Name: Farelerde oral sonda ardından Probiyotik Maya Dönüşümü ve Gastrointestinal Bağışıklık Dokular Onların Kurtarma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Keşfedin Saccharomyces boulardii probiyotik mayasında oksotrofik mutant suş geliştirme ve fare gastrointestinal dokularına yapışma analizi yöntemleri. Bu teknikler oral aşılama araştırmalarını destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Tracey J. Lamb verilen İmmünoloji ve Aşılar ve NIH Yeni Yenilikçisi Ödülü (1DP2AI112242-01) için Çocuk Merkezi aracılığıyla finansman kabul. Yazarlar ayrıca rad1 S. cömert katkılarından dolayı Natalya P. Degtyareva teşekkür cerevisiae.

<ol><li>Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+and+physiological+characterization+of+Saccharomyces+boulardii%2C+the+probiotic+strain+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae.</a> Applied and environmental microbiology. 73 (8), 2458-2467 (2007).</li>
<li>Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Heterologous+Protein+Expression+by+Genetically+Engineered+Probiotic+Yeast+Saccharomyces+boulardii%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Functional Heterologous Protein Expression by Genetically Engineered Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii.</a> PloS one. 9 (11), 1-12 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+in+Enzymology%2C+Volume+149%3A+Guide+to+Yeast+Genetics+and+Molecular+Biology%22">Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology</a>. Guthrie, C., Fink, G. R. , (1991).</li>
<li>DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic acids research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Lorenz, M. C., Muir, R. S., Lim, E., McElver, J., Weber, S. C., Heitman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+with+PCR+products+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Gene disruption with PCR products in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene. 158, 113-117 (1995).</li>
<li>Hamedi, H., Misaghi, A., Modarressi, M. H., Salehi, T. Z., Khorasanizadeh, D., Khalaj, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+Uracil+Auxotroph+Strain+of+the+Probiotic+Yeast+Saccharomyces+boulardii+as+a+Host+for+the+Recombinant+Protein+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Avicenna+Journal+of+Medical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of a Uracil Auxotroph Strain of the Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii as a Host for the Recombinant Protein Production.</a> Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (1), 29-34 (2013).</li>
<li>Hinnen, A., Hicks, J. B., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (4), 1929-1933 (1978).</li>
<li>Hashimoto, H., Morikawa, H., Yamada, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+transformation+of+intact+yeast+cells+by+electroinjection+of+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 21, 336-339 (1985).</li>
<li>Becker, D., Guarente, L. High-efficiency transformation of yeast by electroporation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBecker%2C+D+%22Methods+in+Enzymology%2C+Volume+149%3A+Guide+to+Yeast+Genetics+and+Molecular+Biology%22">Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology</a>. , 182-187 (1991).</li>
<li>Benatuil, L., Perez, J. M., Belk, J., Hsieh, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+yeast+transformation+method+for+the+generation+of+very+large+human+antibody+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+engineering%2C+design+%26+selection+%3A+PEDS%22%5BJournal%5D)">An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries.</a> Protein engineering, design & selection : PEDS. 23 (4), 155-159 (2010).</li>
<li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> Journal of Bacteriology. 153 (1), 166-168 (1983).</li>
<li>Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+other+fungi%3A+methods+and+possible+underlying+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered+bugs%22%5BJournal%5D)">Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism.</a> Bioengineered bugs. 1 (6), 395-403 (2010).</li>
<li>Zheng, H. Z., Liu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+transformation+process+studied+by+fluorescence+labeling+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Yeast transformation process studied by fluorescence labeling technique.</a> Bioconjugate Chemistry. 16, 250-254 (2005).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of yeast.</a> BioTechniques. 30 (4), 816-831 (2001).</li>
<li>JoVE Science Education Database. The ELISA Method. . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology</a>. , (2015).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (16), (2008).</li>
<li>Horn, C. C., Kimball, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+Can%27t+Rodents+Vomit%3F+A+Comparative+Behavioral%2C+Anatomical%2C+and+Physiological+Study%5BTitle%5D)+AND+%22+PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Why Can't Rodents Vomit? A Comparative Behavioral, Anatomical, and Physiological Study.</a> PLoS ONE. 8 (4), (2013).</li>
<li>Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spoonful+of+sugar+helps+the+medicine+go+down%3A+a+novel+technique+to+improve+oral+gavage+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science+%3A+JAALAS%22%5BJournal%5D)">A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 49 (3), 329-334 (2010).</li>
<li>Johnson, M., Shayne, C. G., Kemper, C. J. The rat. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+M+%22Animal+Models+in+Toxicology%22">Animal Models in Toxicology</a>. , 50-193 (2006).</li>
<li>Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+produced+by+gavage+administration+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Contemporary+topics+in+laboratory+animal+science+%2F+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Stress produced by gavage administration in the rat.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 39, 17-21 (2000).</li>
<li>Jacoby, R., Fox, J., Davisson, M. Biology and diseases of mice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJacoby%2C+R+%22Laboratory+animal+medicine%22">Laboratory animal medicine</a>. , 35-133 (2002).</li>
<li>Schulz, O., Pabst, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+sampling+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen sampling in the small intestine.</a> Trends in immunology. 34 (4), 155-161 (2013).</li>
<li>McDole, J. R., Wheeler, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goblet+cells+deliver+luminal+antigen+to+CD103%2B+dendritic+cells+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine.</a> Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).</li>
<li>Farache, J., Koren, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+bacteria+recruit+CD103%2B+dendritic+cells+into+the+intestinal+epithelium+to+sample+bacterial+antigens+for+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Luminal bacteria recruit CD103+ dendritic cells into the intestinal epithelium to sample bacterial antigens for presentation.</a> Immunity. 38 (3), 581-595 (2013).</li>
<li>Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurke%2C+D+%22Methods+in+yeast+genetics%3A+a+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+course+manual%22">Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual</a>. , Cold Spring Harbor Lab Press. (2000).</li>
<li>Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+positive+selection+for+mutants+lacking+orotidine-5%27-phosphate+decarboxylase+activity+in+yeast%3A+5-fluoro-orotic+acid+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+general+genetics+%3A+MGG%22%5BJournal%5D)">A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance.</a> Molecular & general genetics : MGG. 197 (2), 345-346 (1984).</li>
<li>Chattoo, B. B., Sherman, F., Azubalis, D. A., Fjellstedt, T. A., Mehnert, D., Ogur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+lys2+mutants+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+the+utilization+of+alpha-aminoadipate%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Selection of lys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of alpha-aminoadipate.</a> Genetics. 93, 51-65 (1979).</li>
<li>Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., La Thompson,, Hollis, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+counterselection+for+the+tryptophan+pathway+in+yeast%3A+5-fluoroanthranilic+acid+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance.</a> Yeast. 16 (6), Chichester, England. 553-560 (2000).</li>
<li>Singh, A., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+physiological+characterization+of+met15+mutants+of+Saccharomyces+cerevisiae%3A+a+selective+system+for+forward+and+reverse+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic and physiological characterization of met15 mutants of Saccharomyces cerevisiae: a selective system for forward and reverse mutations.</a> Genetics. 81, 75-97 (1975).</li>
<li>Singh, A., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+relationships+of+mercury+resistant+mutants+and+methionine+auxotrophs+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Characteristics and relationships of mercury resistant mutants and methionine auxotrophs of yeast.</a> Journal of Bacteriology. 118 (3), 911-918 (1974).</li>
<li>McCoy, S. L., Hausman, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+DNA+binding+to+cell-surfaces+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification of DNA binding to cell-surfaces by flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 241, 141-146 (2000).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc%2FSS-DNA%2FPEG+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11, 355-360 (1995).</li>
<li>Zhang, Z., Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+stability+in+recombinant+saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plasmid stability in recombinant saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 14 (4), 401-435 (1996).</li>
<li>Lorang, J. M., Tuori, R. P., Martinez, J. P., Sawyer, T. L., Redman, R. S., Rollins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+Fluorescent+Protein+Is+Lighting+Up+Fungal+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Green Fluorescent Protein Is Lighting Up Fungal Biology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).</li>
<li>Thompson, J. R., Register, E., Curotto, J., Kurtz, M., Kelly, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+the+preparation+of+yeast+cells+for+transformation+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation.</a> Yeast. 14, 565-571 (1998).</li>
<li>Damsch, S., Eichenbaum, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gavage-related+reflux+in+rats%3A+identification%2C+pathogenesis%2C+and+toxicological+implications+%28review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+pathology%22%5BJournal%5D)">Gavage-related reflux in rats: identification, pathogenesis, and toxicological implications (review).</a> Toxicologic pathology. 39, 348-360 (2011).</li>
<li>Desai, M., Labhasetwar, V., Amidon, G., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+uptake+of+biodegradable+nanoparticles%3A+effect+of+particle+size%5BTitle%5D)+AND+%22Pharma%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal uptake of biodegradable nanoparticles: effect of particle size.</a> Pharma. 13 (12), (1994).</li>
<li>Shakweh, M., Ponchel, G., Fattal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+uptake+by+Peyer%27s+patches%3A+a+pathway+for+drug+and+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+delivery%22%5BJournal%5D)">Particle uptake by Peyer's patches: a pathway for drug and vaccine delivery.</a> Expert opinion on drug delivery. 1 (1), (2004).</li>
<li>Szymanski, E. P., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+yeast+protein+extraction+and+purification+for+the+study+of+function%2C+interactions%2C+and+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (80), e50921(2013).</li>
<li>Hashimoto, S., Ogura, M., Aritomi, K., Hoshida, H., Nishizawa, Y., Akada, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Auxotrophic+Mutants+of+Diploid+Industrial+Yeast+Strains+after+UV+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Auxotrophic Mutants of Diploid Industrial Yeast Strains after UV Mutagenesis.</a> Applied and environmental microbiology. 71 (1), 312-319 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Birlikte, protokoller burada bağırsak heterolog terapötik protein teslimat için geliştirilmesi ve okzotrofik probiyotik maya suşları testi için gerekli temel adımları açıklar. Bu manipülasyon ve rekombinant probiyotik maya testi herhangi bir bireysel laboratuvar şu anda aşina olmayabilir hangi ile teknikleri ve kaynakları gerektirir. Çok sayıda daha önceki çalışmalar çok maya fare türü için de, yukarıda protokolleri açıklanmasına rağmen Böylece, bu yöntemler, yazarların bilgisi detaylı, birleşik bir şekilde sunulmamıştı...

Probiyotik olarak kullanılan mikroorganizmalar etkili ve ekonomik gastrointestinal heterolog proteinlerin teslim ilginç bir potansiyel araçlardır. Bu organizmalar, henüz 1 kolonize olmayan sindirim kanalından geçişini kalan kontrollü doz sağlayan ve uyuşturucu dile maruz kalma sınırlama yeteneğine sahiptirler. Ayrıca, kolay büyük ölçekte heterolog protein üretmek için bu organizmaların mühendislik becerisi olanağına sentetik dağıtım parçacıkları ekonomik bir alternatif oluşturur. En son 2 boulardii&#39;nin probiyotik maya Saccharomyces Okzotrofik suşu kullanılarak ortaya Ancak, böyle bir yaklaşım geliştirilmesi, maya ve moleküler biyoloji hayvanlara yönelik teknikler ve immünolojik yöntemler kadar geleneksel olarak, belirli bir çalışma içinde birleştirilmemiş laboratuvar teknikleri, bilgi gerektirir. Burada tarif edilen bireysel işlemler kendilerini yeni değildir Böylece rağmenLaboratuar protokolleri, bu yazının amacı sıçangil gastrointestinal ilaç verme araçları olarak probiyotik maya deneysel test için gerekli tekniklere birleşik giriş sunmaktır. Sağlanan için gerekli protokollerin bir derleme: kolayca genetik manipüle edilebilir maya auxotrophic mutant suşlar 1) nesil; maya kültürlerinin 2) dönüşümü, heterolog proteini ifade etmek üzere; oral gavaj yoluyla bağırsak rekombinant maya 3) uygulama; onların heterolog protein ifade kemirgen bağırsak ve değerlendirme gelen canlı rekombinant probiyotik maya ve 4) kurtarma. Çok sayıda pozitif ve negatif seçim yöntemleri maya türleri manipülasyonu için mevcut olmakla beraber İlk olarak, bu tür Okzotrofik işaretleyiciler kullanılarak negatif seçim etkinliği ve maya dönüştürülmüş ve seçilebilir kolaylığına artırmaktadır. co antibiyotik kullanan transformantların pozitif seçimi,ntrast önemli ölçüde maya manipülasyon maliyetini arttırır. Ayrıca, antibiyotik içeren katı ortam üzerinde maya seçimi üzerinden sentetik damla katı ortam (yayınlanmamış gözlemler) hakkında oksotropik maya seçimine göre dönüştürülmemiş arka kolonilerin artan büyümesi için izin verir. Okzotrofik maya temel amino asitler ya da urasil sentezi için önemli enzimler eksikliği olan suşlarıdır. maya temel metaboliti yoksun medya üzerinden sentetik damla üzerine kaplama olduğunda böylece negatif seçim sağlayarak, eksik metaboliti veya metabolik geni ile takviye Böyle maya sadece büyüyebilir. Bir çok yaygın olarak kullanılan Saccharomyces cerevisiae laboratuar soyları önce aslında oksotropik mutantları 3 bulunmaktadır. Endüstriyel, klinik ve probiyotik maya suşları, ancak, tipik olarak tüm gerekli besinleri sentez yeteneği ile prototropik bulunmaktadır. Bu tür maya daha etkili genetik olarak işlenmesine olanak sağlamak için, oksotrofik genler seçici hedeflenebilirantibiyotiksiz seçilebilir suşlarını meydana getirmek üzere. 6 - okzotrofik işaretleyici gen spesifik hedefleme CRISPR / Cas9 4 hedefleme ile daha yakın homolog rekombinasyon veya dayanarak PCR aracılı gen bozulması ile elde edilebilir. Alternatif olarak, UV mutagenez hızla hatta 7 teknik olarak zordur birden fazla plazmid ile hangi dönüşüm için maya suşları auxotrophic mutantlar üretebilir. PCR hedefleme ve CRISPR / Cas9 başka yerlerde tarif edilmiş olmakla beraber, bu yazının bir negatif seçim yerine Maya transformantlarının pozitif antibiyotik seçimi için sağlayacak oksotropik türleri oluşturmak için, UV mutagenez yaklaşımı anlatan detaylı bir protokoldür bölümünde sunulmuştur. Heterolog bir proteinin oral yoldan uygulanması için böyle bir oksotrofik suşların kullanımı aşağıdaki gerekli bir aşama plazmid DNA ile maya dönüşümdür. evetler ilk başarılı dönüşümü yana1978 8 Saccharomyces cerevisiae için bildirilen t sferoplastlar, çok sayıda değişiklik verimliliğini artırmak ve maya genetik olarak modifiye edilebilir kolaylığına karakterize edilmiştir. S. DNA&#39;nın başarılı transformasyonu için elektroporasyon kullanımı cerevisiae 1985 9&#39;da tarif edilmiştir ve o zamandan beri ozmotik destek hücreleri 10-1 M sorbitol kuluçkalama eklenerek geliştirilmiştir. Elektroporasyon verimi, ayrıca maya türleri ve şekil, hücre sayısı ve büyüme fazı elektroporasyon hacmi, alan şiddeti, ve spesifik tamponlar 11 bağlıdır gösterilmiştir. Özel bir ekipman gerektirir esas olarak Ito ve ark., 12 tarafından tarif edilen lityum asetat (LiOAc) dönüşümü, en yaygın olarak kullanılan transformasyon protokolleri arasında yer almaktadır. İlave analizler, hücreler mid-log fazında toplandığı zaman LiOAc maya dönüşüm verimliliği büyük ölçüde arttırdığını göstermiştirbüyüme ve ısı 42 ° C ve 12 polietilen glikol (PEG) ve DNA&#39;nın mevcudiyetinde şok. PEG ile bütün dokunulmamış maya inkübasyonu muhtemelen hücre membranına DNA eki geliştirerek ve zar 13 diğer etkileri ile, etkin bir dönüşüm için gereklidir. Lityum kendisi de sağlam hücreler 14 geçirgenliğini arttırır. En laboratuvar S. rağmen cerevisiae suşları kolay LiOAc dönüşüm 3 kullanılarak transforme edilebilir, diğer maya türleri daha etkili bir şekilde bir alternatif protokoller kullanılarak transforme edilebilir. Pichia pastoris, örneğin, en verimli şekilde dönüştürülmüş yerine LiOAc dönüşüm 13 kıyasla- elektroporasyon üzerinden gerçekleştirilir. Bu önemlidir, bu nedenle, çok sayıda test genetik bir uncharacterized maya suşu değiştirmeye çalışırken ve dönüşüm yöntemleri kuluçka dönemleri ve reaktif konsantrasyonları optimize etmek. Bu el yazması, böylece LiOAc tr hem açıklaroksotropik mutan ve vahşi tipli S. transformasyonu için teknikleri ansformation ve elektroporasyon boulardii. İlgilenen okuyucular maya dönüşüm, alternatif protokoller ve eylem 13,15 olası mekanizmaların daha tartışmaların evrim kapsamlı açıklamaları için son değerlendirme yönlendirilir. Plazmid kolaylıkla fark edilebilir bir proteini kodlayan maya transformasyonu uygun bir ifade ile heterolog protein işlevini sağlamak üzere alt test için, ayrıca gereklidir. Sayısız farklı proteinler terapötik çalışma nihai amaç ve immunoblotting, ELISA ve diğer teknikler ile protein tespiti için kullanılabilir antikorlar olarak seçilebilir. Bu teknikler için protokoller iyice başka 16,17 tarif edilmiştir, ve standart eğri ile karşılaştırma ile dönüştürülmüş maya heterolog protein üretimi seviyesini tespit etmek için kullanılabilir. amaçlarla gösteri ve göstermek içinMaya biyolojide çok yaygın olarak kullanılan protein başarılı üretim bu Eser floresan mikroskobu kullanılarak takip eden şekilde tespit eder plazmid kodlayan yeşil floresan proteini (GFP) ile dönüşüm gösterir. Üçüncü ve dördüncü de tarif edildiği gibi bir heterolog protein, uygun bir şekilde yönetilmesini ve gastrointestinal dokularda bu mikroorganizmaların tespit edilmesi, ifade probiyotik organizmalar üretimine kadar önemli bir. Oral gavaj yoluyla rekombinant maya uygulanması doğrudan C57BL / 6 fareleri, doğal olarak 18 kusma aciz olan mide içine maya kontrollü miktarların verilmesi için izin verir. Ancak, yanlış bir hayvan taşıma ve sonda özofagus hasarı ve perforasyon, mide delinmesi, trakea idaresi ve aspirasyon pnömonisi 19,20 yol açabilir. Kötü tekniği ve deneyimsizliği ayrıca fare bağışıklık tepkilerinin ve deneysel resu değişkenliği artırabiliroral sonda 21,22 üzerine hayvan strese atfedilen lt. Uygun teknikle Uygulama böylece sadece hayvan rahatsızlık zayıflatabilir, ama aynı zamanda deneysel sonuçların doğruluğunu artırabilir. Bu yazıda tarif ve rekombinant maya kontrollü dozlarda tatbikat için hayvanlara yönelik ve bir mide sondası gösterir. Son olarak, maya ve heterolog proteinin varlığı için lenfoid dokular analiz ederek yeniden birleştirici maya başarılı bir şekilde iletilmesini teyit etmek için hayati önem taşımaktadır. En kolay ve tahmin maya varlığı için incelenebilir mide-immün doku Peyer yamaları. Peyer yamaları mukozal immün yanıt indüksiyon 23 anahtar siteleri ince bağırsakta boyunca ikincil lenfoid organlardır. lümenden antijenler microfold yoluyla transcellularly epitelde (M) hücre aktarılır ve içine maruz bırakılması ve böylece, Peyer yamaları salınırsunan hücrelerin D antijen lümen içeriği intestinal. Bağırsak epiteli üzerinde parçacık alımı da goblet hücreleri tarafından elde edilebilir, ancak bu hücrelerin yalnızca sürebilir parçacıkların çapı 24 daha az 0.02 um gösterilmiştir. Transepithelial dendritler CD103 + dendritik hücrelerin (DC) de 25 lümen intestinal küçük parçacıkları almak uzanan; Ancak, CD103 + DC&#39;ler bakteri daha büyük parçacıkları sürebilir gösteren herhangi bir rapor bulunamamıştır. Böylece bütün probiyotik maya, çapı 3-6 mm arasında ortalama boyutu, E hücreleri tarafından alınır ve Peyer yamaları aktarılacak muhtemeldir. Burada tarif edilen bu prosedür, aynı zamanda kolayca probiyotik bakteri alımını değerlendirmek için adapte edilebilir, ancak, toplama ve uygun bir yeniden birleştirici maya için Peyer yamaları elenmesi için bir protokoldür. Özet olarak, verilmesi için rekombinant probiyotik maya değerlendirmekbağırsak tetkik, tedavi proteinler, hayvan taşıma ve immünoloji moleküler biyoloji kapsayan laboratuvar teknikleri ustalığı gerektirir. 1 burada sunulmuştur protokolleri) kolay olumsuz antibiyotiksiz seçilebilir üretimi ve oksotropik maya suşunun taranması, 2), alternatif protokoller maya dönüşümü ve heterolog protein ekspresyonunu sağlamak için, 3), uygun hayvansal işleme teknikleri ve oral gavaj gösteriler rekombinant maya mide teslimat ve Peyer diseksiyon için 4) protokolleri ve yaşayabilir rekombinant maya ve fonksiyonel heterolog protein için tarama. Birlikte, bu protokoller üretimi ve mide bağırsak heterolog terapötik proteini sunma yeteneğine sahip bir probiyotik maya suşunun denemeden geçirilmesine izin verecektir.

<table><tbody><tr><td>SmartSpec 3000 Spektrofotometre</td><td>BioRad</td><td>170-2501</td><td>Maya kültürlerinin hücre konsantrasyonunu ve OD600'ini belirlemek için spektrofotometre örneği</td></tr><tr><td>New Brunswick Makaralı Tambur</td><td>Eppendorf</td><td>M1053-4004</td><td>Maya kültürü inkübasyonu için makaralı tambur örneği</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075-03</td><td>Örnek stratalinker</td></tr><tr><td>Stuart Koloni Sayacı SC6PLUS</td><td>11983044</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>Plaka standı, büyütme kayıtları, kalem Scienceware Koloni Sayacından gelen basıncı algıladığında koloni sayımı</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>F378620002</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>El tipi koloni sayaç kalemi</td></tr><tr><td>Replika kaplama cihazı</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-1</td><td>Replika kaplama standı ve pedleri örneği&nbsp;</td></tr><tr><td>Kadife kareler</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-2</td><td></td></tr><tr><td>L şekilli steril hücre yayıcılar&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>14665230</td><td></td></tr><tr><td>Deoksiribonükleik asit, somon testislerinden tek sarmallı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656-1ML</td><td>Maya LiOAc dönüşümü için örnek taşıyıcı DNA</td></tr><tr><td>Gavaj iğneleri</td><td>Braintree Scientific</td><td>N-PK&nbsp; 002</td><td>15-20 g fareler için önerilen iğne 22 gauge (1.25 mm top), 1 inç uzun, düz yeniden kullanılabilir gavaj iğnesidir. 20&nbsp'den daha ağır fareler için; g, 20 gauge veya daha büyük düz veya kavisli gavaj iğneleri kullanılabilir</td></tr><tr><td>1 ml steril kayar uçlu tek kullanımlık tüberkülin şırıngası</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 309659</td><td></td></tr><tr><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri gibi künt forseps 7" (178 mm) tırtıklı uç, geniş kavrama forseps</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>77937-28</td><td>Diseksiyon için gerekli künt forseps örneği&nbsp;</td></tr><tr><td>Düz ve kavisli diseksiyon makası</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>72966-02 ve 72966-03</td><td>Diseksiyon için gerekli makas örnekleri</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life teknolojileri</td><td>12440053</td><td></td></tr></tbody></table>

farelerde oral sonda ardından probiyotik maya dönüşümü ve gastrointestinal bağışıklık dokular onların kurtarma

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Rekombinant oral tedavinin geliştirilmesi, mukozal bağışıklık sisteminin daha doğrudan hedeflenmesine izin verecek ve gastrointestinal bozukluklarla mücadele yeteneğini geliştirecektir. Probiyotik mayanın özellikle bu yaklaşım için uyarlanması çeşitli avantajlar taşır. Bu suşlar sadece çok çeşitli karmaşık heterolog proteinleri sentezleme potansiyeline sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda bağırsaktan geçiş sırasında bu proteinlerde hayatta kalma ve koruma yeteneğine de sahiptir. Bununla birlikte, kritik olarak, bu yaklaşım, tipik olarak birlikte kullanılmayan birçok farklı laboratuvar tekniğinde uzmanlık gerektirir. Ayrıca, maya transformasyonu için bireysel protokoller yaygın olarak kullanılan laboratuvar suşları için iyi karakterize edilmiş olsa da, burada alternatif yaklaşımlara ve daha az iyi karakterize edilmiş probiyotik suşlar için dönüşümü optimize etmenin önemine vurgu yapılmaktadır. Bu yöntemlerin detaylandırılması, probiyotik mayanın oral ilaç dağıtım araçları olarak test edilmesi için en iyi yaklaşımların tartışılmasını kolaylaştırmaya yardımcı olacak ve gerçekten de gastrointestinal tedavi için bu yeni stratejinin geliştirilmesini ilerletmeye hizmet edecektir.

UV ışınlaması, aşağıdaki hayatta kalma eğrisi oluşturacak şekilde farklı koloni oluşturan birim (CFU) oluşturabildiği şekilde seyreltildi maya hücrelerinin kaplama gerektirir. Yukarıda açıklandığı gibi toplanan her 500 ul numune yaklaşık 5 x 10 6 hücre ihtiva eder; Bununla birlikte, plaka başına 100&#39;den büyük koloniler doğru ayırt etmek zordur. Seyreltilmemiş örnek yanı sıra ışınlanmış hücrelerin seri 01:10 dilüsyonları böylece Şekil 1&#39;de gösterildiği ...

Geliştirmek dönüşümü, yönetmek ve probiyotik maya Saccharomyces boulardii heterolog protein ifadesini test etmek için kullanılabilecek tekniklerin birleşik bir açıklama burada sunulmuştur.

Farelerde oral sonda ardından Probiyotik Maya Dönüşümü ve Gastrointestinal Bağışıklık Dokular Onların Kurtarma

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Bu prosedürlerin genel amacı, heterolog protein eksprese edebilen ve bunu fare gastrointestinal sistemine iletebilen, kolayca transforme edilebilir bir probiyotik maya suşu geliştirmektir. Bu tekniklerin temel avantajı, probiyotik mayanın oksitrofik suşlarının hızlı bir şekilde üretilmesine olanak tanımalarıdır. Bu mutant mayalar, daha sonra antibiyotik seçimine güvenmeden genetik olarak manipüle edilebilir.Farelere oral gavaj yapılması ve Peyer plaklarının hasat edilmesi, mutant mayaların gastrointestinal immün dokulara tutunmasının doğrulanmasına da olanak tanır. Bu yöntemler, oral aşılama alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olacak ve gastrointestinal terapötiklerin iletimi için probiyotiklerin test edildiği deneyleri kolaylaştıracaktır. YPD besiyeri hazırlandıktan ve mayalar doygunluğa ulaşana kadar gece boyunca büyütüldükten sonra, hücreleri plastik bir küvette su ile bire on oranında seyreltin.Ardından, bir spektrofotometreyi sıfırlayın ve gece boyu inkübe edilen kültürün optik yoğunluğunu belirleyin. 20 mililitre steril distile su kullanarak, hücreleri mililitre başına 10⁷ konsantrasyona seyreltin. Daha sonra, seyreltilmiş hücreleri steril plastik bir petri kab

transformation-probiotic-yeast-their-recovery-from-gastrointestinal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, kolon iltihabı olan interlökin-10 eksikliği olan bir farede dışkı mikrobiyotası nakli prosedürünü göstermektedir. Bağırsaktaki kolonize dışkı mikropları ikincil metabolitleri serbest bırakarak anti-inflamatuar sitokin salınımını ortaya çıkarır ve kolon iltihabını azaltır.

İnterlökin-10 Eksikliği Olan Bir Farede Fekal Mikrobiyota Transplantasyonunun Etkilerinin Değerlendirilmesi

Bu video, dönüştürülmüş maya hücrelerinin bir fare modeline oral yoldan uygulanmasını göstermektedir. Dönüştürülmüş maya hücreleri, farenin midesine ulaşan bir gavaj tekniği kullanılarak oral yoldan uygulanır. Daha sonra, hücreler ince bağırsağa göç eder, burada mikro kıvrım hücreleri onları yutar ve Peyer yamalarına transferlerini kolaylaştırır ve bağırsak bağışıklık sistemine erişim sağlar.

Dönüştürülmüş Maya Hücrelerinin Fare Bağırsak Bağışıklık Sistemine Oral Verilmesi

Burada biz ayrıntılı iletişim kuralları antibiyotik sözlü yönetimi için fareler, dışkı örnekleri, DNA ekstraksiyon ve miktar dışkı bakteri topluluğu tarafından qPCR sağlar.

Oral antibiyotik tedavisinden sonra fare bağırsak Microbiota nicel polimeraz zincir reaksiyonu tabanlı analiz

Bu çalışmada yenidoğan fareler için Probiyotikler gavaging kesin miktarda işlem ayrıntıları. Deneysel ayarı içerecek şekilde optimize edildi ama dozaj, yönetim yöntemleri ve bakterilerin bağırsak quantification probiyotik sınırlı değildir.

Probiyotik çalışmalar yenidoğan farelerde sonda ile besleme kullanarak

Biz fonksiyonel bir insan bağışıklık sistemi ve istikrarlı bir engrafted insan benzeri bağırsak mikrobiyomu özelliği çift insanlaşmış BLT-fareler üretmek için yeni bir yöntem açıklar. Bu protokol mikropsuz fareler veya gnotobiyotik tesisler için gerek kalmadan takip edilebilir.

A Double Humanized BLT-fareler Modeli Kararlı Bir İnsan-Benzeri Gut Mikrobiyom ve İnsan Bağışıklık Sistemi featuring

Bu protokolün amacı Memeli gastrointestinal sistemde Candida albicans hücre şekli ve lokalizasyonu görselleştirmektir.

Situ Hibridizasyonfloresan Kullanarak Murine Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Görselleştirilmesi

Genetik duyarlılık, mukozal bağışıklık ve intestinal mikroekolojik ortamın etkileşimi, inflamatuar barsak hastalığının (İBH) patogenezinde rol oynar. Bu çalışmada, IL-10 eksikliği olan farelere fekal mikrobiyota transplantasyonu uygulanmış ve kolonik inflamasyon ve kalp fonksiyonu üzerine etkisi araştırılmıştır.

Fekal Mikrobiyota Transplantasyonunun İnterlökin 10 Eksikliği Olan Fare Modelinde Terapötik Değerlendirmesi

Burada, Bacillus cereus'un kolit üzerindeki olumlu etkilerini düzenlemede bağırsak mikrobiyotasının rolünü araştırmak için antibiyotik kaynaklı yalancı mikrop içermeyen dekstran sülfat sodyum kaynaklı kolit fare modelini oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Bacillus cereus Uygulamasının Kolit Üzerindeki Hafifletici Etkilerinin Bağırsak Mikrobiyota Modülasyonu ile Araştırılması

Bakterileri enfekte eden virüsler olan bakteriyofajlar (fajlar), bağırsak mikrobiyomunun ayrılmaz bir bileşenidir. Bu simbiyotik sakinler bakteriyel zindeliği ve popülasyon dinamiklerini yönlendirse de, bağırsak homeostazını ve hastalığını nasıl etkiledikleri hakkında çok az şey anlaşılmıştır. Bu protokol, diğer faj-bakteri çiftlerine uyarlanabilen bir fare modeli içinde izole edilmiş T4 fajlarını inceler.

Murin Bağırsağında T4 Bakteriyofaj ve E. coli Etkileşimi: İn Vivo Konak-Bakteriyofaj Dinamiğini İncelemek İçin Prototipik Bir Model

Bu protokol, steril koşulları korurken deneysel tek kafesli izolatörlere (izokafesler) mikropsuz fare transferi ve muhafazası için en iyi uygulamaları açıklar. Mikropsuz farelere dışkı nakli yöntemleri ve daha ileri uygulamalar için bu bağırsak "insanlaştırılmış" farelerden canlı bakterilerin toplanması tartışılmaktadır.

Mikropsuz Farelere İnsan Dışkı Nakli için Biyodışlama İzoPozitif Kafes Deneyinin Hazırlanması ve Sürdürülmesi

Keşfedin Saccharomyces boulardii probiyotik mayasında oksotrofik mutant suş geliştirme ve fare gastrointestinal dokularına yapışma analizi yöntemleri. Bu teknikler oral aşılama araştırmalarını destekler.

Farelerde oral sonda ardından Probiyotik Maya Dönüşümü ve Gastrointestinal Bağışıklık Dokular Onların Kurtarma

Daha fazla video keşfet