Deniz Memelileri Miyoglobin Tespiti için bir Kolloidal Altın merkezli İmmunokromatografik Testi Strip Gelişimi

Bu kolloidal altın immünokromatografik test şeridinin genel amacı, cetaceanların miyoglobinini, fokların ve diğer hayvanlarınkinden ayırt etmektir. Bu yöntem, cetacean etleri için hızlı ve yerinde tarama sağlayarak, böylece bu etlerin yasa dışı ticaretini ve tüketimini engelleyebilir. Bu tekniğin temel avantajı, 0,3 gram kas dokusunun homojenize edilmesinden sonra beş ila on dakika içinde, üstün özgünlük ve hassasiyetle başarılı bir sonucun doğrudan gözlemlenebilmesidir.

Böylece bu yöntem, sahada setase etlerinin hızlı bir şekilde tespit edilmesini sağlayabilir. Ayrıca at eti veya domuz eti gibi diğer et türleri için de uygulanabilir. Setaselerin miyoglobinine karşı reaktivite gösteren monoklonal antikorların üretilmesi için sentetik peptitler tasarlamak amacıyla, çeşitli hayvanların miyoglobin antijenik reaktif bölgelerinin amino asit dizileri analiz edilir.

Öncelikle GenBank'tan ton balığı, tavuk, devekuşu, evcil memeliler, fok ve 18 balina türünden miyoglobin amino asit dizilerini geri çağırın. Ardından, dizileri uygun yazılımı kullanarak hizalayın. Başlatma çubuğundaki Align Edit/Build Alignment seçeneğini belirleyerek Alignment Explorer'ı başlatın.

Yeni Hizalama Oluştur (Create New Alignment) seçeneğini belirleyin ve Tamam'a tıklayın. DNA mı yoksa Protein Dizisi hizalaması mı oluşturduğunuzu soran bir iletişim kutusu görünecektir. Protein etiketli düğmeye tıklayın, Veri Aç (Data Open) kısmından Dosyadan dizileri getir (Retrieve sequences from File) seçeneğini belirleyin ve dizi dosyasını seçin. Veri setindeki her dizinin tüm bölgelerini seçerek çoklu dizi hizalaması oluşturmak için Düzenle (Edit) menüsünden Tümünü Seç (Select All) komutunu belirleyin.

Ana menüden Hizalamayı Seç (Select Alignment) ve ardından ClustalW ile Hizala (Align by ClustalW) seçeneğini seçin. Protein ağırlık matrisi olarak BLOSUM'u seçin ve ardından Tamam (OK) düğmesine tıklayın. Üçüncü adım, sekans hizalamasını analiz etmektir.

Beş antijenik reaktif bölgeye odaklanın ve setaseler arasında korunan fragmanı bulun. Hizalamadaki bir yıldız işareti konsensüsü simgeler ve tamamen korunan tek bir kalıntıya sahip bir konumu belirtir. Setaselerde iki korunan fragman bulunmuştur.

Ardından, aday sekans fragmanları sentezlenir ve monoklonal antikorların üretilmesi için kullanılır. Bu prosedüre, monoklonal antikor ve kolloidal altın çözeltisi karışımını iki saat boyunca kırmızı renkte tutan minimum pH olarak tanımlanan kolloidal altın çözeltisi için optimal pH'ı belirleyerek başlayın. pH değerleri beş ile dokuz arasında değişen 100 µL kolloidal altın çözeltisine 0,15 µg saflaştırılmış saptama monoklonal antikoru ekleyin.

Bu demonstrasyon amacıyla, pH 6 ve pH 8 test edilmiştir. Bu optimizasyon adımıyla pH 8 optimal pH olarak belirlenmiştir. Ardından, pH 8'deki 100 µL kolloidal altın çözeltisine farklı miktarlarda saflaştırılmış saptayıcı monoklonal antikor ekleyerek monoklonal antikorun optimal konsantrasyonunu belirleyin.

Bu çalışmada mililitre başına altı mikrogram olan optimum konsantrasyon, karışımın rengini siyah çökelek oluşmadan kırmızı tutacaktır. Optimizasyon adımlarından elde edilen sonuçlara dayanarak, 10mL kolloidal altın çözeltisine 60 mikrogram saflaştırılmış saptama monoklonal antikorunu damla damla ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında on dakika boyunca nazikçe emülsifiye edin.

Arka plan girişimini azaltmak için karışıma PBS içinde %5 BSA çözeltisinden iki mililitre ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca nazikçe emülsiye edin. Karışımı 4 °C'de 30 dakika boyunca 10.000 xg'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, konjuge olmamış antikor içeren süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın ve oluşan peleti %1 BSA ve %0,1 Tween-20 içeren 4 mL PBS-T içinde süspande edin.

Santrifüj ve süspansiyon işlemini bir veya iki kez tekrarlayın. Nihai çökelekleri 1mL PBS-T içinde süspanse edin ve kullanıma kadar dört derece santigrat sıcaklıkta saklayın. İmmün şerit tasarımının bir grafiği burada gösterilmiştir.

Kartonun, pedlerin ve nitroselüloz membranın boyutları protokol metninde listelenmiştir. Saklama ömrünü uzatmak için, immün şeritler düşük nemli bir laboratuvar ortam koşulunda hazırlanmalı ve monte edilmelidir. Konjuge pedi doyurmak için kolloidal altın etiketli monoklonal antikor çözeltisini eklemek için bir mikropipet kullanın ve montajdan önce pedi 37 °C'de bir saat boyunca kurutun.

Konjugat ped kuruduktan sonra, çift taraflı bant kullanarak önce nitroselüloz membranı kartona yapıştırın. Bir immunostrip yazıcısı kullanarak, nitroselüloz membran üzerindeki test bölgesine spesifik antijen yakalayıcı monoklonal antikoru ve kontrol bölgesine hızlı anti-mouse IGG'yi dağıtın. İki bölge arasında beş milimetreden fazla mesafe bırakın.

Ardından, konjugat pedini nitrocellulose membranının bir tarafına, absorban pedini ise diğer tarafına yapıştırın ve her iki taraftaki pedleri yaklaşık iki milimetre kadar üst üste getirin. Örnek pedini, konjugat pedinin üzerine iki milimetre gelecek şekilde yerleştirin ve kartona yapıştırın. Altı milimetre genişliğinde şeritler oluşturmak için bir kağıt kesici kullanın.

Şeritleri kurutucu içeren bir alüminyum folyo torbaya yerleştirin ve kullanana kadar dört derece Celsius'ta saklayın. Çapraz reaktivite testi için bir örnek hazırlamak üzere, 0,03 gram çiğ kas dokusuna 0,1% BSA içeren 1mL PBS ekleyin. Örneği homojenize etmek için bir bambu çubuk veya öğütme çubuğu kullanın.

İmmün şeridi test alanının karşı ucundan tutun ve örnek pedi kısmını numuneye beş ila on dakika boyunca daldırın. Sonucu doğrudan gözlemleyin. Çeşitli kas örneklerini üç paralel şeklinde test edin.

T test çizgisi, her iki monoklonal antikor cetacean miyoglobini tespit ettiğinde pozitif bir sinyal verecek şekilde tasarlanmıştır. Cetacean olmayan hayvanlardan gelen miyoglobin bu iki monoklonal antikordan yalnızca biri tarafından tespit edilebildiği için, diğer hayvanlardan alınan kas örnekleri test edildiğinde test çizgisi negatif sonuç verir. Hızlı anti-mouse IGG, kolloid altın etiketli tespit antikoruna bağlandığı için C kontrol çizgisi her zaman pozitif sonuç vermelidir.

Kontrol hattındaki başarısız bir sonuç, şerit üzerindeki materyallerin kalitesinin düşük olduğunu gösterir. Hibridoma süpernatantları kullanılarak yapılan Western kan analizi, CGF5H9 monoklonal antikorunun setaselileri ve diğer memelileri yaklaşık 17kDa öngörülen moleküler ağırlıkta tek bir boyalı bant olarak tespit ettiğini göstermektedir. Yaygın Minke balinası, diğer setaselilerin bantlarına kıyasla nispeten daha sönük bir bant göstermektedir.

Ton balığı, fok ve tavuk için bantlar görülmemektedir. Öte yandan, domuz için yaklaşık 50kDa'da bir bant gözlemlenmiştir. Damla kan analizi ile aynı sonuçlar elde edilmiştir.

CSF1H13 monoklonal antikor kullanılarak yapılan Western kan analizi domuz ve ton balığı için çok sayıda spesifik olmayan bant gösterse de, CSF1H13 yalnızca setaselerle reaksiyona girdiği için oldukça spesifiktir. Ve fok balığında yaklaşık 17kDa'lık öngörülen bir moleküler ağırlıkta bant görülmektedir. Dot kan analizi ile de aynı sonuçlar elde edilmiştir.

Saflaştırılmış CGF5H9 kullanılarak farklı türlerin kas ekstraktlarına uygulanan İndirekt ELISA sonuçları; sığır, keçi, köpek, tavşan ve setaseler için pozitif sinyaller, domuz için zayıf pozitif sinyal, ton balığı, tavuk ve foklar için ise negatif sinyaller göstermektedir. CSF1H13, setaselere ve foklara karşı yüksek afinite göstermektedir. Her iki monoklonal antikor, farklı familyalardan gelen dört setase türünün tamamıyla güçlü şekilde reaksiyona girebilmekte olup, bu durum çeşitli setase türlerine karşı geniş reaktiviteye sahip olduklarını göstermektedir.

İmmün kolloidal altın şeridinin özgünlüğü, bu temsilci sonuçlarla gösterilmiştir. Setasya dışı kas örneklerinin kullanımı, yalnızca kontrol hattında tek bir bant oluşumuyla sonuçlanır. Ancak, setasya kas örnekleri kullanıldığında, hem test hattında hem de kontrol hattında sinyal bantları görülür.

İşleme hakim olunduğunda, işaretli antikorların hazırlanması ve şeritlerin bu şekilde oluşturulması, uygun şekilde gerçekleştirilirse dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, peptidin dikkatle tasarlanması gerektiğini unutmamak önemlidir. Uygun monoklonal antikorların taranması için birkaç farklı yöntem kullanın.

Etiketli antikorlar hazırlamak için yüksek kaliteli kolloidal altın kullanın. Bu prosedürlerin ardından, balina türü ve kökeni gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla PCR tabanlı DNA analizi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Sadece deniz memelilerine karşı güçlü bir afinite sergileyen CSF1H13 monoklonal antikoru, deniz memelilerindeki miyoglobini biyolojik, fizyolojik ve kimyasal yönleriyle incelemek için birçok farklı fırsat sunan çeşitli ELISA formatlarında kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, spesifik monoklonal antikorların nasıl geliştirileceği ve ardından bunların hızlı test şeritlerine nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.