Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Bu görüntüleme yönteminin genel amacı, bir omurgalıda hücre altı organelleri in vivo olarak incelemektir. Bu yöntem, mitokondri dinamikleri veya in vivo bağlamda sentrozomlar gibi nöronal hücre biyolojisi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, deneyin tamamının sağlam bir omurgalıda, herhangi bir cerrahi işleme gerek kalmadan gerçekleştirilebilmesidir.

Bu yöntem sadece fizyolojik koşullar altında hücre altı dinamiklere ışık sağlamakla kalmaz, aynı zamanda Alzheimer hastalığı gibi tez modellerinin çalışmalarına da uygulanabilir. Mikroenjeksiyon ile geçici olarak eksprese eden embriyolar oluşturduktan veya metin protokolüne göre stabil transgenik hatlardan embriyolar elde ettikten sonra, birinci günün sonunda ölü veya döllenmemiş yumurtaları tarayın. Plastik bir transfer pipeti kullanarak, pigment oluşumunu önlemek için canlı embriyoları Danieau'nun 1x PTU içeren solüsyonuna aktarın ve embriyoları, transgen ekspresyonu taranana kadar Danieau'nun 1x PTU içeren solüsyonunda tutun.

Görüntüleme deneyinin yapıldığı gün, anestezi uygulanmış embriyoları transgen ekspresyonu açısından taramak için bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanın. Daha sonra seçilen embriyoları, Danieau'nun 1x PTU ve 1x tricaine içeren tamponunu içeren ayrı bir petri kabına aktarın. Embriyolar uyuşturulduktan sonra, agarozun seyreltilmesini önlemek için mümkün olduğunca az sıvı aktararak, 1x PTU ve 1x trikatin içeren düşük erime noktalı agarozun içine birkaçını nazikçe pipetleyin.

Embriyoları az miktarda agaroz ile cam tabanlı bir petri kabına aktarın. Daha sonra, nispeten hızlı çalışarak, görüntülenecek yapıya bağlı olarak embriyoları istenen yönde konumlandırmak için forseps kullanın. Embriyolar, örneğin retinayı veya bir Rohon-Beard nöronunu görüntülemek için yan tarafta düz bir şekilde yönlendirilmelidir.

Hassas bir yönlendirme, en iyi görüntüleme kalitesini sağlayacak ve edinme hızını optimize edecektir. Agarozun en az 15 dakika katılaşmasına izin verdikten sonra, embriyoları kaplamak için Danieau'nun tamponunu 1x PTU ve 1x trikain ile ekleyin. Geniş alan mikroskobu yapmak için, geniş alan mikroskobu sahnesinde, 28.5 derece Celsuis'de bir ısıtma odasında monte edilmiş bir balık tabağını dengeledikten ve bir ilgi alanı seçtikten sonra, mikroskop yazılımını açın.

Aydınlatma altında, ilgilenilen dalga boyu için doğru filtre setlerini tanımlamak için Yapılandırma ayarları'na tıklayın. Kamera ayarları altında, uygun bir görüntü elde etmek için gereken pozlama süresini girin. Ardından, 40x ila 100x büyütme arasında değişen, en yüksek sayısal açıklığa sahip ve kromatik olarak düzeltilmiş uzun bir çalışma mesafeli su daldırma konisi objektifi seçin.

Görüş alanını seçmek için Canlı'ya tıklayın. Bir R-B nöronu durumunda, hücre gövdesinden veya periferik çardakta yayılan kök aksonda mitokondriyal taşınmayı görüntüler. Ardından, ImageJ menüsünde dikdörtgen seçim düğmesine tıklayın ve bir ilgi alanı veya ROI tanımlayın.

Ve mikro yönetici penceresinde ROI'ye tıklayın. Görüntüleme için ROI'yi seçtikten sonra, YFP kanalındaki nöronal morfolojiyi kaydetmek için Durdur ve Kaydet'e tıklayın. Mitokondriyal taşımayı görüntülemek için Multi-D Edinimi'ne tıklayın.

Ardından, Çok Boyutlu Alım adlı pencerede, zaman noktalarının sayısını ve zaman noktaları arasındaki aralığı seçin. Çok Boyutlu Alım penceresinde, Kanallar'a tıklayın ve görüntüleme için dalga boyunu ve pozlama süresini ekleyin ve tanımlayın. Dizin rotasında belirtilen belirli klasördeki dosyaları otomatik olarak kaydetmek için Görüntüleri kaydet'e tıklayın.

Şimdi, hızlandırılmış görüntülemeyi başlatmak için sağ üst köşedeki Al'a tıklayın. Konfokal mikroskopi için, monte edilmiş embriyoları konfokal aşamada 28.5 santigrat derecede bir ısıtma odasına yerleştirdikten sonra, mikroskop yazılımını açın ve Trans Lamba veya Epi Lamba'ya tıklayın. Daha sonra, mikroskobun oküler aracılığıyla, ilgilenilen bölgeyi tanımlamak için sırasıyla iletilen veya floresan ışığı kullanın.

Edinme ayarı penceresinde, görüntüleme için seçilen reklam verme amacının, mevcut reklam verme amaçlarının açılır menüsünde görünen reklam verme amacıyla eşleştiğini doğrulayın. Ardından, Görüntü Edinme Kontrolü penceresinde, boya listesi düğmesine tıklayın ve uygun floroforları seçin. Alternatif olarak, parametreleri manuel olarak ayarlamak için Işık Yolu ve Boyalar düğmesine tıklayın.

Çekim Ayarı penceresinde, görüntülenen yapıları en iyi şekilde çözümlemek için gereken piksel boyutunu elde etmek için taranan görüntünün yakınlaştırma faktörünü ve boyut en boy oranını ayarlayın. Piksel boyutunu, hedefin teorik çözünürlüğünün yaklaşık yarısı olacak şekilde ayarlayın, böylece Nyquist'in örnekleme kriterlerini takip edin. Alınan bir görüntünün piksel boyutunu belirlemek için, Görüntü Edinme Kontrolü penceresinde I düğmesine tıklayın.

Ardından, tarama hızını mümkün olan en yüksek hıza ayarlayın. Ardından, Görüntü Edinme Kontrolü penceresinde, Kalman çizgi ortalamasına tıklayın ve gürültüyü azaltmak için iki veya üç faktörüne ayarlayın. Çakışan spektrumlara sahip floroforları görüntülemek için sıralı bir tarama modu seçmek için Sıralı ve Çizgi'ye tıklayın.

Ardından, ilgili lazer çizgilerinin güç çıkışını ayarlayın. Her kanal için dedektör ayarlarını yaparken seçilen bölgeyi sürekli olarak taramak için XY Tekrarla'ya veya Odak x2 veya Odak x4'e tıklayın. Ardından, en yüksek gri değer dinamik aralığına sahip görüntüler elde etmek için her kanal için HV, Gain ve Offset ayarlarını yapın.

Şimdi, elde edilen görüntüleri, her ikisinden de kaçınılması gereken mavi doygunluğa sahip pikselleri ve kırmızı aşırı doygun pikselleri tanımlayan bir arama tablosu aracılığıyla görselleştirmek için Control artı H'ye basın. İlgili lazer çizgilerinin güç çıkışını ve dedektör ayarlarını yeniden değerlendirin. Görüntülenecek birimin üst ve alt sınırlarını tanımlamak için, Edinme Ayarı'nda üst sınırdaki Ayarı Sonlandır düğmesine tıklayın ve ardından alt sınıra odaklanın ve Ayarı Başlat'a basın.

Objektifin Z çözünürlüğünü kontrol etmek için, Görüntü Alma Kontrolü'nde I sembolüne tıklayın. Ardından, verilen hedef için Z çözünürlüğünün yarısı kadar bir adım boyutu seçin. TimeScan alt penceresinde, görüntülenecek hücre altı yapının dinamiklerine uygun bir zaman serisi oluşturmak için Z yığınlarının alınması gereken sıklığı ve görüntülerin kaç kez alınması gerektiğini girin.

Z yığını ve zaman serisinin alınacağını onaylamak için Derinlik ve Zaman düğmelerine tıklayın. Son olarak, hızlandırılmış görüntüleri almaya başlamak için XY Zt düğmesine tıklayın. Görüntü alımından sonra, yazılım arayüzünde Seri Bitti'ye tıklayın.

Görüntüleri ve ilgili meta verileri kaydetmek için görüntüleri OIB formatında kaydedin. Bu şekil, geniş alanlar ve konfokal mikroskopi kullanılarak embriyonun yüzeyinde bulunan organelleri ve R-B nöronlarını göstermektedir. Burada, bir R-B nöronunun periferik çardakındaki tek bir mitokondriyumun hareketini izlemek için geniş alan mikroskobunda hızlandırılmış görüntüleme kullanıldı.

Konfokal görüntüleme önemli ölçüde daha yavaştır ve belirli hücre altı olayların dinamiklerinin hafife alınmasına yol açabilir. Geniş alan mikroskobu ile elde edilen retina hücrelerinin görüntüleri, büyük hacimli dokudan gelen floresan sinyalleri odak düzlemindeki ayrıntıları gizlediğinden, zayıf kontrasttan muzdariptir. Burada, konfokal mikroskobun optik kesitleme kabiliyeti kontrastı gözle görülür şekilde iyileştirir.

İç kısımlar, hücresel zarların ve mitokondrinin etiketlenmesiyle birlikte iç nükleer katmanın bir bölgesinin ayrıntılarını gösterir. Bir duyusal nöronun spesifik Gau-4 sürücüsü tarafından yönlendirilen UAS-mito-CFP ve UAS MAY-FP enjeksiyonlarından elde edilen mozaik ekspresyonu, bu R-B duyusal nöronda görüldüğü gibi, döllenmeden iki ve üç gün sonra tek tek hücrelerin günler boyunca izlenmesine izin verir. Mitokondriye ek olarak, sentrozomlar gibi diğer hücre altı organeller floresan olarak etiketlenebilir.

Bu örnekte, tek bir bitişik yapı üzerindeki iki UAS kaseti, retina hücrelerinde sentrozom hedefli YFP ve zar hedefli gök mavisi ekspresyonunu yönlendirdi. İç kısımlar, M fazındaki bir hücreyi gösterir. Tüm bu prosedür, çiftleşme, yumurta toplama, enjeksiyonlar ve son olarak döllenmeden üç veya dört gün sonra görüntülemeden birkaç gün gerektirir.

Mikroskop üzerindeki gerçek görüntüleme deneyi birkaç dakika ila bir gün sürebilir. Bu prosedürü takiben, mikrotübüller veya peroksizomlar gibi diğer organeller, in vivo dinamiklerini anlamak için etiketlenebilir ve görüntülenebilir. PTU'nun kanserojen olduğunu ve bu işlemi yaparken mutlaka eldiven giymek gibi önlemler alınması gerektiğini unutmayın.