Name: Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Öğrenin, canlı zebra balığı embriyolarında mitokondri ve sentrozom gibi hücre alt yapılarının dinamiklerini görüntülemeyi. Bu yöntem, sinir hücresi biyolojisi ve hastalık modellerinde invivo çalışmalar için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

P.E., Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Araştırma Eğitim Grubu 1373 ve Münih Teknik Üniversitesi Enstitüsü (TUM-GS) tarafından desteklenmektedir. G.P., TUM-GS tarafından desteklenmiştir. L.T. BIR EMBO bursu tarafından desteklenmektedir (EMBO ALTF 108-2013). D.P.'nin zebra balığı üzerindeki çalışması, Sonderforschungsbereich "Nörodejenerasyonun Moleküler Mekanizmaları" (SFB 596) aracılığıyla DFG tarafından desteklendi; Entegre Protein Bilimleri Merkezi (Münih) ve Avrupa Topluluğu'nun Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) 200611 no'lu Hibe sözleşmesi (MEMOSAD) kapsamında. Halen New York Kök Hücre Vakfı-Druckenmiller Üyesidir ve Alman Bilimler Akademisi Leopoldina'dan bir burs tarafından desteklenmiştir. L.G., SFB 870 "Nöronal Devrelerin Montajı ve İşlevi", Proje A11 aracılığıyla DFG'den sağlanan finansmanla desteklenmektedir. 
Balık tesisimizi koruduğu için Kristina Wullimann'a, teknik destek için Yvonne Hufnagel'e ve el yazması hakkındaki yorumları için Thomas Misgeld'e minnettarız. M1 Medusa vektörünü (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP) sağladığı için R. Köster'e (Technische Universität Braunschweig) Centrin-YFP'yi sağladığı için ve S.C. Suzuki'ye ve T. Yoshimatsu'ya (Washington Üniversitesi) CentrinFish'i yapmak için muhabir yapısını oluşturmak için kullandığımız 14xUAS:MA-cerulean kasetini sağladıkları için minnettarız. Otx2:Gal4 transgenik hattı için S.C. Suzuki ve T. Yoshimatsu'ya (Washington Üniversitesi), Sensory:Gal4-VP16 yapısı (UCLA) için A. Sagasti'ye ve pCold Heart Tol2 vektörü için M. Nonet'e (St. Louis'deki Washington Üniversitesi) teşekkür ederiz. MitoFish'in geliştirilmesine katkıda bulundukları için Bettina Schmid, Alexander Hruscha ve Christian Haass'a (Alman Nörodejeneratif Hastalıklar Merkezi Münih - DZNE) teşekkür ederiz.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada, floresan etiket mitokondri, sentrozom ve zebra balığı embriyoların in vivo spesifik hücre tiplerinin hücre zarlarına Gal4 UAS sentezleme sisteminin kullanışlılığını göstermiştir. Diğer, organellerin veya hücre içi yapıları etiket çoğu halojen füzyon proteinleri literatürde bulunabilir ve ilgili laboratuarda, ticari kaynaklardan veya ticari olmayan plazmid tevdi (ör Addgene) elde edilebilir. Yeni bir flüoresan füzyon proteinini tasarlamak için birçok parametre AP kullanılacak ve ilgi konusu prot...

In vivo görüntüleme en fizyolojik bağlamda hücresel davranışları doğrudan görselleştirme sağlar. Zebra balığı embriyolarının, onların hızlı ve dış gelişme ve floresan etiketleme izin genetik araçları zengin bir dizi şeffaflık tüm anahtar gelişimsel olayların dinamiklerini aydınlatmak için in vivo mikroskopi artan kullanımına katkıda bulunmuştur. Zebra balığı sinir sistemi gelişiminin görüntüleme çalışmaları, örneğin büyük ölçüde nöral progenitör hücrelerin davranışları ve sonraki göç, farklılaşma ve devre entegrasyonu 1-8 da dahil olmak üzere kendi döl kader bilgimizi genişletti var. Sahne şimdi bu hücresel davranışları altında yatan hücre içi dinamiğini incelemek için ayarlanır. Nitekim, Zebra balığı zaten in vivo hücre biyolojisi araçları olarak istismar ediliyor. Golgi 15, mitokondri 9-11 görselleştirmek için artık mümkün 2,8,12-14 sentrozomMikrotübül 4 ve aktin 16 hücre iskeleti, 17 endozom-lann ve in vivo Zebra balığı embriyolarının diğer hücre içi yapılar arasında, 1,18 apikal membran komponentleri karmaşık. Şimdiye kadar, bu organellerin işlevi hakkında bilinenlerin çok kültürlü hücrelerde davranışlarını inceleyerek geliyor. In vitro çalışmalar, hücre biyolojisi içine muazzam bir fikir vermiştir ederken, kültür hücreleri tamamen in vivo durumun karmaşıklığını temsil etmemektedir ve bu nedenle zorunlu olarak işlev ve in vivo hücre içi organellerin dinamiklerini yansıtmak zorunda değildir. Zebra balığı embriyolar hücre içi dinamikleri incelenerek in vivo alternatif olarak uygulanabilir bir teklif. Omurgalılar olarak, zebra balığı, memeli türlerde bulunan kişilerce homolog olan bir çok organ sistemini (örneğin, nöral retinanın) sahiptirler. Ayrıca, Zebra balığı embriyolar giderek insan hastalıkları 19,20 modellemek için kullanılmaktadır </syukarı&gt;, centrosomal fonksiyonu (örneğin, mikrosefali 21 ve Leber&#39;in konjenital amarozu 22) ve mitokondriyal fonksiyon (örneğin, Parkinson hastalığı 23, 10,24 ve Barth sendromu 25 tauopatıler) ile ilgili olanlar da dahil olmak üzere. hücresel ve hücre içi düzeyde in vivo görüntüleme bu durumlarda bu patolojik durumları altında yatan hücre biyolojisi daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. Burada anlatılan yöntemlerin genel amacı in vivo ışık mikroskobu kullanarak Zebra balığı embriyolarının içinde organelleri ve diğer hücre içi yapıları araştırmak için kapsamlı bir rehber sunmaktır. In vivo hücre içi yapıları görselleştirme ve izleme dahil tüm iş akışı açıklanmıştır - genetik etiketleme yaklaşımlarından, geçici üreten ifade ve istikrarlı transgenik balık, ve nihayet geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenmesi için. Bu yordam, her daedures sayıda zebrabalıkları laboratuvarlar tarafından kullanılır, açıklanan protokoller optimize edilmiş ve hücre içi yapıların dinamiklerini araştırmak için aerodinamik vardır. Burada açıklanan çalışmanın iki özel yönleri söz eder: İlk olarak, spesifik hücre tiplerinde genetik etiket organellere çoklu yapılandırmalarda Gal4 UAS sentezleme sisteminin kullanılması. İkinci olarak, in vivo görüntü hücre içi yapılara geniş alan ve konfokal mikroskopi doğrudan karşılaştırılması. Zebra balığı genetik etiket organellerin ve diğer hücre içi yapılara güncel yaklaşımlar ya yapmak promotör elemanları doğrudan füzyon proteinleri 9,14,15. In vitro transkripsiyonu şapkalı RNA sonuçları ifadesini tahrik başlıklı mRNA 1,4,8 veya DNA bazlı yapıların kullanımı hızlı ve geniş anlatım, o ancak doku-spesifik değildir. başlıklı RNA seyreltilmiş veya düşer Buna ek olarak, ifade seviyeleri zamanla azalır. RNA Böylece kullanım bazlı(Post-gübreleme genellikle en fazla 3 gün) gelişiminde daha sonraki aşamalarında organel dinamikleri sınırlı incelemek için oluşturur. Bu sınırlamalar ifade mekansal ve zamansal kontrolünün spesifik promotör unsurlar tarafından belirlenir, DNA konstruktları kullanılarak aşılabilir. DNA bazlı yapılar transgen sentezleme seviyelerine Gal4 UAS sistemi önemli gelişmeler bağlamında kullanıldığı zaman 26,27 görülmektedir. raportör genler Gal4-bağlanma yukarı aktivasyon sırasının (UAS) akış aşağısında klonlanmış ise, bu iki parçalı sentezleme sisteminde, hücre tipi özel promotör elemanları, bir transkripsiyonel aktivatör Gal4 ekspresyonunu tahrik. Uygun Gal4 sürücüleri UAS muhabir birleştirerek, ifadesi farklı promoterler arkasında belirli bir ifade şablonu, istenen her zaman haberci genlerin klonlanması için ihtiyaç engellemeyi, spesifik hücre tipleri ile sınırlı olabilir. Ayrıca, birden fazla UAS haberci genlerin ekspresyonu olabilirTek bir Gal4 aktivatörü ile tahrik. Gal4 UAS sistemi böylece hücre içi etiketleme için çok yönlü ve esnek genetik bir yaklaşım sağlar. Geniş alan ve konfokal mikroskoplar çoğu laboratuarların workhorses. Geniş alan sistemleri, tipik olarak bir ışık kaynağı olarak bir ark lambası kullanmak ve hafif yolunun sonuna yerleştirilir hassas bir kamera ile yayılan ışığı algılar. dışı odaklanan ışık kalın örneklerde bir odak bilgi gizler gibi bu görüntüleme yöntemi, tipik olarak, ince numune ile sınırlıdır. Konfokal mikroskoplar bunların odak (yani, &quot;optik kesit&quot;) 28 üzerinden köken olanlar üzerinde odak düzlemi kaynaklanan sinyalleri lehine inşa edilir ki geniş alan sistemlerden farklıdır. optik olarak kısımlara elde etmek için, bir iğne deliği nokta ışık kaynağı için bir konjügat pozisyonda emisyonu yolu yerleştirilir. Lazer ışığı kaynakları olarak kullanılmaktadır ve sinyal foto-çoklayıcı tup (PMT) ile tespit edilir. Pratik olarak, bir lazerkiriş numune üzerinde nokta-nokta ve her nokta (piksel) floresan emisyon PMT tarafından tespit edilir kaydırılan. Burada görüntü hem mikroskopi yöntemleri doğrudan bir karşılaştırma sağlamak için geniş alan ve konfokal mikroskopi her ikisini de kullanarak zebrafish embriyolar yaşayan aynı hücre içi yapılar. Bu tür karşılaştırmalar sağlama temel amacı, eldeki belirli bir soru için en uygun mikroskopi tekniği seçimi için kurallar sunmaktır. mitokondri ve sentrozom Gal4 UAS tabanlı genetik etiketleme gösteren Burada anlatılan yaklaşımları kullanarak. Bu organeller her görüntüleme yönteminin uygunluğunu göstermek için geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanılarak sinir sistemi ve kas hücrelerinde farklı hücre tipleri içinde görüntülenmiş. Burada açıklanan yöntemler kolayca yaşayan zebrafish embriyo diğer organelleri ve hücre içi yapıları araştırmak için adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Agaroz (2-hidroksietilagaroz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4018-10G</td><td>Düşük jelleşme sıcaklığı Tip VII</td></tr><tr><td>Blok ısıtıcı</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Thermomixer kompakt</td></tr><tr><td>Ca (NO3) 2 Kalsiyum nitrat hidrat,% 99.996 & nbsp;</td><td>Aldrich</td><td>202967-50g</td><td>30x Danieau'nun</td></tr><tr><td>CCD kamerasını</td> hazırlamak için <td>Qimaging</td><td>Retiga Exi Fast 1394</td><td></td></tr><tr><td>Seramik Kaplı Dumont #5 Forseps</td><td>Dumont - Güzel Bilim Araçları</td><td>11252-50#</td><td>5 Forseps</td></tr><tr><td>Konfokal lazer tarama mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>FV1000 Fluoview</td><td></td></tr><tr><td>Kültür bulaşık ısıtıcısı</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>DH-35</td><td>Isıtma halkası</td></tr><tr><td>Etil 3-aminobenzoat metansülfat tuzu</td><td>PharmaQ</td><td>Tricaine PharmaQ-25g</td><td>Trikain (anestezik)</td></tr> <tr><td>Floresan diseksiyon mikroskobu</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>GeneClean kiti</td><td>MP Biyomedikal</td><td>111001200</td><td></td></tr><tr><td>Cam Alt Kültür Tabakları</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td>35 mm petri kabı, 14 mm mikro kuyu, No. 0 kapak camı</td></tr><tr><td>Cam iğneler</td><td>Dünya Hassas Aletler A.Ş. &nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>Mikroenjeksiyonlar için</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-250g</td><td>30x Danieau'nun</td></tr><tr><td>Yüksek vakumlu yağını</td> hazırlamak için <td>Dow Corning&nbsp;</td><td>DCC000001242 150g</td><td>Silikon dioksit gresi</td></tr><tr><td>KCl %99</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S7643-5kg</td><td>30x Danieau'nun MgSO'sunu hazırlamak için</td></tr><<tr><td>sub>4.7H2O &nbsp; &nbsp; Magnezyum sülfat heptahidrat %98+ ACS reaktifi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230291-500g</td><td>30x Danieau'nun Mikroenjektörünü hazırlamak için</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>FemtoJet</td></tr><tr><td>Mikro Yükleyici uçları</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>0.5-20 ul</td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Maerzhaeuser Wetzlar</td><td>MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet tutucu</td><td>Intracel</td><td>P/N 50-00XX-130-1</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transkripsiyon Kiti</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>PCS-Transpozazı yazıya dökmek için</td></tr><tr><td>NaCl BioXtra >%99,5</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1kg</td><td>30x Danieau'nun</td></tr><tr><td>Nanofotometresini</td><td></td><td></td> hazırlamak <td>için DNA/RNA konsantrasyonunu ölçmek için</td></tr><tr><td>İğne çektirme</td><td>Sutter Aleti</td><td>P-1000</td><td>Alevli/Kahverengi</td></tr><tr><td>NIR Apo 40x/0.80W&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>Su daldırma konisi objektifi</td></tr><tr><td>N-Feniltiüre Sınıf I, yaklaşık% 98</td> <td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td>PTU (pigmentasyonu önler)</td></tr> <tr><td>Petri kapları</td><td>Sarstedt AG&nbsp;</td><td>821472</td><td>92 x 16mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Plastik kalıplar&nbsp;</td><td>Uyarlanabilir Bilim Araçları</td><td>TU-1</td><td>Mikroenjeksiyonlar için</td></tr><tr><td>Delikli pleksiglas kapak</td><td>Özel yapım</td><td></td><td>Pleksiglas kapaktaki delik, su daldırma konisinin çapından 3 mm daha büyük olmalıdır. Hedef</td></tr><tr><td>Çay süzgeci (Plastik)</td><td></td><td></td><td>Zebra balığı yumurtalarını toplamak için</td></tr><tr><td>Sıcaklık kontrolörü</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>TC-344B</td><td>Çift Otomatik Sıcaklık Kontrolör</td></tr><tr><td>Transfer pipetleri</td><td>Sarstedt AG&nbsp;</td><td>86.1171</td><td>3.5mL plastik transfer pipetleri</td></tr><tr><td>UMPlanFI 100x/1.00W</td><td>Olympus</td><td></td><td>Su daldırma konisi objektifi</td></tr><tr><td>UMPlanFLN 20x/0.50W&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Su daldırma konisi objektifi</td></tr><tr><td>Geniş alan mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>PTU (50x Stok)</td><td></td><td></td><td>76 mg PTU'yu 50 ml damıtılmış suda çözün Oda sıcaklığında kuvvetlice karıştırın&nbsp; -20 oC'de 1 ml alikot 1x çalışma solüsyonunda kullanın</td></tr><tr><td>Trikain (20x Stok)200</td><td></td><td></td> <td>mg Trikaini 48 ml damıtılmış suda çözün 2 ml 1M Tris bazı (pH9) ekleyin pH 7&nbsp'ye ayarlayın; -20 oC'de 1 ml alikot 1x çalışma çözümünde kullanın</td></tr><tr><td>Danieau'nun Çözümü (30x Stok)</td><td></td><td></td><td>1.740 mM&nbsp; NaCl&nbsp; 21 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; KCl&nbsp; 12 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; MgSO<alt>4</alt>.7H<alt>2</alt>O&nbsp; 18 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Ca (NO3)2 150 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; HEPES tamponu&nbsp; 1 L&nbsp'ye kadar damıtılmış su; 4 oC&nbsp; adresinde saklayın; 0,3x çalışma çözümünde kullanın</td></tr></tbody></table>

yaşayan zebra balığı embriyo hücre alt yapıları görüntüleme

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo görüntüleme, hücresel ve hücre altı yapıların dinamik davranışlarına doğal bağlamlarında benzeri görülmemiş bir erişim sağlar. Memeliler gibi daha yüksek omurgalılarda bu tür görüntüleme deneylerinin yapılması genellikle incelenen sisteme cerrahi erişim gerektirir. Embriyonik ve larva zebra balıklarının optik erişilebilirliği, bu tür invaziv prosedürlerin atlatılmasına izin verir ve sağlam organizmada görüntülemeye izin verir. Gerçekten de, zebra balığı artık çoğalmadan göçe ve farklılaşmaya kadar çok çeşitli gelişimsel bağlamlarda in vivo mikroskopi kullanarak dinamik hücresel davranışları görselleştirmek için iyi kurulmuş bir modeldir. Daha yeni bir gelişme, mitokondriyal kaçakçılık ve sentrozom dinamikleri dahil olmak üzere hücre altı olayları incelemek için zebra balığının artan kullanımıdır. Bu hücre altı yapıların floresan proteinler tarafından genetik olarak etiketlenebilmesinin göreceli kolaylığı ve bunları görüntülemek için ışık mikroskobu tekniklerinin kullanılması, zebra balığını in vivo bir hücre biyolojisi modeline dönüştürüyor. Burada, organelleri floresan olarak etiketleyen, mitokondri ve sentrozomları spesifik örnekler olarak vurgulayan genetik yapılar oluşturma yöntemlerini açıklıyoruz. Ekspresyonu belirli hücre tipleriyle sınırlamak ve geçici olarak eksprese eden ve stabil transgenik balıklar oluşturmak için protokoller sağlamak için iki parçalı Gal4-UAS sistemini birden fazla konfigürasyonda kullanıyoruz. Son olarak, hücre altı dinamiklerini görüntülemek için en uygun ışık mikroskobu yöntemlerini seçmek için yönergeler sunuyoruz.

Burada geniş alan ve görüntü mitokondri ve zebra balığı embriyolar yaşayan sentrozomlarda konfokal mikroskopi kullanımı doğrudan karşılaştırılır ve tezat olduğunu. incelenecek organel dinamiği olan hücrelerin bir konumda ve spesifik hücre içi olayların doğal frekansına bağlı olarak, genel olarak geniş bir alan veya konfokal mikroskopi ya daha iyi bir seçimdir. Bu embriyo yüzeyinde bulunan RB nöronlarda ve daha derin bulunduğu retina hücrelerinde organelleri görüntülenmiştir. Onların iki ...

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Bu görüntüleme yönteminin genel amacı, bir omurgalıda in vivo olarak hücre altı organelleri incelemektir. Bu yöntem, mitokondri veya sentrozomların in vivo bağlamdaki dinamikleri gibi nöronal hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tüm deneyin herhangi bir cerrahi işleme gerek kalmadan, sağlam bir omurgalı üzerinde gerçekleştirilebilmesidir.Bu yöntem, yalnızca fizyolojik koşullar altındaki hücre altı dinamikler hakkında bilgi sağlamakla kalmaz, aynı zamanda Alzheimer hastalığı gibi hastalık modellerinin çalışmalarına da uygulanabilir. Metin protokolüne uygun olarak, mikroenjeksiyon yoluyla geçici olarak ifade eden embriyolar oluşturulduktan veya stabil transgenik hatlardan embriyolar elde edildikten sonra, birinci günün sonunda ölü veya döllenmemiş yumurtalar için tarama yapın. Pigment oluşumunu önlemek için 1x PTU içeren Danieau çözeltisine canlı embriyoları plastik bir transfer pipeti kullanarak aktarın ve transgen ekspresyonu taramasına kadar embriyoları 1x PTU içeren Danieau çözeltisinde muhafaza edin.Görüntüleme deneyinin yapıldığı gün, anestezi altındaki embriyoları transgen ekspresyonu açısından taramak için bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanın. Ardından, seçilen embriyoları 1x PTU ve 1x trikayn içeren Danieau tamponu bulunan ayrı bir petri kabına aktarın. Embriyolar anestezi altına alındıktan sonra, agarozun seyrelmesini önlemek için mümkün olduğunca az sıvı aktararak, birkaç tanesini nazikçe 1x PTU ve 1x trikayn içeren düşük erime noktalı agarozun içine pipetleyin.Embriyoları az miktarda agaroz ile birlikte cam tabanlı bir petri kabına aktarın. Ardından, nispeten hızlı çalışarak, görüntülenecek yapıya bağlı olarak embriyoları istenen yönlendirmeye getirmek için pens kullanın. Embriyoların, örneğin retinanın veya bir Rohon-Beard nöronunun görüntülenmesi için yan tarafı düz gelecek şekilde uygun şekilde yönlendirilmesi gerekir.Hassas bir yönlendirme, en iyi görüntüleme kalitesini sağlayacak ve veri toplama hızını optimize edecektir. Agarozun katılaşması için en az 15 dakika bekledikten sonra, embriyoları kaplayacak şekilde 1x PTU ve 1x trikain içeren Danieau tamponu ekleyin. Geniş alan mikroskopisi gerçekleştirmek için, monte edilmiş balıkların bulunduğu bir kabı 28.5 °C'lik bir ısıtma odasında dengeledikten sonra, geniş alan mikroskobunun tablasına yerleştirin, ilgi çekici bir alan seçin ve mikroskop yazılımını açın.Aydınlatma (Illumination) sekmesi altında, ilgilenilen dalga boyu için doğru filtre setlerini tanımlamak üzere Yapılandırma (Configuration) ayarlarına tıklayın. Kamera (Camera) ayarları altında, uygun bir görüntü elde etmek için gereken pozlama süresini girin. Ardından, 40x ile 100x büyütme aralığında, en yüksek sayısal açıklığa sahip ve kromatik düzeltmeli, uzun çalışma mesafeli bir su daldırma konik objektif seçin.Bakış alanını seçmek için Canlı (Live) kısmına tıklayın. R-B nöronu durumunda, hücre gövdesinden çıkan akson gövdesinde veya periferik arbor içinde mitokondriyal transportu görüntüleyin. Ardından, ImageJ menüsünde dikdörtgen seçim düğmesine tıklayın ve bir ilgi bölgesi (ROI) tanımlayın.Ve micromanager penceresindeki ROI'ye tıklayın. Görüntüleme için ROI'yi seçtikten sonra, nöronal morfolojiyi YFP kanalında kaydetmek için Stop and Save'e tıklayın. Mitokondriyal transportu görüntülemek için Multi-D Acquisition'a tıklayın.Ardından, Çok Boyutlu Edinme (Multi-dimensional Acquisition) adlı pencerede, zaman noktası sayısını ve zaman noktaları arasındaki aralığı seçin. Çok Boyutlu Edinme penceresinde Kanallar (Channels) sekmesine tıklayın; görüntüleme için dalga boyunu ve pozlama süresini ekleyip tanımlayın. Dosyaların dizin yolunda belirtilen özel klasöre otomatik olarak kaydedilmesi için Görüntüleri Kaydet (Save images) seçeneğine tıklayın.Şimdi, zaman ayarlı görüntülemeyi başlatmak için sağ üst köşedeki Acquire seçeneğine tıklayın. Konfokal mikroskopi için, monte edilmiş embriyoları konfokal sahnesindeki 28.5 °C'lik bir ısıtma odasına yerleştirdikten sonra mikroskop yazılımını açın ve Trans Lamp veya Epi Lamp seçeneğine tıklayın. Ardından, mikroskobun okülerleri aracılığıyla, ilgi bölgesini belirlemek için sırasıyla iletim ışığını veya floresan ışığını kullanın.Kazanım (Acquisition) ayar penceresinde, görüntüleme için seçilen objektifin, mevcut objektiflerin açılır menüsünde görünen objektifle eşleştiğini doğrulayın. Ardından, Görüntü Kazanım Kontrol (Image Acquisition Control) penceresinde, boya listesi düğmesine tıklayın ve uygun floroforları seçin. Alternatif olarak, parametreleri manuel olarak ayarlamak için Işık Yolu ve Boyalar (Light Path and Dyes) düğmesine tıklayın.Edinim Ayarları penceresinde, görüntülenen yapıların en iyi şekilde çözümlenmesi için gerekli piksel boyutunu elde etmek amacıyla taranan görüntünün yakınlaştırma faktörünü ve boyut en-boy oranını ayarlayın. Nyquist örnekleme kriterlerine uymak için piksel boyutunu, objektifin teorik çözünürlüğünün yaklaşık yarısına ayarlayın. Edinilen bir görüntünün piksel boyutunu belirlemek için Görüntü Edinimi Kontrol penceresinde I düğmesine tıklayın.Ardından, tarama hızını mümkün olan en yüksek seviyeye ayarlayın. Sonra, Görüntüleme Kontrol penceresinde, gürültüyü azaltmak için Kalman çizgi ortalamasına tıklayın ve faktörü iki veya üç olarak ayarlayın. Spektrumları örtüşen floroforları görüntülemek için ardışık bir tarama modu seçmek üzere, Ardışık ve Çizgi seçeneklerine tıklayın.Ardından, ilgili lazer hatlarının güç çıkışını ayarlayın. Detektör ayarlarını her kanal için düzenlerken seçilen bölgeyi sürekli taramak için XY Repeat veya Focus x2 ya da Focus x4 seçeneğine tıklayın. Daha sonra, gri değerlerinin en yüksek dinamik aralığına sahip görüntüleri elde etmek için her kanalın HV, Gain ve Offset değerlerini ayarlayın.Şimdi, doygunluk altına düşmüş pikselleri mavi, aşırı doygun pikselleri ise kırmızı olarak tanımlayan ve her ikisinden de kaçınılması gereken bir arama tablosu üzerinden edinilen görüntüleri görselleştirmek için Control artı H tuşlarına basın. İlgili lazer hatlarının güç çıkışını ve dedektör ayarlarını yeniden değerlendirin. Görüntülenecek hacmin üst ve alt sınırlarını belirlemek için, Acquisition Setting kısmında üst sınırdayken End Set düğmesine tıklayın, ardından alt sınıra odaklanarak Start Set düğmesine basın.Objektifin Z çözünürlüğünü kontrol etmek için Görüntüleme Kontrolü'nde I sembolüne tıklayın. Ardından, söz konusu objektif için Z çözünürlüğünün yarısı kadar bir adım boyutu seçin. TimeScan alt penceresinde, görüntülenmesi planlanan hücre altı yapının dinamiklerine uygun bir zaman serisi oluşturmak için Z-yığınlarının alınacağı frekansı ve görüntülerin kaç kez alınacağını girin.Z-yığını ve zaman serisinin alınacağını onaylamak için Derinlik ve Zaman düğmelerine tıklayın. Son olarak, zaman ayarlı görüntüleri almaya başlamak için XY Zt düğmesine tıklayın. Görüntü alımı tamamlandıktan sonra, yazılım arayüzünde Seri Tamamlandı'ya tıklayın.Görüntüleri ve ilgili üst verileri kaydetmek için görüntüleri OIB formatında kaydedin. Bu şekil, geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanılarak embriyo yüzeyinde bulunan organelleri ve R-B nöronlarını göstermektedir. Burada, bir R-B nöronunun periferik arborundaki tek bir mitokondriyumun hareketini izlemek için geniş alan mikroskobunda zaman ayarlı görüntüleme kullanılmıştır.Konfokal görüntüleme önemli ölçüde daha yavaştır ve belirli hücre altı olayların dinamiklerinin olduğundan az tahmin edilmesine yol açabilir. Geniş alan mikroskopisi ile elde edilen retinal hücre görüntüleri, geniş bir doku hacminden gelen floresan sinyallerinin odak düzlemindeki ayrıntıları gizlemesi nedeniyle düşük kontrast sorunu yaşarlar. Burada, konfokal mikroskopinin optik kesit alma kapasitesi kontrastı belirgin şekilde artırır.Ekler, hücresel membranların ve mitokondrilerin işaretlendiği iç nükleer tabakanın bir bölgesinin detaylarını göstermektedir. Bir duyusal nöronun spesifik Gau-4 sürücüsü tarafından yönlendirilen, UAS-mito-CFP ve UAS MAY-FP enjeksiyonlarından kaynaklanan mozaik ekspresyon, döllenmeden iki ve üç gün sonraki bu R-B duyusal nöronunda görüldüğü gibi, bireysel hücrelerin günler boyunca takip edilmesine olanak tanır. Mitokondrilerin yanı sıra, sentrozomlar gibi diğer hücre altı organeller de floresanla işaretlenebilir.Bu örnekte, tek bir kesintisiz konstrüksiyon üzerindeki iki UAS kaseti, retinal hücrelerde sentrozom hedefli YFP ve membran hedefli cerulean ekspresyonunu sağlamıştır. Ek görseller M evresindeki bir hücreyi göstermektedir. Bu prosedürün tamamı; çiftleştirme, yumurta toplama, enjeksiyonlar ve nihayetinde döllenmeden üç veya dört gün sonra görüntüleme yapılmasıyla birlikte birkaç gün sürmektedir.Mikroskoptaki asıl görüntüleme deneyi birkaç dakika ile tüm bir gün arasında sürebilir. Bu prosedürün ardından, in-vivo dinamiklerini anlamak amacıyla mikrotübüller veya peroksizomlar gibi diğer organeller işaretlenebilir ve görüntülenebilir. PTU'nun karsinojen olduğunu ve bu prosedür gerçekleştirilirken eldiven giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

imaging-subcellular-structures-in-the-living-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu videoda, biz gelişmekte olan omurgalı beyin konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte canlı zebrafish embriyolar analiz edildiği bir yöntem gösteriyor. Bu, tek hücreli zebrafish embriyo enjekte ve daha sonra gelişmekte olan beyin montaj ve görüntü hangi yöntemi içerir.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Bu protokol zebrafish embriyolar yaşayan tek tek nöronların veya nöral krest hücreleri görüntüleme açıklar. Bu yöntem, floresan konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak cep davranışlar ve aktin lokalizasyonu incelemek için kullanılır.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

Erken embriyo şekli morfogenetik süreçleri anlamanın anahtarı, yüksek çözünürlükte görüntü hücrelerinin yeteneği. Biz burada tüm zebrafish embriyolar membran hedefli Yeşil Floresan Protein hücrelerin tek hücreler veya küçük kümeler etiketleme için kullanılan bir tekniktir açıklar.

Zebra balığı Beyin Etiketleme ve Görüntüleme Hücreleri

Larva Zebrafish serebrovasküler gelişme görüntüleme açıklanmıştır. 3D görüntüleme kolaylaştırmak ve kimyasal tedaviler kullanarak serebrovasküler gelişimini değiştirme teknikleri de verilmektedir.

Görüntüleme ve Embriyonik Zebra balığı Serebrovasküler Yapıların 3D İmar

Zebra balığı embriyolarının dokuya özel floresans yarı otomatik görüntüleme için bir protokol aşağıda tarif edilmiştir.

Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Burada anlatılan yöntemi fokal ve düzlemsel kaymasını düzeltmek için optik bölümlendirilmeleri ve güçlük basit stratejileri yürütebilecek diseksiyon mikroskobu bir floresan kullanılarak Zebra balığı embriyolarının organ gelişiminin time-lapse analiz sağlar.

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

Mitoz her canlı organizma için kritiktir ve kusurlar genellikle kansere ve gelişimsel bozukluklara yol açar. Araştırmacılar, bu görüntüleme protokolünü ve zebra balığını bir model sistem olarak kullanarak, canlı bir omurgalı organizmasında mitozu ve mitotik süreçler kusurlu olduğunda ortaya çıkan çok sayıda kusuru görselleştirebilirler.

Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme

Kirpikler geliştirme için uygun organogenesis hayati önem taşımaktadır. Bu iletişim kuralı etiket ve Zebra balığı siliyer hücreleri görselleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemini açıklar.

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

Bu protokol, erken evre zebrafit embriyoları belirli hücre popülasyonlarında hassas kolokalizasyon analizlerini sağlayarak, krobölümler üzerinde sıralı immünofluoresesans ve immünhistokimyasayı gösterir.

Cryosec, zebrafish embriyo üzerinde sıralı Immünofluorescence ve Immünhistokimya

Bu protokol, zebra balığının erken göz gelişiminin toto etiketlemesi ve çok boyutlu görüntülenmesi için bir yaklaşımı açıklar. Lazer tarama konfokal mikroskopisi kullanarak etiketleme, gömme ve dört boyutlu (4D) görüntülemeyi ve optik bardak morfogenezinin diseksiyon mekanizmaları için veri kümelerinin alımını optimize etmek için dikkat edilmesi gereken noktaları açıklıyoruz.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Erken zebra balığı embriyolarının bir ışık tabakası mikroskobu kullanılarak bozulmamış bir koryon içinde görüntülenmesi için bir örnek hazırlama stratejisi açıklanmaktadır. Embriyoların %70 epiboli ve tomurcuk aşamalarında koryon içinde edindiği farklı yönelimleri analiz eder ve ışık tabakası sistemini kullanarak embriyo boyunca hücresel ölçekte çözünürlük elde etmek için görüntüleme stratejilerini detaylandırır.

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri

Öğrenin, canlı zebra balığı embriyolarında mitokondri ve sentrozom gibi hücre alt yapılarının dinamiklerini görüntülemeyi. Bu yöntem, sinir hücresi biyolojisi ve hastalık modellerinde invivo çalışmalar için değerli bir araç sunar.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Daha fazla video keşfet