerini üç paralel şeklinde test edin.T test çizgisi, her iki monoklonal antikor cetacean miyoglobini tespit ettiğinde pozitif bir sinyal verecek şekilde tasarlanmıştır. Cetacean olmayan hayvanlardan gelen miyoglobin bu iki monoklonal antikordan yalnızca biri tarafından tespit edilebildiği için, diğer hayvanlardan alınan kas örnekleri test edildiğinde test çizgisi negatif sonuç verir. Hızlı anti-mouse IGG, kolloid altın etiketli tespit antikoruna bağlandığı için C kontrol çizgisi her zaman pozitif sonuç vermelidir.Kontrol hattındaki başarısız bir sonuç, şerit üzerindeki materyallerin kalitesinin düşük olduğunu gösterir. Hibridoma süpernatantları kullanılarak yapılan Western kan analizi, CGF5H9 monoklonal antikorunun setaselileri ve diğer memelileri yaklaşık 17kDa öngörülen moleküler ağırlıkta tek bir boyalı bant olarak tespit ettiğini göstermektedir. Yaygın Minke balinası, diğer setaselilerin bantlarına kıyasla nispeten daha sönük bir bant göstermektedir.Ton balığı, fok ve tavuk için bantlar görülmemektedir. Öte yandan, domuz için yaklaşık 50kDa'da bir bant gözlemlenmiştir. Damla kan analizi ile aynı sonuçlar elde edilmiştir.CSF1H13 monoklonal antikor kullanılarak yapılan Western kan analizi domuz ve ton balığı için çok sayıda spesifik olmayan bant gösterse de, CSF1H13 yalnızca setaselerle reaksiyona girdiği için oldukça spesifiktir. Ve fok balığında yaklaşık 17kDa'lık öngörülen bir moleküler ağırlıkta bant görülmektedir. Dot kan analizi ile de aynı sonuçlar elde edilmiştir.Saflaştırılmış CGF5H9 kullanılarak farklı türlerin kas ekstraktlarına uygulanan İndirekt ELISA sonuçları; sığır, keçi, köpek, tavşan ve setaseler için pozitif sinyaller, domuz için zayıf pozitif sinyal, ton balığı, tavuk ve foklar için ise negatif sinyaller göstermektedir. CSF1H13, setaselere ve foklara karşı yüksek afinite göstermektedir. Her iki monoklonal antikor, farklı familyalardan gelen dört setase türünün tamamıyla güçlü şekilde reaksiyona girebilmekte olup, bu durum çeşitli setase türlerine karşı geniş reaktiviteye sahip olduklarını göstermektedir.İmmün kolloidal altın şeridinin özgünlüğü, bu temsilci sonuçlarla gösterilmiştir. Setasya dışı kas örneklerinin kullanımı, yalnızca kontrol hattında tek bir bant oluşumuyla sonuçlanır. Ancak, setasya kas örnekleri kullanıldığında, hem test hattında hem de kontrol hattında sinyal bantları görülür.İşleme hakim olunduğunda, işaretli antikorların hazırlanması ve şeritlerin bu şekilde oluşturulması, uygun şekilde gerçekleştirilirse dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, peptidin dikkatle tasarlanması gerektiğini unutmamak önemlidir. Uygun monoklonal antikorların taranması için birkaç farklı yöntem kullanın.Etiketli antikorlar hazırlamak için yüksek kaliteli kolloidal altın kullanın. Bu prosedürlerin ardından, balina türü ve kökeni gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla PCR tabanlı DNA analizi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Sadece deniz memelilerine karşı güçlü bir afinite sergileyen CSF1H13 monoklonal antikoru, deniz memelilerindeki miyoglobini biyolojik, fizyolojik ve kimyasal yönleriyle incelemek için birçok farklı fırsat sunan çeşitli ELISA formatlarında kullanılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, spesifik monoklonal antikorların nasıl geliştirileceği ve ardından bunların hızlı test şeritlerine nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

development-colloidal-gold-based-immunochromatographic-test-strip-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video Kang göre kolloidal Coomassie G-250 boyama protokol sevdirmek...

Proteinler için Poliakrilamid Jeller Hızlı ve Hassas Kolloidal Coomassie G-250 Boyama

Bu videoda, ultra ince ekzozomal kesitlerin lümen bölgesinde lokalize biyobelirteçlerin altın immün boyamalarını gösteriyoruz. Bu teknik, hastalıklı hücreler tarafından salgılanan eksozomların içindeki hedef moleküllerin görüntülenmesi ile hastalıkların erken teşhisini sağlar.

Ekzozomal Kesitlerin Altın İmmün Boyama: Ekzozomal Lümendeki Tanısal Belirteçleri Görselleştirmek İçin Bir Teknik

Bu videoda, spesifik hedef antijenleri tespit etmek için Raman spektroskopisi tabanlı doğrudan immünoassay yöntemini açıklıyoruz. Raman problarına bağlı altın nanopartiküllerin yüzeyine adsorbe edilen antikorlar, hedef antijenlerle etkileşime girer ve daha sonra tespit edilen spesifik bir Raman spektrumu üretir.

Spesifik Bir Antijeni Tespit Etmek için Raman Spektroskopisi Tabanlı Doğrudan İmmünoassay

Bu video, insan kan trombositlerinden amyotrofik lateral skleroz (ALS) ile ilişkili bir protein biyobelirtecini tespit etmek için bir kılcal elektroforez immünolojik test protokolünü göstermektedir. ALS biyobelirteç proteininin varlığının doğrulanması, trombosit proteinlerinin boyuta dayalı olarak ayrılması ve ardından kemilüminesan tespiti ile elde edilir.

Protein Biyobelirteç Tespiti için Bir Kapiller Elektroforez İmmünoassay

Karmaşık biyolojik örneklerde ölçüm biyolojik giderek karar verme klinik rehberlik. Biz aynı anda kalp miyozin bağlayıcı protein-C, kreatin kinaz MB ve miyokard infarktüsü ve sağlıklı kontrol grubu olan hastalarda serum örneklerinde kardiyak troponin I ölçmek için son derece hassas bir yöntem açıklanmaktadır.

Elektrokemiluminesan immunoassay Serum Kardiyak Miyozin Bağlayıcı Protein-C belirlenmesi için hassas ve özel miktar tayini yöntemi

Ayarlanabilir sıkılık manyetik boncuk seçim yöntemine dayalı olarak küçük moleküllü hedefler için yapı anahtarlamalı aptamerleri seçmek için bir protokol sağlanır. Yapı değiştirme özelliklerine sahip olarak seçilen aptamerler, tarif edilen altın nanopartikül tahlili gibi bir hedefin varlığını işaret etmek için konformasyonel bir değişiklik gerektiren tahliller için faydalıdır.

Bir Kolorimetrik Altın Nanopartikül Testi Uygulanan Yapı-anahtarlama aptamers seçilmesi için bir yöntem

in-the-alanın uygulamaları için küçük moleküllerin tespiti için aptamer-altın nanoparçacık kolorimetrik testinin tasarım ve geliştirme incelenmiştir. Buna ek olarak, akıllı aygıt kolorimetrik bir uygulama (uygulama) doğrulandı ve analiz uzun süreli depolama alanında kullanım için kurulmuştur.

In-alan uygulamaları için tasarım ve Aptamer-Altın Nanopartikül Tabanlı Kolorimetrik Tahliller Gelişimi

Nanoparçacık tabanlı optik problar, Raman ve UV-Vis spektroskopisi kullanarak antijenleri tespit etmek için bir araç olarak tasarlanmıştır. Burada, gelecekteki çoğullama yeteneklerini içerecek şekilde bir UV-Vis/Raman spektroskopisi immünolojik testi için bu tür probların hazırlanması için bir protokol açıklanmaktadır.

Bir UV-Vis ve Raman Spektroskopisi İmmunoassay Platformu imalatı

Bir iletişim kuralı tarafından autometallography Ag deniz karaciğer ve böbrek dokularda yerelleştirmek için sunulmaktadır. Ayrıca, deniz histolojik Ag tahlil (CHAA) adında yeni bir tahlil bu dokuların Ag konsantrasyonlarda tahmin etmek için geliştirilmiştir.

Yerelleştirmek için Autometallography ve yarı ölçmek gümüş deniz doku kullanımı

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

Küçük Molekül Bileşiklerinin Hızlı ve Nicel Tespiti için Yanal Akış İmmünokromatografik Şeridinin Geliştirilmesi

İnsan ve hayvan serumlarında antikor yanıtının özelleştirilebilir tespiti için hücresiz sentetik biyoloji ilkelerine ve nokta-leke tekniğine dayanan yakın zamanda geliştirilmiş bir immünoassay platformunu açıklıyoruz.

İnsan ve hayvan serumlarında antikor yanıtının tespiti için pratik ve uyarlanabilir bir immünoassay platformu olarak hücresiz nokta lekesi

Keşfedin, deniz memelileri miyoglobini için kolloidal altın immünokromatografik test şeridi geliştirme yöntemini. Bu teknik, yasadışı ticareti önlemek amacıyla saha taramasında beş ila on dakikada hızlı sonuç verir.

Deniz Memelileri Miyoglobin Tespiti için bir Kolloidal Altın merkezli İmmunokromatografik Testi Strip Gelişimi

Daha fazla video keşfet