Deniz Memelileri Miyoglobin Tespiti için bir Kolloidal Altın merkezli İmmunokromatografik Testi Strip Gelişimi

Bu kolloidal altın immünokromatografik test şeridinin genel amacı, deniz memelilerinin miyoglobinini fokların ve diğer hayvanlarınkinden ayırt etmektir. Bu yöntem, deniz memelisi eti için hızlı ve yerinde tarama sağlayabilir ve böylece yasa dışı ticaretini ve tüketimini kısıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, 03 gram kasın homojenize edilmesinden beş ila on dakika sonra, olağanüstü bir özgüllük ve hassasiyetle doğrudan başarılı bir sonucun gözlemlenebilmesidir.

Dolayısıyla bu yöntem, tarlada deniz memelisi etinin hızlı bir şekilde tespit edilmesini sağlayabilir. At eti veya domuz eti gibi diğer etlere de uygulanabilir. Cetaceanların miyoglobine karşı reaktiviteye sahip monoklonal antikorları yükseltmek için sentetik peptitler tasarlamak için, çeşitli hayvanlardan alınan miyoglobin antijenik reaktif bölgelerinin amino asit dizileri analiz edilir.

Ton balığı, tavuk, devekuşu, evcil memeliler, fok balığı ve 18 deniz memelisi türünden miyoglobinin amino asit dizilerini GenBank'tan alarak başlayın. Ardından, uygun yazılımı kullanarak dizileri hizalayın. Başlatma çubuğunda Align Edit/Build Alignment'ı seçerek Alignment Explorer'ı başlatın.

Yeni Hizalama Oluştur'u seçin ve Tamam'ı tıklatın. Bir DNA veya Protein Dizisi hizalaması mı oluşturduğunuzu soran bir iletişim kutusu görünecektir. Protein etiketli düğmeye tıklayın, Veri Aç'ı seçin Dosyadan dizileri al ve dizi dosyasını seçin. Çoklu dizi hizalaması oluşturmak üzere veri kümesindeki her dizi için tüm siteleri seçmek üzere Düzenle Tümünü Seç menü komutunu seçin.

Ana menüden Alignment Align by ClustalW'yi seçin. Protein ağırlık matrisi olarak BLOSUM'u seçin ve ardından Tamam düğmesine tıklayın. Üçüncü adım, dizi hizalamasını analiz etmektir.

Beş antijenik reaktif bölgeye odaklanın ve deniz memelileri arasında korunan parçayı bulun. Yıldız işareti, hizalamadaki fikir birliğini sembolize eder ve tek, tamamen korunmuş bir kalıntıya sahip bir konumu gösterir. Deniz memelilerinde korunmuş iki parça bulundu.

Aday dizi fragmanları daha sonra sentezlenir ve monoklonal antikorları yükseltmek için kullanılır. Bu prosedüre, monoklonal antikor ve kolloidal altın çözeltisi karışımını iki saat boyunca kırmızı renkte tutan minimum pH olarak tanımlanan kolloidal altın çözeltisi için en uygun pH'ı belirleyerek başlayın. pH değerleri beş ila dokuz arasında değişen 100 mikrolitre kolloidal altın çözeltisine 0.15 mikrogram saflaştırılmış tespit edici monoklonal antikor ekleyin.

Bu gösterimin amaçları doğrultusunda, pH altı ve pH sekiz test edilir. pH sekiz, bu optimizasyon adımı ile optimal pH olarak kabul edildi. Daha sonra, pH sekizde 100 mikrolitre kolloidal altın çözeltisine çeşitli miktarlarda saflaştırılmış tespit edici monoklonal antikor ekleyerek monoklonal antikorun optimal konsantrasyonunu belirleyin.

Bu çalışmada mililitre başına altı mikrogram olan optimum konsantrasyon, karışımın rengini siyah çökelti olmadan kırmızı tutacaktır. Optimizasyon adımlarından elde edilen sonuçlara dayanarak, 10 mL kolloidal altın çözeltisine damla damla 60 mikrogram saflaştırılmış tespit edici monoklonal antikor ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında on dakika boyunca nazikçe emülsifiye edin.

Karışıma PBS içinde iki mililitre %5'lik BSA çözeltisi ekleyin ve arka plan girişimini azaltmak için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca nazikçe emülsifiye edin. Karışımı dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 10.000 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı konjuge olmayan antikorla dikkatlice çıkarın ve elde edilen peleti %1 BSA ve %0.1 Tween-20 içeren 4 mL PBS-T içinde askıya alın.

Santrifüjleme ve süspansiyonu bir veya iki kez tekrarlayın. Son çökeltileri 1 mL PBS-T'de askıya alın ve kullanılana kadar dört santigrat derecede saklayın. Bağışıklık şeridi tasarımının bir grafiği burada gösterilmiştir.

Karton, pedler ve nitroselüloz membranın boyutları protokol metninde listelenmiştir. Depolama ömrünü uzatmak için, bağışıklık şeritleri düşük nemli bir laboratuvar ortamında hazırlanmalı ve monte edilmelidir. Kolloid altın etiketli monoklonal antikor solüsyonunu doyurmak için konjugat pede eklemek için bir mikropipet kullanın ve ardından pedi montajdan önce bir saat boyunca 37 santigrat derecede kurutun.

Eşlenik ped kuruduktan sonra, önce nitroselüloz membranı kartona yapıştırmak için çift taraflı bant kullanın. Bir immünostrip yazıcı kullanarak, spesifik antijen yakalayan monoklonal antikoru ve hızlı anti-fare IGG'yi sırasıyla nitroselüloz membran üzerindeki test bölgesi ve kontrol bölgesi üzerine dağıtın. İki bölge arasında beş milimetreden daha büyük bir mesafe bırakın.

Daha sonra eşlenik pedi nitroselüloz zarın bir tarafına ve emici pedi diğer tarafa yapıştırın ve her iki taraftaki pedleri yaklaşık iki milimetre üst üste getirin. Numune pedini eşlenik pedin üzerine iki milimetre yerleştirin ve kartona yapıştırın. Altı milimetre genişliğinde şeritler oluşturmak için bir kağıt kesici kullanın.

Şeritleri kurutucu bir alüminyum folyo torbaya koyun ve kullanana kadar dört santigrat derecede saklayın. Çapraz reaktivite testi için bir numune hazırlamak için, 0.03 gram ham kas için% 0.1 BSA içeren 1 mL PBS ekleyin. Ve numuneyi homojenize etmek için bir bambu çubuk veya bir taşlama çubuğu kullanın.

Bağışıklık şeridini test alanının karşısındaki ucundan tutun ve numune pedi parçasını numuneye beş ila on dakika daldırın. Sonucu doğrudan gözlemleyin. Çeşitli kas örneklerini üçlü olarak test edin.

T test çizgisi, her iki monoklonal antikor da deniz memelisi miyoglobini tespit ettiğinde pozitif bir sinyal gösterecek şekilde tasarlanmıştır. Cetacean olmayan hayvanlardan elde edilen miyoglobin, bu iki monoklonal antikordan yalnızca biri tarafından tespit edilebildiğinden, diğer hayvanlardan alınan kas örnekleri test edildiğinde test çizgisi negatif bir sonuç gösterir. C kontrol hattı her zaman pozitif bir sonuç göstermelidir, çünkü hızlı anti-fare IGG, kolloid altın etiketli tespit antikorunu bağlar.

Kontrol satırındaki başarısız bir sonuç, şeritteki malzemelerin kalitesinin düşük olduğunu gösterir. Hibridoma süpernatantları kullanılarak yapılan Batı kan analizi, CGF5H9 monoklonal antikorunun, deniz memelilerini ve diğer memelileri, yaklaşık 17kDa'lık tahmini bir moleküler ağırlıkta tek bir lekeli bant olarak tespit ettiğini göstermektedir. Yaygın Minke balinası, diğer deniz memelilerinin bantlarından nispeten daha sönük bir bant gösterir.

Ton balığı, fok balığı ve tavuk için bant yoktur. Oysa domuz için yaklaşık 50kDa'da bir bant gözlenir. Nokta kan analizi ile aynı sonuçlar elde edilir.

CSF1H13 monoklonal antikoru kullanılarak yapılan Batı kan analizi, domuz ve ton balığı için çoklu spesifik olmayan bantlar gösterse de, CSF1H13 oldukça spesifiktir çünkü sadece deniz memelileri ile reaksiyona girer. Ve conta, yaklaşık 17kDa'lık tahmini moleküler ağırlığa sahip bir banda sahiptir. Nokta kan analizi ile aynı sonuçlar elde edilir.

Saflaştırılmış CGF5H9 kullanılarak farklı türlerin kas ekstraktlarının Dolaylı ELISA'sından elde edilen sonuçlar,, keçi, köpek, tavşan ve deniz memelileri için pozitif sinyaller, domuz için zayıf bir pozitif sinyal ve ton balığı, tavuk ve fok için negatif sinyaller göstermektedir. CSF1H13 deniz memelilerine ve foklara karşı yüksek afinite gösterir. Her iki monoklonal antikor da farklı ailelerden olan dört deniz memelisi türü ile güçlü bir şekilde reaksiyona girebilir ve bu da çeşitli deniz memelisi türlerine karşı geniş reaktivitelerini gösterir.

İmmün kolloidal altın şeridin özgüllüğü bu temsili sonuçlarla gösterilir. Deniz memelisi olmayan kas örneklerinin kullanılması, kontrol hattında sadece tek bir bantla sonuçlanır. Bununla birlikte, deniz memelisi kas örnekleri kullanıldığında, sinyal bantları hem test hattında hem de kontrol hattında bulunur.

Bir kez ustalaştıktan sonra, etiketli antikorların hazırlanması ve bu şerit yapımı, uygun şekilde yapılırsa dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, peptidi dikkatli bir şekilde tasarlamayı hatırlamak önemlidir. Uygun monoklonal antikorları taramak için çeşitli yöntemler kullanın.

Ve etiketli antikorları hazırlamak için yüksek kaliteli kolloidal altın kullanın. Bu prosedürleri takiben, deniz memelisi türü ve nereden geldiği gibi ek soruları yanıtlamak için PCR tabanlı DNA analizi gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir. Güçlü olan ve sadece deniz memelilerine karşı afinite sergileyen CSF1H13 monoklonal antikor, deniz memelilerinde miyoglobinin biyolojik, fizyolojik ve kimyasal yönlerini incelemek için birçok başka fırsat sunan ELISA'nın çeşitli formatlarında kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, spesifik monoklonal antikorların nasıl geliştirileceğini iyi anlamalı ve daha sonra bunları hızlı test şeridi üzerine uygulamalısınız.