Kök hücre benzeri

Bu protokolün genel amacı, in vitro ve in vivo ortamda nöral gelişimin altında yatan moleküler mekanizmaları ve hücresel süreçleri test etmek için x laevis blastosöl tavanı veya animal cap eksplantlarını kullanmaktır. Bu yöntemler; kader kazanımı, hücre göçü ve nöral hücrelerin hücreye özgü (otonom) ve hücre dışı (non-otonom) özellikleri hakkında gelişimsel ve kök hücre biyolojisi alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Sunulan teknikler, temel nöral hücre davranışlarının temel mekanizmalarını keşfetmek için basit, ucuz, çok yönlü ve verimli araçlar sağlamaktadır.

Bu analizler, yeniden programlanmış indüklenmiş pluripotent kök hücreler için nöral kader belirleyicilerinin ve nöral türevli hücre hatlarının olgun oluşumunun daha ileri düzey taramalarının test edilmesine olanak tanır. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, tekniklerin manuel beceri gerektirmesi nedeniyle zorlanacaklardır. Bu yöntemlere ilişkin fikri ilk kez hücre ayrışma davranışını analiz etmeyi düşündüğümde geliştirdim.

Bir xenopus laevis anterior nöral tüpünü düz monte etmek için, fikse edilmiş,yüksek derecede su kaybına uğratılmış ve ardından tekrar hidrate edilmiş bir embriyoyu, ağzına kadar PBT ile doldurulmuş 60 milimetrelik bir petri kabına plastik transfer pipeti kullanarak aktarın. Ardından, optik sap seviyesindeki gözler ve nöral tüp arasına bir çift ince pens yerleştirerek gözleri ayırın. Daha sonra, başın arkasında nöral tüpün üzerindeki ektodermin altına pinsi dikkatlice yerleştirin ve ektodermi dikkatlice soyun.

Uygun NC2 hibridizasyon etiketlemesi yapıldıktan sonra embriyoyu PBT ile doldurulmuş yeni bir 60 mililitrelik petri kabına aktarın ve ince pensler kullanarak ön nöral tüpü embriyodan kaba bir şekilde izole edin. Ardından, nöral tüpün altındaki gevşekçe tutunmuş notokordu dikkatlice çıkarın. Gerekiyorsa, otik vezikülleri ve mezodermin kalan kısımlarını da çıkarın.

Tüm nöral tüp apandisleri kesildiğinde, anterior nöral tüpü embriyodan ayırın. Ardından, izole edilen nöral tüpü, 4 °C'de gece boyunca muhafaza etmek üzere %50 gliserol ve PBS ile doldurulmuş 1,5 ml'lik konik bir tüpe aktarın. %90 gliserol içerisinde ikinci bir gece boyu işlemin ardından, nöral tüpü az miktarda gliserol ile bir mikroskop lamına aktarın ve nöral tüpleri dorsal ve ventral orta hatlar boyunca diseke etmek için Tungsten iğneler kullanın.

Ardından, nöral tüpün iki tarafını %90 gliserol ve PBS içerisine yerleştirmek için lamelle kapatılmış destek halkaları kullanın. Hayvan şapkası eksplantının indüksiyonu için boncuk hazırlamak amacıyla, BSA ile işlem görmüş reçine boncuklarının yarım alikotunu bir P200 mikropipet yardımıyla yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. Daha sonra, yeni tüpteki steril distile suyu, ilgilenilen deneysel molekülü içeren 200 mikrolitre ortam ile değiştirin ve dört santigrat derecede iki saat boyunca bekletin.

İnkübasyonun sonunda, blastula veya çok erken gastrula embriyolarını, 0.2%BSA ile takviye edilmiş kalsiyum ve magnezyum içeren PBS'ye aktarın. Ardından, bir stereo mikroskop altında, vitellin membranı bir pens setinin yan tarafıyla sıkıştırın ve ikinci bir pens kullanarak, embriyonun animal tarafına zarar vermemeye dikkat ederek membranı vegetal taraftan yavaşça soyun. Sonra, ince uçlu bir pens kullanarak her embriyonun animal polünden küçük bir kare şeklinde parça kesin.

BSA kaplı bir pipet ucu kullanarak, kapsülleri 0.5X modifiye Barth tuzlu çözeltisi içinde bir Terasaki çok kuyucuklu plağın ayrı kuyucuklarına, pigmentli hayvan tarafı kuyucuğun yuvarlak tabanına temas edecek şekilde aktarın. Bir P20 mikropipet kullanarak, işlem tüpündeki en koyu pembe boncukları seçin ve her bir kapsülün üzerine bir boncuk yerleştirin; boncukları kapsüllerin merkezine konumlandırmak için pens kullanın. Son boncuk yerleştirildiğinde, plağı suyla ıslatılmış kağıtların üzerine koyun ve inkübasyon öncesinde plağı plastik bir kapla kapatın.

Disosiye edilmiş ve yeniden agrege edilmiş hayvan şapkası eksplantları hazırlamak için, az önce gösterildiği gibi 15 ila 30 hayvan şapkası izole edin. Hayvan kutuplarından küçük bir kare doku kesmek için ince pensler kullanın. Hayvan şapkalarını, pigmentli tarafları yukarı bakacak şekilde, kalsiyumsuz Holtfreter salini ile doldurulmuş agaroz kaplı bir kuyuya aktarın.

Birkaç dakika sonra disagrega gerçekleşmelidir. Pigmentli tabakaları dokunun geri kalanından ayırmak için ince pens kullanın. Ardından, pigmenti uzaklaştırmak için P20 mikropipet kullanın.

Pigmentli katmanların çoğu uzaklaştırıldığında ve hücreler tamamen ayrıştığında, hücreleri merkezlemek için plakayı dairesel şekilde sallayın ve hücrelere dokunmamaya dikkat ederek bir P1000 mikropipet yardımıyla ortamın mümkün olduğunca fazlasını uzaklaştırın. Ardından, kuyucuğa bir mililitre kalsiyumlu Holtfreter salini ekleyin. Ayrıştırılmış hayvan kaplarını 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Hücreleri santrifüjle çöktürdükten sonra, süpernatantı dikkatlice uzaklaştırmak için bir P1000 mikropipet kullanın ve peleti 20 µL kalsiyumlu Holtfreter salin çözeltisi içinde yeniden süspande edin. Hücrelerin oda sıcaklığında üç ila altı saat boyunca yeniden kümeleşmesine izin verin. Ardından, eksplantları tüpün tabanından dikkatlice ayırmak için yavaşça 1 mL 3/4 NAM ekleyin ve eksplantları kaplamasız ayrı plaklara dağıtmak için plastik bir transfer pipeti kullanın.

Hayvan şapka eksplantlarını xenopus laevis nöral plaklarına nakletmek için öncelikle, küçük delikler açılmış %3 agaroza ve 3/4 NAM ile kaplanmış 60 milimetrelik petri kaplarını hazırlayın. Ardından, vitellin membranının uzaklaştırılması için erken nörola embriyolarını, kalsiyum ve magnezyum ile desteklenmiş %0,2 BSA içeren PBS içerisine aktarın. Daha sonra, agaroz kaplı diseksiyon kabını taze 3/4 NAM ile doldurun ve embriyoları sırt tarafları yukarı bakacak şekilde diseksiyon kabına aktarın.

Şimdi, pipet ucu NAM yüzeyini geçtiğinde eksplantın yerçekimiyle yavaşça kaba çökmesine izin vererek, yeniden agregasyon yapılmış bir animal cap eksplantını diseksiyon plakasına transfer edin. Ardından bir stereo mikroskop altında, Tungsten iğne ile nöral plaka üzerinde eksplant için bir insizyon yaparken embriyoyu sabit tutmak için küt uçlu pens kullanın. Küt uçlu pens ve kaş bıçağı kullanarak, yeniden agregasyon yapılmış animal cap eksplantından küçük bir parça kesin.

Greft için bir eksplant parçasını boyutlandırmak amacıyla doku fragmanını kullanın. Bu şekil, tüm mount çift NC2 hibridizasyonundan sonra evre 30, 32 ve 35'teki X laevis ve X tropicalis anterior nöral tüplerinin az önce gösterildiği gibi düzleştirilmiş montajlarını göstermektedir. Bu görüntülerde gözlemlendiği üzere, xenopus sonic hedgehog ekspresyonu, sonic hedgehog geninin end terminusu ile desteklenmiş kondisyonlu ortamda bekletilen boncuklarla temas halindeki hücrelerde tespit edilirken, kontrol ortamı ile işlem görmüş boncuklarla temas halindeki hücrelerde tespit edilmemiştir.

Az önce gösterildiği gibi disosiasyon ve reaggregasyon işlemlerinden sonra, anteriorize edilmiş hayvan şapka hücreleri içeren bu eksplantlar, Otx2 eksprese eden anteriorize edilmiş hayvan şapka hücreleri ile karıştırılmıştır. Gözlemlendiği üzere, Otx2 eksprese eden bu hücreler, Otx2 eksprese etmeyen hücrelerden ayrışmamıştır. Her iki hücre tipi de eksplant boyunca serbestçe birbirine karışmıştır.

Buna karşılık, Otx2 eksprese eden hücrelerin BAR HL-2, Otx2 ve IRX3 eksprese eden hücrelerle karıştırıldığı eksplantlarda, çoklu gen eksprese eden hücreler, yeniden agregasyon geçirmiş eksplant içinde homojen bir şekilde yayılmayan kohezif yamalar oluşturmuştur. Az önce gösterildiği gibi x laevis embriyolarının ön nöral plakasına greftlendiğinde, BAR HL-2, Otx2 ve IRX3'ü ko-eksprese eden hücrelerden oluşan ve N-terminus sonic hedgehog eksprese eden hücrelerle karıştırılmış karma eksplantlar, endojen sonic hedgehog ekspresyonu sergilemiş ve ön nöral epitel hücrelerinden ayrışmıştır. Öte yandan, Otx2 ve N-terminus sonic hedgehog eksprese eden hücrelerden oluşan karma eksplantlar x laevis nöral plağına greftlendiğinde, greftlenen hücreler ne sonic hedgehog eksprese etmiş ne de komşularından ayrışmıştır.

Uzmanlaşıldığında, hayvan şapka eksplantının embriyonik nöral plakalara greftlenmesi, greftlenen embriyo sayısına bağlı olarak iki ila üç saatte gerçekleştirilebilir. Bu, oldukça sağlam ve oldukça verimli bir tekniktir. Bu prosedürü uygularken, bakteriyel ve fungal kontaminasyon konusunda son derece dikkatli olmak önemlidir.

Aşılam prosedürlerinin ardından, aşılanan hücrelerin kaderlerini ve davranışlarını takip etmek için bütün mount in situ hibridizasyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Nöral tüp organogenezinin altında yatan gelişimsel programlar, özellikle omurgalılarda büyük ölçüde korunmuştur. Bu nedenle, amfibilerde elde edilen bilgiler, omurgalı gelişiminin temelindeki hücresel ve moleküler süreçlere dair anlayışımızı geliştirmiştir.