Endotoksin ve DNA İçeriği için Hava örneklenmiş Filtresi Analizi

Bu prosedürün genel amacı, filtreler üzerinde örneklenen, ekstrakte edilmiş havadaki partiküllerin endotoksin ve DNA içeriğinin nasıl doğru şekilde analiz edileceğini açıklamaktır. Bu yöntem, sağlıkla ilgili nedenlerin anlaşılması gibi iç ve dış mekan biyolojik aerosol araştırmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Filtre örnekleme prosedürünü laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Yinon Mazar gösterecektir.

Yüksek hacimli örnekleme için kuvars fiberden yapılmış filtreler kullanın. Veya araştırma ihtiyaçlarına en uygun filtre kesme boyutunun yanı sıra özel filtre tipini seçin. Organik ve biyolojik bileşik örneklemesi için kullanılacak filtreleri, önce her birini ayrı ayrı alüminyum folyoya sararak ön pişirme işlemine tabi tutun.

Ardından, bunları bir laboratuvar fırınında 450 °C'de en az beş saat boyunca pişirin. Bu işlem, önceden mevcut olan tüm organik kalıntıları yok edecektir. Pişmiş filtreleri, örnekleme için kullanılana kadar 20 °C'de saklayın.

Ardından, beraberindeki metin protokolünde açıklanan türden bir yüksek hacimli örnekleyiciyi temizleyin ve dezenfekte edin. Daha sonra, önceden pişirilmiş filtreyi filtre kasetine yerleştirin ve uygun bir örnek toplamak için örnekleyiciyi üretici talimatlarına uygun olarak çalıştırın. İkinci sınıf bir biyogüvenlik kabininde, temiz bir 1,12 santimetre çaplı mantar delicisi kullanarak, temiz ve önceden pişirilmiş filtre materyalinden 22 adet dairesel parça kesin.

Kontrol olarak kullanılacak bir dizi endotoksin katkılı filtre hazırlamak için bu parçaları kullanın. Ardından, toplanan örneği içeren filtreleri temiz bir 1.12 santimetre çaplı mantar delicisiyle kesin ve her bir örneği kendi pirojen içermeyen iki mililitrelik tüpüne yerleştirin. Ayrıca, kurutulmuş endotoksin katkılı filtreleri ayrı pirojen içermeyen iki mililitrelik tüplere aktarın.

Her bir tüpe bir mililitre pirojensiz su ekleyin. Ardından, bir laboratuvar çalkalayıcısı kullanarak oda sıcaklığında 60 dakika boyunca çalkalayın. Sonra, örnek tüplerini bir mikrosentrifüjde 10 dakika boyunca 375 ×g hızında santrifüjleyin.

Ardından, endotoksinleri içeren süpernatantı yeni, pirojensiz iki mililitrelik bir tüpe aktarın. Endotoksin testi için, öncelikle numune konumlarını belirleyerek kapaklı, pirojensiz 96 kuyucuklu düz tabanlı bir mikroplaka hazırlayın.

Ardından, mikroplaka okuyucuyu açın ve cihazı 37 °C'de, her beş dakikada bir çalkalama yapacak şekilde kinetik reaksiyon için programlayın. Bunu 405 nm'de ölçümlerle takip edin. Beş dakikalık çalkalama ve plaka okuma işlemini 18 kez tekrarlayın.

Filtreleri spike etmek için daha önce kullanılan 50 µL standart endotoksin çözeltilerini A1 ile A10 ve B1 ile B10 satırlarına yerleştirerek numuneleri plakaya yükleyin. Boş örnekleri (blank) A11, A12, B11 ve B12 hücrelerine yerleştirin. Ardından, santrifüj edilmiş spike'lı filtre ekstraktının ve boş örneklerin süpernatanlarını C ve D satırlarına ekleyin. Daha sonra, deneysel numunelerin ve boş örneklerin süpernatanlarını gerektiği şekilde kalan kuyucuklara ekleyin.

Testi aktive etmek için, her kuyucuğa hızlıca 50 µL limulus amebocyte glycate çözeltisi ekleyin. Plakayı yatay olarak hafifçe sallayın. Plakayı okuyucuya yerleştirmeden ve deneysel çalışmayı başlatmadan önce.

İşlem tamamlandığında, plakayı plaka okuyucudan çıkarın. Standart eğriyi kullanarak her bir örnekteki endotoksin seviyesini belirleyin ve ayrıca endotoksinlerin örnek filtrelerinden çıkarılma verimliliğini hesaplayın. İlk olarak, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde DNA eklenmiş filtreleri hazırlayın.

Her filtre örneği için, 0,5 mililitrelik steril tüplere 0,1 gram 425 ila 600 mikrometre çapındaki boncuklar ve 0,3 gram 106 mikrometre veya daha küçük çaplı boncuklardan oluşan asitle yıkanmış cam boncuk karışımı hazırlayın. Ardından, dezenfekte edilmiş 1,12 santimetre çapında bir mantar delicisi kullanarak her filtre örneğinin rastgele seçilen bölgelerinden üç adet dairesel parça kesin. Filtre örneklerini ayrı ayrı vidalı kapaklı iki mililitrelik tüplere yerleştirin.

Ardından, DNA ekstraksiyon kiti ile birlikte verilen hücre liziz tamponundan 60 µL ile birlikte cam boncuk karışımını her tüpe ekleyin. Tüpleri kapatın ve örnekleri boncuk parçalayıcıya (bead beater) yerleştirin. Filtrelenmiş hücreleri mekanik olarak parçalamak için boncuk parçalayıcıyı bir dakika boyunca kullanın ve ardından örnekleri bir dakika daha buz üzerinde bekleterek soğutun.

Bu döngüyü beş kez tekrarlayın. Kit tedarikçisinin protokolünü takip ederek liz edilen hücrelerden DNA'yı ekstrakte edin. Elüsyon sonrası, DNA verimini artırmak için elüe edilen örneği ekstraksiyon kolonundan ikinci kez geçirin.

Isınması için kantitatif PCR cihazını önceden açın. Cihazın işletim yazılımında, yeni bir program dosyasına kantitatif PCR çalışmasına ait detayları girin. Ardından, çalışma yüzeyini yüzey DNA dekontaminasyon solüsyonu ile dezenfekte edin ve yalnızca steril tüpler, uçlar ve reaktifler kullanın.

Ayrıca, çalışma tezgahının yanına bir buz kovası yerleştirin ve tac polemoraris karışımını kovanın içine koyun. Kantitatif PCR reaksiyon karışımını, beraberindeki metin protokolünün dördüncü tablosunda açıklandığı şekilde hazırlayın. Reaksiyon karışımını kullanıma kadar karanlıkta ve buz üzerinde saklayın.

Ardından, çalışma yüzeyine temas etmesini önlemek ve temiz tutmak için temiz bir mikroplakayı plaka tutucuya yerleştirin. Kantitatif PCR mikroplakasının kuyucuklarına üç tekrar şeklinde bir mikrolitre standart DNA, örnek DNA veya nükleazsız su ekleyin. Daha sonra, her bir reaksiyon kuyucuğuna dokuz mikrolitre master reaksiyon karışımı ekleyin.

İşlem tamamlandığında, plakayı optik yapışkan filmle kapatın ve tüm kenarlarından sıkıca mühürleyin. Termosikletöre yerleştirmeden önce, plakayı plaka kovalarıyla donatılmış bir santrifüjde 1000 ×g hızında bir dakika boyunca döndürerek çöktürün. Son olarak, hazırlanan kantitatif PCR programını aktif hale getirip çalıştırın.

Endotoksin ekstraksiyonu sırasında, endotoksini filtreden ayırmak için filtre örnekleri santrifüjde döndürülür. Farklı santrifügasyon hızları, özellikle yüksek endotoksin konsantrasyonlarında, farklı ekstraksiyon verimlilikleri ile sonuçlanır.

Seçilen spesifik filtre ve uygulanan protokol için öncelikle bir ekstraksiyon verimliliği testi gerçekleştirilmelidir. Temiz filtrelere standart eklemesi (spiking) yapıldığında, örneklenmiş kuvars filtrelere kıyasla daha yüksek ekstraksiyon verimlilikleri elde edilir ve bu iki verimlilik de standart çözeltinin doğrudan tespitiyle elde edilen verimlilikten daha düşüktür. Yöntem uzmanlaşıldığında, endotoksin analizi uygun şekilde yürütüldüğü takdirde üç buçuk saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü takiben, organizmaların atmosferdeki taşınımına ilişkin ek soruları yanıtlamak amacıyla DNA dizileme gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hava örneği filtrelerinden endotoksinlerin ve DNA'nın nasıl verimli bir şekilde ekstrakte edileceği ve bunların nasıl doğru şekilde analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.