Bitkilerde FISH için uygun bir Hızlı Hava kuru Damlama Kromozom Hazırlama Yöntemi

Bu yöntemin genel amacı, tek ve yüksek kopya DNA probları kullanılarak C iki hibridizasyon tekniğinde floresansa uygun bitki kromozomlarının hazırlanmasıdır. Bu yöntem, kromozom yeniden düzenlemelerinin tespiti, kromozomlar üzerindeki genetik belirteçlerin sıralanması ve farklı türler arasında karşılaştırmalı analiz gibi sitogenetik ve genom araştırmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedürün ana avantajı, kromozom yayılımlarının hazırlanmasının hızlı, kolay ve verimli hale gelmesidir.

Hücre süspansiyonu eksi 20 derecede iki aya kadar saklanabilir ve gerektiğinde kromozom hazırlığı için kullanılabilir. Bu yöntemle ilgili fikrimiz ilk olarak, insan günlerinde uygun kromozomların kalitesinin ve sayısının dramatik bir şekilde arttığını gözlemlediğimizde aklımıza geldi: 10 ila 20 arpa tohumunu bir Petri kabında iki kat nemli filtre kağıdına çimlendirin, karanlık koşullarda, iki gün sonra 22 ila 24 santigrat derecede iki gün boyunca. Bir tıraş bıçağı kullanarak tohumdan bir ila iki santimetre uzunluğundaki kuvvetli kökleri kesin.

Daha sonra, kırılmış buzlu suyun içine soğuk musluk suyu içeren 500 mililitrelik bir cam şişe koyarak buz gibi soğuk su hazırlayın. Buz gibi soğuk suyu havalandırın ve metafaz hücrelerinin sıklığını artırmak için kök uçlarını 20 saat daldırın. Kökleri sudan 50 mililitre etanol asetik asit fiksatifine aktarın ve fiksasyondan sonra iki gün boyunca oda sıcaklığında sabitleyin.

10 ila 20 kökü 30 mililitre buz gibi musluk suyuyla 50 mililitrelik bir cam hoparlörde beş dakika boyunca iki kez yıkayın. Forseps kullanarak kökleri tek tek 30 mililitre sitrat tamponuna aktarın. Cam hoparlörü iki kez beş dakika sallayarak kökleri yıkayın.

Ardından, sıvıyı mikroskop altında tamamen çıkarmak için kökleri filtre kağıdına yerleştirin. İstenmeyen meristematik olmayan dokuyu bir tıraş bıçağı kullanarak kesin. Bu prosedürün en kritik adımı, farklı türler arasında değişebilen uygun sindirim süresini belirlemektir.

Burada 20'ye kadar kök ucu, bir mililitre enzim karışımında 37 santigrat derecede yaklaşık 50 dakika inkübe edilir. Mikroskop altında bir saat camındaki bitki dokusunu yumuşatmak için, enzimi pipetleyerek çıkarın ve kalan enzimi değiştirmek için kök uçlarını beş mililitre 0.01 molar sitrat tamponu ile buz üzerinde yıkayın. Kök uçlarını bir mililitre %96 etanol ile aynı saat camında iki kez dikkatlice yıkamaya devam edin.

Daha sonra etanolü kök ucu başına 10 ila 15 mikrolitre taze hazırlanmış fiksatif ile değiştirin. Kök uçlarını fiksatif ile birlikte iki mililitrelik bir tüpe aktarın ve kök mar saplarını bir diseksiyon iğnesi veya forseps ile parçalayın. Hücreleri yeniden askıya almak ve bir hücre süspansiyonu elde etmek için tüpe 20 kez dokunun.

Ardından, iki ila üç kat suya batırılmış kağıt mendili 50 santigrat derecede sıcak bir tabağa yerleştirin. Mikroskobik slaytları 30 dakika boyunca buzdolabında buza, soğuk musluk suyuna batırın. Daha sonra slaytları nemli kağıt mendilin üzerine yerleştirin, yedi ila 10 mikrolitre hücre süspansiyonu pipetleyin ve 20 santimetre mesafeden sıcak plaka üzerine yerleştirilen soğutulmuş slaytın üzerine bırakın.

Bunu, slayt üzerindeki hücre süspansiyonu ile aynı yerde 10 mikrolitre asetik asit etanol karışımı ile takip edin ve slaytı sıcak plaka üzerinde tutun. İki dakika sonra, slaytı ıslak mendil olmadan sıcak plakaya yerleştirin ve bir dakika daha kurumasını bekleyin. Kromozom yayılımının kalitesini kontrol etmek için bir yüz kontrast mikroskobu kullanarak slaytları kontrol edin.

Slaytları aynı gün kullanın veya slaytları balıktan önce ön işleme tabi tutmak için eksi 20 santigrat derecede bir coplin kavanozunda% 96 Etanole batırarak saklayın. Slaytları forseps kullanarak beş dakika boyunca 50 mililitre iki XSSC içeren bir copin kavanozuna yerleştirin. Slaytları üç ila 10 dakika boyunca 50 mililitre% 45 asetik asit içeren bir coplan kavanozuna aktarın.

Ardından, slaytları 10 dakika boyunca 50 mililitre iki XSSC içeren bir coplan kavanozuna aktarın. Daha sonra slaytları 50 mililitre% 4 formaldehit içeren bir coplin kavanozuna aktarın ve kromozomları sabitlemek için slaytları 10 dakika daldırın. Slaytları 50 mililitre iki XSSC içeren bir coplin kavanozunda her biri dört dakika boyunca üç kez durulayarak formaldehiti çıkarın.

Daha sonra slaytları %70 %90 ve %100 etanol serisinde iki dakika kurutun ve slaytları dikey konumda kurutun. Her slayt için, 10 mikrolitre deiyonize form amid, beş mikrolitre dört X hibridizasyon tamponu, üç mikrolitre prob ve iki mikrolitre D ns serbest su kullanarak 20 mikrolitrelik bir hibridizasyon çözeltisi hazırlayın. Slayt başına 20 mikrolitre hibridizasyon çözeltisi ekleyin ve 24 x 32 milimetrelik bir kapak kayması ile örtün.

Kapak kızağını kauçuk çimento ile kapattıktan sonra, denatüre slaytları problarla aynı anda 80 santigrat derecede iki dakika boyunca sıcak bir plaka üzerinde tutun, slaytları nemli bir odaya aktarın ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Işıktan kaçınarak, kızakları iki XSSC ile bir bağlantı kavanozunda durulayarak kapak kızaklarını çıkarın. Daha sonra slaytları 55 ila 60 santigrat derece, iki XSSC içeren bir coplan kavanozuna koyun ve 20 dakika inkübe edin.

Ardından, slaytları oda sıcaklığında iki dakika boyunca bir coplan kavanozuna iki XSSC içine yerleştirin. Emin. Slaytları bir coplan kavanozunda %70 %90 ve %100 etanol serisinde iki dakika kurutun. Hava. Slaytları kurutun ve yoğun ışıktan kaçınarak Antifa montaj ortamında dappy ile lekeleyin.

Slaytları bir epi floresan mikroskobu kullanarak analiz edin. Filtre seçimi, gerekirse prob etiketlemesi için kullanılan florokroma bağlıdır. Slaytları karanlık koşullarda dört santigrat derecede bir yıla kadar saklayın.

Hızlı hava ile kuruyan damlatma kromozom hazırlama yöntemi ile hazırlanan mitotik metafaz yayılımları burada gösterilmiştir. Balık analizi hem tekrarlı hem de tek kopya dizileri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Görüntüler, karşılık gelen floro dörtlüsünün uyarılmasını sağlayan bir dizi filtreye sahip bir epi floresan mikroskobu ile elde edildi ve yüksek hassasiyetli bir CCD monokrom kamera tarafından yakalandı.

İstif ve vulgarilerin mitotik metafaz kromozomları üzerinde tek kopya prob ve beş S-R-D-N-A kullanılarak yapılan balık deneyi, farklı ve yüksek kaliteli sinyaller ortaya çıkardı. CT CTT 10 mikrosatellitinin hordy ve BULBUS kromozomları üzerinde hibridizasyonu, spesifik ve belirgin bir model ile sonuçlandı. Sala serisinin mitotik metafaz kromozomları üzerinde PSC 119 iki prob kullanılarak yapılan balık deneyi, spesifik ve yüksek kaliteli sinyallerle sonuçlandı.

Bu yaklaşımın bariz faydaları, iyi yayılmış, hasarsız ve başarılı balık analizi için mükemmel bir ön koşul olarak hizmet eden çok sayıda metafaz kromozomudur. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedür uygun şekilde yapılırsa iki saatten daha kısa sürede yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, balık IDE ve eski için yüksek kaliteli mitotik meta yüz kromozom alanı çekiminin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız, bu prosedürleri gerçekleştirirken her zaman grafik ve film başlığı kullanmak son derece tehlikeli olabilir.