Doku Mühendisliği Thermoresponsive Nanostructured Yüzeylerin Hazırlanması

Blok kopolimerler kullanılarak uygulanan bu Langmuir-Schaefer yönteminin temel amacı, hücre yapışma ve tutunma kuvvetini kontrol ederek, sıcaklığa duyarlı yüzeyin çeşitli koşulları altında hücre tabakaları üretmektir. Bu yöntem; biyouyumlu malzemeler, hücre kültürü yüzeyi ve biyoseparasyon gibi biyomalzemeler alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sıcaklığa duyarlı yüzey ile hücreler arasındaki etkileşimin kontrol edilebilmesi ve hücre tabakası geri kazanımı için modifikasyon koşullarının optimize edilebilmesidir.

Bu yöntem, hücre ve yüzey arasındaki etkileşime dair içgörü sağlayabilse de biyoseparasyon ve biyofilm gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Başlamak için, stiren, ECT ve ACVA'yı 40 mililitre 1, 4-Dioxane içinde çözün. Reaktif türleri uzaklaştırmak için çözeltiyi vakum altında, sıvı nitrojen içerisinde 15 ila 20 dakika boyunca dondurun.

Çözelti oda sıcaklığında kademeli olarak çözündükten sonra; dondurma, pompalama, çözündürme ve gaz giderme döngüsünü üç kez tekrarlayın. Bir yağ banyosunda 70 °C'de 15 saat boyunca polimerizasyon yaparak polistireni bir makro-RAFT ajanı olarak elde edin. Polistiren makro-RAFT ajanını 800 mL eter ile çöktürün ve vakum altında kurutun.

Ardından, IPAAm monomerini, polistiren makro-RAFT ajanını ve ACVA'yı dört mililitre 1, 4-Dioxane içerisinde çözün. Daha önce yapıldığı gibi, dondurma-pompalama-çözme gaz giderme döngülerini kullanarak çözeltideki oksijeni uzaklaştırın. Gaz giderme işleminden sonra, bir yağ banyosunda 70 °C'de 15 saat boyunca polimerizasyon gerçekleştirin.

Son olarak, sentezlenen St-IPAAm molekülünü polistiren makro-RAFT ajanı ile aynı yöntemle elde edin. Cam altlıkları bol miktarda aseton ve etanol ile yıkayın ve yüzey kirleticilerini temizlemek için beş dakika boyunca sonikasyon uygulayın. Altlıkları 65 °C sıcaklıktaki bir fırında 30 dakika boyunca kurutun.

Ardından, oda sıcaklığında substratların yüzeylerini aktive etmek için oksijen plazma kullanın. Substratı silanize etmek için substratları, %1 hexatrimethoxysilane içeren toluen içerisinde oda sıcaklığında gece boyunca bekletin. Daha sonra, silanize edilmiş substratları toluen ile yıkayın ve reaksiyona girmemiş ajanları uzaklaştırmak için 30 dakika boyunca aseton içerisinde bekletin.

Yüzeyi tamamen immobilize etmek için substratları 110 °C'de iki saat boyunca tavlayın. Son olarak, silanlanmış substratları hücre kültürü kaplarına uygun olacak şekilde bir cam kesici ile 25 mm x 24 mm boyutlarında kesin. Toz birikimini önlemek için Langmuir film düzeneğini bir kabin içine yerleştirin.

Kontaminantları uzaklaştırmak için Langmuir teknesini ve bariyerlerini distile su ve etanol ile yıkayın. Tekneyi ve bariyerleri tüy bırakmayan bir havlu ile silerek kurulayın. Ardından tekneyi yaklaşık 110 milliliters distile su ile doldurun ve bariyerleri teknenin her iki yanına yerleştirin.

Ardından, yüzey gerilimini izlemek için kullanılan bir platin Wilhelmy plakasını, plaka kırmızıya dönene kadar bir gaz brülörü ile ısıtın. Daha sonra kontaminantları temizlemek için plakayı distile su ile yıkayın. Wilhelmy plakasını, yüzey basıncı ölçüm cihazına bağlı bir tel yardımıyla asın.

Yüzey basıncı ölçüm cihazını üreticinin protokolüne göre sıfırlayın. Hava-su ara yüzeyini, polimer damlacıkları kalmayacak şekilde ara yüzey yaklaşık 50 santimetrekareye ulaşana kadar teknenin her iki yanındaki bariyerlerle sıkıştırın. Yüzey basıncı metre başına yaklaşık sıfır milinewton olana kadar tüm küçük kontaminantları aspire edin.

Her iki taraftaki bariyerleri yeniden konumlandırın ve azalan saf suyu tamamlamak için saf su ekleyin. Ardından, sentezlenen beş miligram St-IPAAm molekülünü beş mililitre kloroform geliştirme çözeltisinde çözün. Sonrasında, kloroformda çözünmüş 27 mikrolitre St-IPAAm'i bir mikroşırınga veya mikropipet kullanarak yavaşça tekneye damlatın.

Kloroformun tamamen buharlaşması için beş dakika bekledikten sonra, yüzeydeki St-IPAAm molekülünü sıkıştırmak için her iki bariyeri yatay olarak hareket ettirin. Bariyerlerin sıkıştırma hızını, 50 cm²'lik hedef alana ulaşana kadar 0.5 mm/s seviyesinde tutun. Sıkıştırma sırasında, üreticinin protokolüne uygun olarak, yüzey basıncı ölçüm cihazına bağlı platin Wilhelmy plakası ile Pi-A yüzey basıncı izotermlerini ölçün.

Hedef alan boyutuna ulaşıldıktan sonra, St-IPAAm moleküllerinin rahatlamasına izin vermek için yüzeyi beş dakika boyunca muhafaza edin. Moleküller, sıkıştırmanın hemen ardından dengeye ulaşmazlar. Ardından, filmi güçlü bir şekilde absorbe etmek için Langmuir filmini bir transfer aparatı kullanarak beş dakika boyunca hidrofobik olarak modifiye edilmiş bir cam substrata aktarın.

Hidrofobik cam altlığı cihaz üzerine paralel olarak sabitleyin. Cihazı bir hizalama tablasına bağlayın ve dik yönde hareket ettirin. Altlığı transfer aparatı ile yatay olarak kaldırın ve bir gün boyunca desikatörde kurutun.

Hücre süspansiyonlarını hazırlamak için, sığır karotis arteri endotel hücrelerini veya BAEC'leri, FBS ve Penisilin içeren DMEM ile doku kültürü polistiren üzerinde, 37 °C'de, %5CO2 ve %95 havada 1/3 konfluense kadar kültüre edin. Konfluense ulaşıldığında, BAEC'leri 37 °C'de, %5CO2 ve %95 havada üç dakika boyunca üç mililitre %0,25 tripsin EDTA ile işleme tabi tutun. %10FBS içeren 10 mililitre DMEM ekleyerek tripsin EDTA'yı inaktive edin.

Ve hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik konik bir tüpe toplayın. 120 ×g'de beş dakika santrifüj ettikten sonra, süpernatanı aspire edin ve hücreleri 10 mililitre DMEM içinde yeniden süspanse edin. Geri kazanılan hücreleri, tek kullanımlık bir hemositometre ile sayılan santimetrekare başına 10.000 hücre konsantrasyonunda St-IPAAm yüzeylerine ekin.

Yüzeylerdeki hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ve %95 hava içeren bir inkübatör donanımlı mikroskopla gözlemleyin. Ardından, St-IPAAm yüzeylerini bir temiz kabine (clean bench) entegre ultraviyole ışıkla sterilize edin. Adherent BAEC'lerin timelapse görüntülerini 37 °C'de, 10x büyütmeli bir faz-kontrast mikroskop kullanarak yaklaşık 24,5 saat boyunca kaydedin.

BAEC adezyonundan sonra, BAEC'lerin St-IPAAm yüzeyinden ayrılmasını 20 °C'de yaklaşık 3,5 saat boyunca kaydedin. Langmuir film transferli yüzeyde hücre adezyonu ve ayrılmasının optimizasyonunu takiben, önce BAEC'leri daha önce olduğu gibi kültüre ederek hücre tabakalarını oluşturun. St-IPAAm yüzeylerine santimetrekare başına toplam 100.000 hücre ekleyin.

Ve 37 °C'de %5 CO2 ortamında üç gün boyunca inkübe edin. Konfluent BAEC'ler 20 °C'de kendiliğinden ayrılmıştır. Sıcaklığa duyarlı Langmuir filmi aktarılmış yüzeyin hazırlanışı burada gösterilmektedir.

Sentezlenen St-IPAAm kloroform çözeltisi, hava-su ara yüzeyine yavaşça damlatıldı. Ara yüzeydeki St-IPAAm moleküllerini 50 santimetrekarelik bir hedef alana ulaşana kadar sıkıştırmak için iki bariyer kullanıldı. Langmuir filmindeki olası kusurları tespit etmek amacıyla sıkıştırma sırasında yüzey basıncı ölçüldü.

Sıkıştırma işleminin ardından, hidrofobik olarak modifiye edilmiş bir lamet cam substrat, bir hizalama tablası kullanılarak ara yüze yatay olarak yerleştirildi. Substrat yatay olarak kaldırıldı ve bir gün boyunca kurutuldu. Bu adımın ardından, St-IPAAm yüzeyler hücre kültürü deneylerinde kullanılmaya hazır hale geldi.

St-IPAAm yüzeylerinin atomik kuvvet mikroskopi topografik görüntülerine ait temsili sonuçlar burada gösterilmiştir. Her iki St-IPAAm yüzeyinde de nanoyapılar gözlemlenmiştir. Nanoyapıların boyutu ve şekli, AM'ye ve St-IPAAm bileşimine güçlü şekilde bağımlıydı.

Burada, St-IPAAm 480 ile molekül başına 40 kare nanometrelik bir AM'ye sahip Langmuir film transferli bir yüzey üzerinde geri kazanılmış bir hücre tabakasının makroskobik görüntüsü gösterilmektedir. Hücreler, 37 °C'de St-IPAAm 170 ve St-IPAAm 480 yüzeylerindeki üç günlük kültürden sonra konfluense ulaşmıştır. Hücre tabakası ise sıcaklığın 37'den 20 °C'ye düşürülmesinin ardından hızla geri kazanılmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra; polimerin moleküler kompozisyonunun nasıl tasarlanacağı, Langmuir filminin nasıl üretileceği ve transfer edileceği, hücre yapışması ve ayrılmasının nasıl kontrol edileceği ve hücre tabakasının nasıl geri kazanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, biyomalzemeler ve doku mühendisliği alanındaki araştırmacıların, hücreler ve yüzeyler arasındaki etkileşimleri ve dejeneratif tıp alanında kullanılacak hücre kültürü stratejilerini keşfetmelerine yol açmaktadır. Bu tekniğin uygulamaları, hastalardan temin edilen çeşitli hücre tiplerinden hücre tabakaları üretme potansiyeline sahip olması nedeniyle hücre transplantasyonu tedavilerine kadar uzanmaktadır.