Name: Bitkilerde FISH için uygun bir Hızlı Hava kuru Damlama Kromozom Hazırlama Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Öğrenin, sitogenetik ve genom araştırmaları için hızlı hava kurutmalı damlama yöntemiyle bitki kromozomları hazırlamayı. Bu teknik, FISH analizi için yüksek kaliteli metafaz yayınları sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mali destek için DFG'ye (HO 1779/21-1) ve teknik tavsiyeler için Katrin Kumke ve Dr. Veit Schubert'e (IPK, Gatersleben) minnetle teşekkür ederiz.

1. Kromozom Hazırlık <ol><li> Çimlenme ve kök uçları tespit <ol><li> 22-24 ° C&#39;de 2 gün boyunca, karanlık koşullar altında bir Petri kabı içinde nemli filtre kağıdı, iki katmanlar üzerinde 10-20 arpa tohumları filizlenmeye. Bir jilet kullanılarak tohum 1-2 cm uzunluğunda güçlü kökleri kesin. </li><li> Parçalanmış buz-su içine soğuk musluk suyu ihtiva eden 500 ml&#39;lik bir cam şişe yerleştirerek buz soğukluğunda su hazırlayın. Buz soğuk su havalandırmak ve metafaz hücrelerinin sıklığını artırmak için 20 saat boyunca kök ipuçları batırmayın. </li><li> 50 ml etanol, su kökleri transfer: asetik asit (3: 1) sabitleyici 2 gün oda sıcaklığında bunları düzeltmek için. Taze hazırlanmış etanol içerisinde mağazası kökleri: asetik asit (3: 1) ile 4 ° C &#39;de sabitleyici bir yıla kadar kullanana kadar. </li></ol></li><li> Yıkama ve enzim tedavisi <ol><li> 5 dk iki kez 50 ml&#39;lik bir cam beher kullanarak 30 ml buz gibi soğuk musluk suyu ile 10-20 kökleri yıkayın. Binoküler mikroskop kullanın. Içine birer kökleri tek Transferi30 mi, 0.01 M sitrat tampon maddesi (± 0.01 M sodyum sitrat, 0.01 M sitrik asit, pH 4.8) forseps kullanılarak iki kez 5 dakika boyunca bir cam beher çalkalayarak yıkayın. Tamamen sıvının ve kesme arzu edilmeyen olmayan meristematik doku bir ustura kullanılarak filtre kağıdına kökleri yerleştirin. </li><li> Bir saat cam bitki dokusunun yumuşatmak için yaklaşık 50 dakika boyunca (Tablo 1) 37 ° C &#39;de, 1 ml enzim karışımında 20 kök uçları kadar inkübe edin. Enzim karışımı, 0.01 M sitrat tampon maddesi içinde seyreltilmiş,% 0.7 Selülaz R10,% 0.7 selülaz,% 1 ve% 1 Pektoliaz cytohelicase içerir. -20 ° C&#39;de enzim karışımı saklayın ve beş kata kadar yeniden. </li><li> Pipetleme enzim çıkarın ve artık enzimin yerine iki kez 5 mi, 0.01 M sitrat tampon maddesi ile buz kök ipuçları yıkayın. </li></ol></li><li> Kök maserasyon <ol><li> Iki kez dikkatli bir şekilde aynı saat camı 1 ml% 96 ​​etanol ile yıkayın kök uçları. Taze hazırlanmış fiksatif (25% etanol% 75 asetik asit), etanol ile değiştirin. 10-15 kullanınKök ucu başına ul fiksatif. </li><li> Diseksiyon iğne veya forseps ile 2 ml tüp içine fiksatif ile birlikte Aktarım kök uçları ve parçalanmaya kök meristemleri. Bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücrelerin yeniden askıya almak için boru 20 kez vurun. İki ay -20 ° C hücre süspansiyonu saklayın. </li></ol></li><li> Hücre süspansiyonunun Damlama <ol><li> 50 ° C&#39;de bir sıcak plaka üzerinde su ile ıslatılmış kağıt dokusunun 2-3 katmanları yerleştirin. 30 dakika boyunca buzdolabında buz soğuk musluk suyu altında mikroskopik slaytlar bırakın. Ve bir yerde nemli kağıt mendil üstünde kayar. </li><li> Pipet 7-10 hücre süspansiyonu ul ve sıcak plaka üzerine yerleştirilir soğutulmuş slayt üzerine 20 cm mesafeden bırakın. Pipet 10 slayt hücre süspansiyonu aynı yerde asetik asit-etanol karışımı ul ve ek 2 dakika süreyle sıcak plaka slayt tutun. Islak doku olmadan sıcak plaka slayt yerleştirin ve 1 dakika boyunca kurumaya bırakın. </li></ol></li><li> Kalite kontrolü ve Saklamaslaytlar e <ol><li> Kromozom yayılması kalitesini kontrol etmek için bir faz-kontrast mikroskobu kullanarak slaytları edin. -20 ° C&#39;da bir Coplin kavanoz% 96 etanol içinde daldırarak aynı gün veya mağaza ya slaytlar kullanın. </li></ol></li><li> FISH önce slaytların Tedavi öncesi; Tüm adımlar, oda sıcaklığında yürütülür <ol><li> 2x SSC, 50 ml ihtiva eden bir Coplin kavanoza Slaytları 5 dakika boyunca (20x SSC 3 M NaCl ve 300 mM trisodyum sitrat içeren). 3-10 dakika için% 45 asetik asit 50 ml ihtiva eden bir Coplin kavanoza forseps, transfer slaytlar kullanılması. </li><li> Aktarım, 10 dakika boyunca 2 x SSC, 50 ml ihtiva eden bir Coplin kavanoza kayar. 10 dakika boyunca (2x SSC)% 4 formaldehit, 50 ml ihtiva eden bir Coplin kavanoza transfer slaytlar ve bırakın slaytlar kromozom düzeltmek için. </li><li> 50 ml 2x SSC içeren bir Coplin kavanoza, 4 dakika her biri için slaytlar 3 kez durulama formaldehit çıkarın. Dikey% 70 seri 2 dakika,% 90 ve% 100 etanol, sırasıyla, ve kuru, slaytlar için Coplin kavanoza slaytlar kurutmakpozisyon. </li></ol></li></ol> İn Situ Hibridizasyon 2. Floresan (FISH) <ol><li> Her bir slayt için deiyonize formamid 10 ul 4x hibritleme tamponu, 5 ul kullanılarak toplam 20 ul hibridizasyon solüsyonu hazırlamak (200 ul tampon 80 ul 20x SSC, 8 ul 1 M Tris-HCI pH 8.0, içeren 1.6 ul 0.5 M EDTA, 11,2 ul 10 ug / ml somon spermi ve 99,2 ul DNase içermeyen su), probun 3 ul DNase içermeyen su 2 ul. </li><li> 24 x 32 mm kapak kayma slayt ve kapak başına melezleme solüsyonu 20 ul ekleyin ve kauçuk çimento ile kapak kayma tutuklama. Sıcak bir plaka üzerinde 2 dakika boyunca 80 ° C&#39;de, aynı anda probları ile slaytlar denatüre. </li><li> Transferi nemli odasına slaytlar ve 37 ° CO / N kaçınarak ışık slaytlar kuluçkaya yatmaktadır. 2x SSC ile Coplin kavanoza slaytlar durulama kapak fişleri çıkarın. Ve 55-60 ° C 2x SSC içeren bir Coplin kavanoza yerleştirin slaytlar 20 dakika inkübe. </li><li> Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca bir Coplin kavanoza SSC 2x slaytlar yerleştirin. Sırasıyla,% 70,% 90 ve% 100 etanol içinde seri 2 dakika boyunca, bir Coplin kavanoza slaytlar kurutmak. </li><li> Yoğun ışık önlemek antifade montaj orta / ml 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindoline 1 ug (DAPI) ile slaytlar ve counterstain hava içinde kurutulur. </li></ol> 3. Mikroskobik Analizi ve Depolama <ol><li> Epifloresans mikroskop kullanılarak slaytlar analiz edin. Filtrenin seçimi prob etiketleme için kullanılan florokrom bağlıdır. Gerekirse, bir yıla kadar karanlık koşullarda 4 ° C&#39;de mağaza slaytlar. </li></ol>

<ol><li>Geber, G., Schweizer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+heterochromatin+differentiation+in+Sinapis+alba+%28Cruciferae%29+using+a+simple+air-drying+technique+for+producing+chromosome+spreads%5BTitle%5D)+AND+%22Pl+Syst+Evol%22%5BJournal%5D)">Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads.</a> Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).</li>
<li>Andras, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drop-spreading+technique+to+produce+cytoplasm-free+mitotic+preparations+from+plants+with+small+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes.</a> Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).</li>
<li>Rothfels, K. H., Siminovitch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+air-drying+technique+for+flattening+chromosomes+in+mammalian+cells+grown+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro.</a> Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).</li>
<li>Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+preparation+of+plant+chromosomes+for+high-resolution+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy.</a> Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).</li>
<li>Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+fluorescence+in+situ+hybridization+signal+detection+in+maize+using+directly+labeled+probes+produced+by+high+concentration+DNA+polymerase+nick+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation.</a> Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).</li>
<li>Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy+%27SteamDrop%27+method+for+high+quality+plant+chromosome+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">An easy 'SteamDrop' method for high quality plant chromosome preparation.</a> Mol. Cytogenet. 7, 21(2014).</li>
<li>Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+chromosome+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamics of chromosome spreading.</a> Am J Med Genet. 61 (4), 387-393 (1996).</li>
<li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synteny+between+Brachypodium+distachyon+and+Hordeum+vulgare+as+revealed+by+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH.</a> Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).</li>
<li>Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+painting+using+repetitive+DNA+sequences+as+probes+for+somatic+chromosome+identification+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).</li>
<li>Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+effective+cell+synchronization+in+plant-roots+by+hydroxyurea+and+amiprophos-methyl+or+colchicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine.</a> Genome. 36 (2), 387-390 (1993).</li>
<li>Kim, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+karyotyping+of+sorghum+by+in+situ+hybridization+of+landed+BACs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs.</a> Genome. 45 (2), 402-412 (2002).</li>
<li>Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+physical+mapping+with+barley+BAC+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">FISH physical mapping with barley BAC clones.</a> Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).</li>
<li>Aliyeva-Schnorr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+mapping+with+centromeric+BAC+contigs+shows+that+this+recombination-poor+region+comprises+more+than+half+of+barley+chromosome+3H%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H.</a> Plant J. 84, 385-394 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Kromozom, hazırlanışı deney ot familyasının (Poaceae) ait olan hububat genç kökleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Tüm analiz türler diploid genom sette 14 nispeten uzun mitotik metafaz kromozomları (11-15 mikron) ve büyük genom türlerinin (5,1-7,9 Sterlin) aittir. Çimlenmiş köklerinin uzunluğu meristematik doku maksimum elde etmek için en fazla 2 cm değildi. Bölünen hücrelerin eşitleme mitotik metafaz miktarı 10 yayılır geliştirilmiş bir 20 saat kadar buzlu su muamele ile eld...

In situ hibridizasyon (FISH) Floresan kromozom düzeyinde tek ve yüksek kopya dizilerinin fiziksel haritalama için etkili bir araçtır. Koşul, yüksek kaliteli kromozom yayılımlarının hazırlanmasıdır. Hayvan ve bitki hücreleri için aynı derecede uygun olacaktır genel kromozom hazırlama protokolü vardır. Bitki kromozomların hazırlanması nedeniyle farklı türlerin içinde sert hücre duvarı ve çeşitli sitoplazma kıvamına özellikle zordur. Bitki kromozom hazırlanması için olan uygun yöntemlerden biri de damla yayılan tekniği ve hava-kurutma tekniği 1,2 olarak bilinen olarak adlandırılan bir damla bir tekniktir. Bu yöntem ilk olarak, in vitro yetiştirilen memeli hücrelerinin 3 Rothfels ve Siminovitch tarafından 1958 yılında tanıtıldı. Daha sonra Martin ve ark. 4 ve Kato ve diğ. 5 bitkiler için bu yöntemi uyarlanmıştır. Daha yakın zamanlarda, adlı bir yöntem &#39;SteamDrop ve# 39; örtüşmeyen kromozom 6 hazırlanması için kullanılan su buharına geliştirildi. , Yüksek nem olumlu etkisi daha erken 7 gözlenmesine rağmen, &#39;SteamDrop&#39; yüksek kaliteli kromozom hazırlıkları 6 kontrollü bir iş akışı sağlar. Buhar tedavi muhtemelen kromozomal proteinler, bazı değişikliklere bağlı kromozomların gerilmesine neden olur. Tam metafaz yeterli sayıda tutma sonraki FISH deneyler için teknik uzmanlık gerektirir yayılır rağmen metafazlarda sonuçlanan kalitesi çok yüksektir. Burada tek ve yüksek kopya probları 5,8 FISH tespiti için uygun mitotik tahıl kromozom hazırlanması için bir protokol mevcut. Bu yöntem, Kato 50% -55% bağıl nem altında gerçekleştirilir 9 (Şekil 1) tarafından tarif havada kuru damlatma yöntemi geliştirilmiş bir varyantıdır. Bu protokol daha az sayıda içerenuygulaması kolay, verimli ve tekrarlanabilir hale yıkama adımları. Biz Hordeum vulgare H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum ve Secale cereale&#39;den için yüksek kaliteli kromozom yayılır ve FISH sonuçları elde bu protokolü kullanarak.

<table><tbody><tr><td>Sıcak Tabak</td><td>MEDAX GmbH</td><td>12603</td><td></td></tr><tr><td>Selülaz R10</td><td>Duchefa</td><td>C8001</td><td></td></tr><tr><td>Selülaz&nbsp;</td><td>CalBioChem</td><td>219466</td><td></td></tr><tr><td>Pektolyaz</td><td>Sigma</td><td>P3026</td><td></td></tr><tr><td>Sitohelikaz</td><td>Sigma</td><td>C8274</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-12-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>C3176</td><td>direkt florokrom ve nbsp;</td></tr><tr><td>Fluor488-5-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>C11397</td><td>direkt florokrom ve nbsp;</td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>Olympus BX61</td><td>BX61</td><td></td></tr><tr><td>CCD kamera</td><td>Orca ER, Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) & nbsp;</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1200</td><td>floresan boya</td></tr></tbody></table>

bitkilerde fish için uygun bir hızlı hava kuru damlama kromozom hazırlama yöntemi

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Kromozom yayılır hazırlanması floresan in situ hibridizasyon başarılı performansı (FISH) için bir ön koşuldur. Yüksek kaliteli bitki kromozom yayılır hazırlanması nedeniyle sert hücre duvarına zordur. Bitki kromozomlarına hazırlanması için onaylanmış yöntemlerden biri olarak adlandırılan bir damla hazırlanması da damla yayılan ya da hava-kurutma tekniği olarak bilinmektedir. Burada, mitotik kromozom hızlı hazırlanması için bir protokol tek ve yüksek kopya DNA probları BALIK tespiti için uygundur yayılır sunuyoruz. Bu yöntem, 50% -55% arasında bağıl nem altında gerçekleştirilen havada kuru damla yöntemin geliştirilmiş bir varyantıdır. Bu protokol, uygulama, kolay, verimli ve tekrarlanabilir hale yıkama aşamaları, daha az sayıda içerir. Bu yaklaşımın bariz faydaları başarılı FISH analizi için mükemmel bir önkoşul olarak hizmet veren iyi yayılmış, hasarsız ve çok sayıda metafaz kromozomları vardır. Bu protokolü kullanarak yüksek kaliteli chrom eldeosome yayılır ve Hordeum vulgare H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum ve Secale cereale&#39;den için tekrarlanabilir FISH sonuçları.

Mitotik metafaz yayılır mikroskopik slaytlar yukarıda tarif edilen hızlı bir havayla kurumaya bırakarak kromozom hazırlama metodu ile hazırlandı (Suppl. Şekil 1). FISH analizi, her iki, tekrarlayıcı ve tek kopyalı sekansları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Görüntüler mukabil fluorophores uyarım sağlayan bir filtre seti ile bir Epifloresans mikroskop ile elde edilen ve yüksek hassasiyetli CCD monokrom kamera tarafından ele geçirildi. Görüntü alımı için biz bir görüntü elde etme yazılımı ile bilgisayar...

Tek ve yüksek kopyalı DNA problarının FISH tespiti için uygun olan hızlı hava-kuru damlatma yöntemi ile yüksek kaliteli mitotik bitki kromozom yayılımlarının hazırlanması için bir protokol tanımlanmıştır.

Bitkilerde FISH için uygun bir Hızlı Hava kuru Damlama Kromozom Hazırlama Yöntemi

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Bu yöntemin genel amacı, tekli ve yüksek kopya sayılı DNA probları kullanılarak floresan in situ hibridizasyon tekniğine uygun bitki kromozomları hazırlamaktır. Bu yöntem; kromozom yeniden düzenlemelerinin tespiti, kromozomlar üzerindeki genetik markörlerin sıralanması ve farklı türler arasındaki karşılaştırmalı analizler gibi sitogenetik ve genom araştırmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedürün temel avantajı, kromozom yayılımı hazırlığının hızlı, kolay ve verimli hale gelmesidir.Hücre süspansiyonu -20 °C'de iki aya kadar saklanabilir ve ihtiyaç duyulduğunda kromozom hazırlığı için kullanılabilir. Bu yöntem fikri, uygun kromozomların kalitesinin ve sayısının insan günlerinde önemli ölçüde arttığını gözlemlediğimizde ortaya çıkmıştır. 10 ila 20 arpa tohumunu, bir Petri kabı içerisinde, nemli filtre kağıdının iki katmanı üzerinde, karanlık koşullarda 22 ila 24 °C'de iki gün boyunca çimlendirin. İki gün sonra, bir jilet kullanarak tohumdan 1 ila 2 cm uzunluğundaki sağlıklı kökleri kesin.Ardından, içinde soğuk musluk suyu bulunan 500 mililitrelik bir cam şişeyi kırılmış buzlu suya yerleştirerek buz gibi soğuk su hazırlayın. Metafaz evresindeki hücrelerin sıklığını artırmak için buz gibi soğuk suyu havalandırın ve kök uçlarını 20 saat boyunca burada bekletin. Fiksasyon işlemini gerçekleştirmek için kökleri sudan 50 mililitrelik etanol asetik asit fiksatifine aktarın ve fiksasyondan sonra iki gün boyunca oda sıcaklığında bekletin.10 ila 20 adet kökü, 50 mililitrelik cam bir beher içinde 30 mililitre buz gibi soğuk musluk suyu ile beşer dakikadan iki kez yıkayın. Kökleri pens yardımıyla tek tek 30 mililitre sitrat tamponuna aktarın. Cam beheri beşer dakika boyunca iki kez sallayarak kökleri yıkayın.Ardından, sıvıları tamamen uzaklaştırmak için kökleri bir mikroskop altında filtre kağıdı üzerine yerleştirin. İstenmeyen meristematik olmayan dokuları bir jilet kullanarak kesin. Bu prosedürün en kritik adımı, farklı türler arasında değişiklik gösterebilen uygun sindirim süresini belirlemektir.Burada 20 adede kadar kök ucu, bir mililitre enzim karışımı içerisinde 37 °C'de yaklaşık 50 dakika boyunca inkübe edilir. Mikroskop altında bir saat camı içindeki bitki dokusunu yumuşatmak için, enzimi pipetleme yoluyla uzaklaştırın ve kalıntı enzimi değiştirmek için kök uçlarını buz üzerinde beş mililitre 0,01 molar sitrat tamponu ile yıkayın. Kök uçlarını aynı saat camı içerisinde iki kez dikkatlice bir mililitre %96 etanol ile yıkamaya devam edin.Ardından, her bir kök ucu için etanolü 10 ila 15 µL taze hazırlanmış sabitleyici ile değiştirin. Kök uçlarını sabitleyici ile birlikte iki mililitrelik bir tüpe aktarın ve kök saplarını bir diseksiyon iğnesi veya penset yardımıyla parçalayın. Hücreleri yeniden süspande etmek ve bir hücre süspansiyonu elde etmek için tüpe 20 kez hafifçe vurun.Ardından, 50 °C'ye ayarlanmış bir ısıtıcı tabla üzerine suyla ıslatılmış iki ila üç kat mendil yerleştirin. Mikroskobik lamları, buzdolabındaki buz gibi soğuk musluk suyuna 30 dakika boyunca daldırın. Daha sonra lamları nemli mendilin üzerine yerleştirin, 7 ila 10 µL hücre süspansiyonu çekin ve bunu ısıtıcı tabla üzerindeki soğutulmuş lama 20 cm mesafeden damlatın.Slayttaki hücre süspansiyonunun üzerine aynı noktaya 10 µL asetik asit etanol karışımı ekleyin ve slaytı sıcak plakada tutun. İki dakika sonra, slaytı ıslak doku olmadan sıcak plakaya yerleştirin ve bir dakika daha kurumaya bırakın. Kromozom yayılımının kalitesini kontrol etmek için slaytları bir faz kontrast mikroskobu kullanarak inceleyin.Lamları ya aynı gün kullanın ya da lamları sabitleme öncesi ön işlemden geçirmek için bir Coplin kavanozu içinde %96 Ethanol'e daldırarak -20 °C'de saklayın. Lamları bir pens yardımıyla, 50 mL 2X SSC içeren bir Coplin kavanozuna beş dakika boyunca yerleştirin. Lamları, 50 mL %45 asetik asit içeren bir Coplin kavanozuna üç ila 10 dakika boyunca aktarın.Ardından, lamları 50 mililitre 2X SSC içeren bir coplin kavanozuna aktarıp 10 dakika bekletin. Daha sonra lamları 50 mililitre %4 formaldehit içeren bir coplin kavanozuna aktarın ve kromozomları sabitlemek için lamları 10 dakika boyunca daldırın. Lamları, 50 mililitre 2X SSC içeren bir coplin kavanozunda her biri dört dakika sürecek şekilde üç kez durulayarak formaldehiti uzaklaştırın.Ardından lamları %70, %90 ve %100'lük etanol serisinde iki dakika boyunca dehidre edin ve lamları dikey konumda kurutun. Her bir lam için; 10 µL deiyonize formamid, 5 µL 4X hibridizasyon tamponu, 3 µL prob ve 2 µL DNase-free water kullanarak 20 µL'lik bir hibridizasyon çözeltisi hazırlayın. Her lama 20 µL hibridizasyon çözeltisi ekleyin ve 24 by 32 mm'lik bir lamel ile kapatın.Kapak camını kauçuk çimento ile mühürledikten sonra, problu lamları bir sıcak plakada 80 °C'de iki dakika boyunca eş zamanlı olarak denatüre edin, ardından lamları nemli bir hazneye aktarın ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Işıktan kaçınarak, lamları 2X SSC içeren bir yıkama kabında durulayarak kapak camlarını çıkarın. Daha sonra lamları 55 ila 60 °C'de 2X SSC içeren bir kaba yerleştirin ve 20 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, lamları oda sıcaklığında iki dakika boyunca bir coplan kavanozu içindeki iki XSSC'ye yerleştirin. Lamları %70, %90 ve %100'lük etanol serisinde, bir coplan kavanozu içerisinde iki dakika boyuncaye dehydrate edin. Lamları havada kurutun ve yoğun ışıktan kaçınarak dappy'de Antifa montaj ortamı ile karşı boyama yapın.Lamları bir epi floresan mikroskop kullanarak analiz edin. Gerektiğinde, filtrenin seçimi prob etiketleme için kullanılan fluorokroma bağlıdır. Lamları dört degrees Celsius'te, karanlık koşullar altında bir yıla kadar saklayın.Hızlı hava ile kurutma damlatma kromozom hazırlama yöntemiyle hazırlanan mitotik metafaz yayılımları burada gösterilmiştir. FISH analizi, hem tekrarlayan hem de tek kopya diziler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Görüntüler, ilgili floroforların uyarılmasını sağlayan bir filtre seti ile epi-floresan mikroskop kullanılarak elde edilmiş ve yüksek hassasiyetli bir CCD monokrom kamera ile yakalanmıştır.Tek kopya prob ve beş S-R-D-N-A kullanılarak hoard ve vulgari'nin mitotik metafaz kromozomları üzerinde yapılan FISH deneyi, belirgin ve yüksek kaliteli sinyaller ortaya çıkarmıştır. hordy ve BULBUS kromozomları üzerinde CT CTT 10 mikrosatellit hibritlemesi, spesifik ve belirgin bir patern ile sonuçlanmıştır. PSC 119 iki prob kullanılarak sala serial'in mitotik metafaz kromozomları üzerinde yapılan FISH deneyi, spesifik ve yüksek kaliteli sinyallerle sonuçlanmıştır.Bu yaklaşımın belirgin faydaları; başarılı balık analizleri için mükemmel bir ön koşul olan, iyi yayılmış, hasarsız ve çok sayıda metafaz kromozomudur. Uzmanlaşıldığında, bu prosedür uygun şekilde yürütüldüğü takdirde iki saatten kısa sürede tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, balık IDE ve formeri için yüksek kaliteli mitotik metafaz kromozom yayması hazırlamanın nasıl yapıldığına dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız; formaldehit son derece tehlikeli olabilir, bu prosedürleri gerçekleştirirken daima gözlük ve çeker ocak kullanın.

a-fast-air-dry-dropping-chromosome-preparation-method-suitable-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Floresan<em&gt; In situ</emSivrisinekler ve Mitotik Kromozomlar üzerinde&gt; Hibridizasyon

Bu makalede, zebra balığı kuyruk klipsinden DNA ekstraksiyonu açıklanmaktadır. Protokol, zebra balığı genotiplerini analiz etmek için hızlı ve verimli bir yöntem göstermektedir.

Kuyruk Klibinden DNA Ekstraksiyonu: Zebra Balığı Genotiplemesinde Kullanılan Bir Yöntem

Buradaki materyal testis germ hücrelerinin üç boyutlu kromatin yapısını korumak için geliştirilen bir yöntemi açıklamaktadır. Bu, üç boyutlu (3D) slayt yöntemi olarak ad verilmiştir. Bu yöntem subnükleer yapıların tespiti için hassasiyeti artırır ve immünoresans, DNA ve RNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) için geçerlidir.

Testis Germ Hücrelerinin Üç Boyutlu Kromatin Mimarisini Korumak için Slayt Hazırlama Yöntemi

Kromozom boyama, hücre çekirdeğinin organizasyonunu ve karyotipin evrimini incelemek için yararlı bir yöntemdir. Burada, daha sonra iki ve üç boyutlu floresan in situ hibridizasyon (FISH) için kullanılan tek politen kromozomlarından belirli ilgi alanlarını izole etmek ve güçlendirmek için bir yaklaşım sergiliyoruz.

Sıtma Sivrisineklerinde 2D ve 3D Kromozom Boyama

Zebra balığı son kullanılan bir vivo içinde modeli sistemi olarak DNA çoğaltma zamanlaması geliştirme sırasında çalışmaya. İşte Zebra balığı embriyo profili çoğaltma zamanlaması için kullanarak iletişim kurallarını ayrıntılı. Bu iletişim kuralı kolayca çoğaltma zamanlaması mutantlar, tek hücre türleri, hastalık modelleri ve diğer türler çalışmaya adapte edilebilir.

Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma

Birden çok chimeric floresan füzyon protein geleneksel yöntemlerle zorlukları aşmak tesislerinde ortak ifade etmek için yeni bir yöntem geliştirdik. Kaset protein ortak ifade ulaşmak için ifade birden çok fonksiyonel olarak bağımsız protein içeren bir tek ifade plazmid kullanarak yararlanır.

Bitkilerde etkin bir şekilde birden fazla Chimeric floresan Fusion proteinlerin ortak ifade

Burada CRISPR/Cas9 genom nakavt elektrikli balık üretimi ve arkası için bir protokol sunulmuştur. Ayrıntılı olarak özetlenen bir gymnotiform ve mormyrid hem de gerekli moleküler biyoloji, Üreme ve hayvancılık gereksinimleri ve cas9 indel F0 larvaları üretmek için enjeksiyon teknikleri vardır.

Kıvılcım Susturma: CRISPR/Cas9 Zayıf Elektrikli Balıklarda Genom Düzenleme

Nükleer yüzey spreadleri, kekozis sırasında kromozom olaylarını incelemek için vazgeçilmez bir araçtır. Burada zebrabalığı spermatositlerinden profaz I sırasında meyotik kromozomları hazırlamak ve görselleştirmek için bir yöntem göstermek.

Zebrabalığı Spermatositlerinden Meiotik Kromozom Spreadlerinin Hazırlanması

Bu yazıda, bozulmamış zebra balığı embriyolarında normal ve anormal sitozin metilasyonunun hızlı ve verimli spatiotemporal izlenmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Bozulmamış Zebra Balığı Embriyolarında Normal ve Anormal Sitozin Metilasyonunun Hızlı ve Verimli Mekansal Zamansal İzlenmesi

CRISPR-Cas teknolojileri, genom düzenleme alanında devrim yarattı. Bununla birlikte, istenen germline düzenlemesini bulmak ve izole etmek büyük bir darboğaz olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, bu protokol, standart PCR, kısıtlama sindirimi ve jel elektroforezi tekniklerini kullanarak germline düzenlemeleri için F0 CRISPR enjekte edilen zebra balığı spermini hızlı bir şekilde taramak için sağlam bir yöntem açıklamaktadır.

Zebra balıklarında germline düzenlemelerinin hızlı izolasyonu için sperm taraması

Bu protokol, granüloza hücrelerinden yoksun zebra balıklarında temiz evre I oositlerin hızlı bir şekilde izole edilmesi için modifiye edilmiş bir prosedürü tanımlar ve böylece oosite özgü araştırmalar için uygun bir yöntem sağlar.

Granüloza hücrelerinden yoksun zebra balıklarında evre I oositlerin hızlı izolasyonu

Öğrenin, sitogenetik ve genom araştırmaları için hızlı hava kurutmalı damlama yöntemiyle bitki kromozomları hazırlamayı. Bu teknik, FISH analizi için yüksek kaliteli metafaz yayınları sağlar.

Bitkilerde FISH için uygun bir Hızlı Hava kuru Damlama Kromozom Hazırlama Yöntemi

Daha fazla video keşfet